汛期前后不同土地利用類型河流浮游細(xì)菌組成及功能預(yù)測(cè)：以清潩河(許昌段)為例

王革林，谷立坤，于魯冀，劉萌碩，魯浩天，范鵬宇，王 莉*

1.鄭州大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 450000

2.河南工程學(xué)院，河南 鄭州 450000

3.鄭州大學(xué)綜合設(shè)計(jì)研究院有限公司，河南 鄭州 450000

浮游細(xì)菌是水生態(tài)系統(tǒng)的主要組成部分，具有種類豐富、功能多樣和環(huán)境響應(yīng)靈敏等特點(diǎn)[1-2]，可通過(guò)同化、異化等代謝過(guò)程影響生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)、污染物質(zhì)釋放等地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程[3-5]，是提高河流水環(huán)境自凈能力和河流生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)能力的關(guān)鍵因素[6].浮游細(xì)菌空間格局的形成，受空間異質(zhì)性和河流連通度的影響，河流生態(tài)系統(tǒng)水位的變化(包括汛期)改變了河流連通度，進(jìn)而造成浮游細(xì)菌多樣性和功能的差異[7-9].汛期時(shí)，強(qiáng)降雨將外源污染物帶入河流，引起水體營(yíng)養(yǎng)鹽的變化，影響浮游細(xì)菌群落的組成[10].細(xì)菌的隨流輸運(yùn)能力受河流連通度的影響，水位較高時(shí)，河道連通度增大，進(jìn)而影響細(xì)菌群落空間構(gòu)成.此外，人類活動(dòng)和土地利用方式的改變也是影響浮游細(xì)菌空間差異的主要原因[11].土地利用類型的變化直接反映了人類活動(dòng)對(duì)河流水質(zhì)和水生態(tài)的重要影響力[12].不同利用類型的土地以各自的方式影響著地表水的傳輸(阻滯或加速)，進(jìn)而影響污染物從陸地到地表水的傳遞[13].改變后的地表水將形成一種與原始環(huán)境不同的河流生境，產(chǎn)生基于水生生物對(duì)新形成環(huán)境適應(yīng)性的生物篩選，構(gòu)成不同的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu).

為了適應(yīng)不同類型的棲息地，微生物經(jīng)常會(huì)形成一些特定的結(jié)構(gòu)和功能去應(yīng)對(duì)不同的環(huán)境壓力[14].已有研究表明，降雨徑流污染是城市景觀水體氮磷等營(yíng)養(yǎng)鹽的主要來(lái)源之一[15]，降雨會(huì)將土壤中積累的營(yíng)養(yǎng)鹽帶入水體，也會(huì)引起水體水文和水動(dòng)力學(xué)特征的變化，造成浮游細(xì)菌群落變化[16].鄉(xiāng)村區(qū)和城鎮(zhèn)區(qū)人類活動(dòng)強(qiáng)度和土地利用方式的差異也是造成河流細(xì)菌空間異質(zhì)性的主要原因[11]，在重金屬含量較高的城鎮(zhèn)區(qū)和農(nóng)業(yè)區(qū)河段，微生物多樣性較低，在陸源污染輸入較少的居民區(qū)和清潔區(qū)，微生物多樣性差異性較小[17]，β-變形菌和δ-變形菌在清潔區(qū)豐度顯著高于工業(yè)區(qū)和農(nóng)業(yè)區(qū)[18]，α-變形菌和γ-變形菌的豐度在工業(yè)區(qū)和居民區(qū)最高.因此，了解汛期前后不同土地利用類型浮游細(xì)菌群落組成變化和功能差異，對(duì)于識(shí)別水域浮游細(xì)菌在生態(tài)系統(tǒng)中的功能和作用，治理和保護(hù)水生態(tài)環(huán)境具有深遠(yuǎn)的意義.

本研究以清潩河流域?yàn)檠芯繉?duì)象，依據(jù)周邊環(huán)境及水生態(tài)環(huán)境功能分區(qū)將流域劃分為不同土地利用類型的河段，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了汛期前后不同土地利用類型河段內(nèi)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，并基于PICRUSt2 進(jìn)行了浮游細(xì)菌功能基因預(yù)測(cè)，尤其是氮循環(huán)功能基因.結(jié)合水環(huán)境理化指標(biāo)，進(jìn)一步探討了引起浮游細(xì)菌群落組成和功能變化的環(huán)境因子，以期為不同土地利用類型河流水環(huán)境保護(hù)提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)分布及樣本采集

本研究以河南省清潩河流域?yàn)閷?duì)象，依據(jù)趙雪霞等[19]在清潩河流域(許昌段)的水生態(tài)環(huán)境功能分區(qū)體系，綜合考慮自然地理因素(地貌、河流自然狀況)和人為因素(水資源利用狀況、水環(huán)境污染狀況和土地資源利用狀況)，將研究區(qū)域劃分為4 個(gè)不同土地利用類型的河段，分別為清潔區(qū)(clear water area，CW)、城鎮(zhèn)區(qū)(urban area，UW)、鄉(xiāng)村區(qū)(village area，VW)和農(nóng)業(yè)區(qū)(agricutural area，AW)，如圖1 所示.在清潩河流域共選取32 個(gè)采樣點(diǎn)，其中C1～C4位于清潩河干流上游，C1點(diǎn)位為增福廟水庫(kù)，C2～C4為水庫(kù)下游，兩側(cè)人類干擾較少，劃分為清潔區(qū)；U1～U14流經(jīng)長(zhǎng)葛市，人口密度大，有工業(yè)企業(yè)存在，劃分為城鎮(zhèn)區(qū)；V1～V6位于清潩河二級(jí)支流灞陵河，流經(jīng)多為村莊，河岸兩側(cè)有生活污水排放口存在，劃分為鄉(xiāng)村區(qū)；A1～A8位于清潩河一級(jí)支流小泥河，兩岸多為農(nóng)田，無(wú)排污口影響，劃分為農(nóng)業(yè)區(qū).

圖1 研究區(qū)采樣點(diǎn)的分布Fig.1 Distribution of sampling points in the study area

每年7-9 月為清潩河汛期，本研究樣品采集工作于汛期前(2021 年6 月) 和汛期后(2021 年10 月)進(jìn)行.大部分采樣點(diǎn)河段水深不超過(guò)4 m，使用有機(jī)玻璃采水器采集水面下0.5～1.0 m 處水樣于玻璃采樣瓶?jī)?nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存于4 ℃冰箱內(nèi)，并在48 h 內(nèi)完成理化指標(biāo)的檢測(cè).量取600 mL 水樣經(jīng)20 μm 篩絹預(yù)過(guò)濾，除去大型浮游植物和浮游動(dòng)物，預(yù)過(guò)濾后的水樣經(jīng)0.22 μm 無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾，用以收集浮游細(xì)菌，將濾膜剪碎置于50 mL 無(wú)菌離心管中.在干冰保存狀態(tài)下送往廣州美格基因科技有限公司進(jìn)行微生物檢測(cè).

1.2 理化指標(biāo)檢測(cè)方法

將采集的水樣在實(shí)驗(yàn)室過(guò)濾后，依據(jù)《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》測(cè)定其理化性質(zhì).溶解氧(DO)濃度和水溫(WT) 采用便攜式水質(zhì)監(jiān)測(cè)儀(HACH-DS5，哈希，美國(guó))測(cè)定；pH 和氧化還原電位(ORP) 采用pH 計(jì)(HI-8424，哈納，意大利) 測(cè)定；電導(dǎo)率(EC)采用便攜式電導(dǎo)率儀(S7-Meter，梅特勒托利多，美國(guó))測(cè)定；總氮(TN)濃度采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法測(cè)定；總磷(TP)濃度采用過(guò)硫酸鉀消解鉬銻鈧比色法測(cè)定；氨氮(NH4+-N)濃度采用納氏試劑分光光度法測(cè)定；亞硝態(tài)氮(NO2--N)濃度采用N-乙二胺分光光度法測(cè)定；硝態(tài)氮(NO3--N)濃度采用酚二磺酸法測(cè)定；化學(xué)需氧量(CODCr)采用重鉻酸鉀法測(cè)定.

1.3 高通量測(cè)序分析

使用DNA 提取試劑盒對(duì)濾膜進(jìn)行基因組DNA抽提后，采用微量紫外分光光度計(jì)(NanoDop?ND-1000，Wilmington，DE，美國(guó))測(cè)定提取到的DNA 濃度和純度.將合格的樣品送往廣州美格基因科技有限公司，通過(guò)MiSeq 300(Illumina Inc，San Diego，CA，美國(guó))測(cè)序儀完成高通量測(cè)序，結(jié)果以FASTQ 文件格式儲(chǔ)存.使用fastq 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，而后使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接[18].使用Qiime2 流程在基于默認(rèn)參數(shù)上對(duì)質(zhì)控拼接之后的序列降噪處理[19].按最小樣本序列進(jìn)行抽平，再參照Sliva 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)(v 138)，使用Qiime2 中的Naive bayes 對(duì)ASVs 進(jìn)行物種分類分析.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

理化指標(biāo)分析：由于各組樣品理化指標(biāo)數(shù)據(jù)無(wú)法同時(shí)滿足正態(tài)分布和方差齊性，故使用 Schirer-Ray-Hare非參檢驗(yàn)法進(jìn)行水質(zhì)數(shù)據(jù)分析[20]，單因素或多因素ANOVA 用于探討樣點(diǎn)間環(huán)境因子和浮游細(xì)菌多樣性的差異.

生物指標(biāo)分析：通過(guò)R 軟件的“vegan”包計(jì)算浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的α多樣性，分別以Chao 指數(shù)和Shannon-Wiener 指數(shù)表示細(xì)菌的豐度和多樣性.在美格基因云平臺(tái)(http://cloud.magigene.com) 進(jìn)行物種組成分析和β多樣性分析并繪圖.使用LefSe 在線工具分析各組之間顯著性差異的生物標(biāo)志物，進(jìn)一步分析各組細(xì)菌豐富度差異[21].使用SPSS 軟件對(duì)細(xì)菌和環(huán)境因子做Spearman 相關(guān)性分析，所得結(jié)果在Origin內(nèi)以熱圖的形式呈現(xiàn).使用PICRUSt2 軟件將16S rRNA序列與參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)細(xì)菌代謝功能，并結(jié)合16S rRNA 基因拷貝數(shù)差異和原始ASV 表格的物種豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，提高豐度預(yù)測(cè)可靠性[22].

2 結(jié)果與分析

2.1 河流水質(zhì)理化性質(zhì)

汛期前后清潩河理化指標(biāo)Schirer-Ray-Hare 檢驗(yàn)結(jié)果如表1 所示.研究發(fā)現(xiàn)，汛期前，河流TN 濃度整體的平均值為(7.57±2.40) mg/L，超GB 3838-2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》Ⅲ類標(biāo)準(zhǔn)限值5.0～10.0 倍；VW 區(qū)NH4+-N 濃度最高(3.19 mg/L)，達(dá)到劣Ⅴ類標(biāo)準(zhǔn).汛期后，UW、VW 和AW 區(qū)TN 濃度幾乎不發(fā)生變化，NH4+-N 濃度達(dá)到Ⅴ類標(biāo)準(zhǔn)；NO3--N 和NO2--N濃度大于汛期前，且NO3--N 在人類干擾較大的UW、VW 和AW 區(qū)增加量高于CW 區(qū).

表1 不同時(shí)期清潩河流域水體理化指標(biāo)Table 1 Physical and chemical indexes of Qingyihe River Basin at different periods

2.2 浮游細(xì)菌多樣性和豐度分布特征

汛期前后各區(qū)域河段Chao 指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)的變化情況如圖2 所示.汛期前，受人類干擾較強(qiáng)的AW、UW 和VW 區(qū)Chao 指數(shù)及Shannon-Wiener指數(shù)均顯著(P＜0.05)高于CW 區(qū).汛期后，Chao 指數(shù)和Shannon-Wiener 指數(shù)均表現(xiàn)出AW 區(qū)＞VW 區(qū)＞CW區(qū)＞UW 區(qū)的特征，與汛期前相比，Chao 指數(shù)和Shannon-Wiener 指數(shù)均有所下降，其中UW 區(qū)下降最多，CW 區(qū)下降最少.

圖2 不同區(qū)域多樣性指數(shù)分析Fig.2 Diversity index analysis chart

在ASV 水平上對(duì)汛期前后各區(qū)域采樣點(diǎn)位的浮游細(xì)菌進(jìn)行PCoA 分析，結(jié)果(見(jiàn)圖3) 顯示，PCoA1軸解釋度為29.9%，PCoA2 軸解釋度為15.4%.沿PCoA1 軸方向CW 區(qū)與其他三區(qū)有明顯區(qū)分，且汛期前后UW、VW 和AW 區(qū)的差別明顯.沿PCoA2 軸方向CW 區(qū)汛期前和汛期后區(qū)分明顯，汛期前，VW和UW 區(qū)顯著區(qū)分，與AW 區(qū)重疊；汛期后，VW、UW 和AW 區(qū)重疊，說(shuō)明汛期對(duì)有人類干擾的UW、VW 和AW 區(qū)浮游細(xì)菌群落差異作用大于土地利用類型的影響.

2.3 浮游細(xì)菌群落組成與差異

2.3.1 群落組成特征

2.3.1.1 優(yōu)勢(shì)菌組成特征

高通量測(cè)序結(jié)果〔見(jiàn)圖4(a)〕表明，汛期前后四區(qū)域浮游細(xì)菌主要有變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)等12 個(gè)菌門(mén)組成，占總菌門(mén)的98%以上.變形菌門(mén)是UW、VW 和AW 區(qū)的第1 優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，相對(duì)豐度在51.8%～54.7%之間，遠(yuǎn)高于CW 區(qū)的35.5%.放線菌門(mén)是CW 區(qū)的第1 優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，相對(duì)豐度為46.9%，其他三區(qū)放線菌門(mén)的相對(duì)豐度僅在16.1%～22.9%之間；擬桿菌門(mén)是UW 區(qū)的第2 優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，是其他三區(qū)的第3 優(yōu)勢(shì)菌門(mén)；UW 區(qū)綠彎菌門(mén)和酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度均高于其他三區(qū).汛期后浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)相對(duì)豐度有所增加，而裝甲菌門(mén)(Armatimonadetes)的相對(duì)豐度下降，硝化螺菌門(mén)(Acidobacteria)的相對(duì)豐度在各區(qū)表現(xiàn)為UW 區(qū)＞VW區(qū)＞AW 區(qū)＞CW 區(qū).

圖4 不同區(qū)域河流浮游細(xì)菌群落組成Fig.4 Composition of river bacterioplankton community in different regions

對(duì)汛期前后各區(qū)域豐度排名前28 位的優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4(b)所示.優(yōu)勢(shì)菌屬主要為hgcI_clade、Limnohabitans、Acinetobacter、CL500-29_marine_group、Flavobacterium等，在各區(qū)域中占總菌群豐度的52.2%～81.5%.相對(duì)于UW、VW 和AW 區(qū)，CW 區(qū)表現(xiàn)出較高的hgcI_clade和CL500-29_marine_group相對(duì)豐度，且汛期后大于汛期前；而UW、VW 和AW 區(qū)Limnohabitans和Acinetobacter 的相對(duì)豐度大于CW 區(qū)，且汛期后Limnohabitans在UW 區(qū)增加最多.汛期后Acidibacter、Flavobacterium和Nitrospira的相對(duì)豐度大于汛期前.

2.3.1.2 致病菌分布特征

根據(jù)世界衛(wèi)生組織《飲用水質(zhì)量準(zhǔn)則》(第四版)[23]中飲用水中致病微生物列表，篩選出對(duì)人類具有致病作用的優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5 所示.汛期前，河流主要致病菌屬為Acinetobacter、Flavobacterium和Pseudomonas，在CW 和UW 區(qū)的相對(duì)豐度約是VW 和AW 區(qū)的5 倍，且Acinetobacter的相對(duì)豐度占CW 和UW 區(qū)總致病菌屬的86%以上，F(xiàn)lavobacterium的相對(duì)豐度占VW 和AW 區(qū)總致病菌屬的33%～60%.汛期后，CW 和UW 區(qū)致病菌屬的相對(duì)豐度下降明顯，VW 和AW 區(qū)致病菌屬的相對(duì)豐度略有增加；河流主要致病菌屬為Flavobacterium和Acinetobacter，且Flavobacterium的相對(duì)豐度占UW和VW 區(qū)總致病菌屬的80% 以上，Acinetobacter的相對(duì)豐度占AW 區(qū)總致病菌屬的64.1%.

圖5 汛期前后不同區(qū)域河流致病菌屬相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of fluvial pathogens in different regions before and after flood season

2.3.2 群落差異分析

通過(guò)LEfSe 工具計(jì)算汛期前后各區(qū)域中的差異菌屬，所有菌在門(mén)綱目科屬水平的差異信息用餅形圖表示[24-25].如圖6 所示，汛期前后浮游細(xì)菌群落共有18 個(gè)菌門(mén)存在顯著差異，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(LDA≥4.0)僅有放線菌門(mén)、Patescibacteria、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)和疣微菌門(mén)等8 個(gè)菌門(mén).汛期前優(yōu)勢(shì)菌門(mén)中，AW 區(qū)的擬桿菌門(mén)、CW 區(qū)的放線菌門(mén)、VW 區(qū)的疣微菌門(mén)和藍(lán)藻門(mén)與其他區(qū)域存在顯著性差異；汛期后優(yōu)勢(shì)菌門(mén)中，僅有UW 區(qū)的酸桿菌門(mén)、CW 區(qū)的浮霉菌門(mén)和疣微菌門(mén)與其他區(qū)域有顯著性差異(P＜0.05).

圖6 不同樣品間差異的季節(jié)分布Fig.6 Different seasonal distribution among different samples

在屬水平上，汛期前，CW 區(qū)有10 個(gè)菌屬與其他區(qū)域存在顯著性差異(P＜0.05)，其中α-變形菌的Sphingorhabdus、Sphingomonas和Hyphomonas，厚壁菌門(mén)的Chryseomicrobium和Exiguobacterium，擬桿菌門(mén)的Sphingobacterium和Candidatus_Aquirestis為優(yōu)勢(shì)屬(LDA≥4.0)；UW 區(qū)有17 個(gè)屬存在顯著性差異，其中α-變形菌的Rhodobacter和Magnetospirillum，δ-變形菌的Oligoflexus，γ-變形菌的Azospira、Acinetobacter和Pseudomonas，酸桿菌門(mén)的Pseudarthrobacter，嗜熱絲菌門(mén)的Caldisericum，疣微菌門(mén)的Terrimicrobium和Luteolibacter為優(yōu)勢(shì)菌屬；VW 區(qū)共有16 個(gè)屬存在顯著性差異，其中α-變形菌的Novosphingobium，γ-變形菌的GKS98_freshwater_group和Sphaerotilus，藍(lán)藻菌門(mén)的Cyanobium_PCC_6307，疣微菌門(mén)的Brevifollis為優(yōu)勢(shì)菌屬；AW 區(qū)有11 個(gè)屬于存在顯著性差異，其中擬桿菌門(mén)的Cloacibacterium，變形菌門(mén)的Polynucleobacter和C39為優(yōu)勢(shì)菌屬.汛期后具有差異性的菌屬減少，其中CW 區(qū)有10 個(gè)菌屬存在顯著性差異，酸桿菌門(mén)的CL500_29_marine_group和hgcI_clade，浮霉菌門(mén)的CL500_3，γ-變形菌的Limnobacter，疣微菌門(mén)的LD29為優(yōu)勢(shì)菌屬；UW 區(qū)有12 個(gè)屬存在顯著性差異，酸桿菌門(mén)的Aurantimicrobium，擬桿菌門(mén)的Pseudarcicella、Flavobacterium和Solitalea為優(yōu)勢(shì)菌屬；VW 區(qū)有7 個(gè)菌屬存在顯著性差異，僅擬桿菌門(mén)的Sediminibacterium為優(yōu)勢(shì)菌屬；AW 區(qū)有11個(gè)屬存在顯著性差異，放線菌門(mén)的Candidatus_Planktoluna，變形菌門(mén)的Limnohabitans和Malikia為優(yōu)勢(shì)菌屬.

2.3.3 微生物群落組成與環(huán)境因子的關(guān)系

通過(guò)Mentel Test 分析，發(fā)現(xiàn)汛期前各區(qū)域浮游細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬與環(huán)境因子存在極顯著相關(guān)關(guān)系(P=0.008)，將水體理化參數(shù)與優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行RDA 排序，結(jié)果如圖7(a)所示，各區(qū)域點(diǎn)位區(qū)分明顯，主要受pH、DO濃度、COD 濃度、NH4+-N 濃度和EC 的影響.AW 區(qū)樣品差異較小，主要受COD 濃度、NH4+-N 濃度和EC 因素的影響；UW、VW 和CW 區(qū)樣品差異性較大，引起群落差異的主要環(huán)境指標(biāo)為pH、DO 濃度和NO3--N 濃度.RDA 分析結(jié)果也表明，Sediminibacterium、Candidatus_Aquiluna和Fluviicola均與COD和NH4+-N濃度呈正相關(guān).

圖7 不同區(qū)域浮游細(xì)菌與環(huán)境因子RDA 分析Fig.7 RDA analysis of bacterioplankton and environmental factors in different regions

汛期后，Mentel Test 分析也表明環(huán)境因子與浮游細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬呈顯著相關(guān)(P=0.012)，將結(jié)果進(jìn)行RDA排序后，如圖7(b) 所示.汛期后樣品間差異性更小，主要影響因子為pH、NO3--N 濃度、NO2--N 濃度、TN濃度和ORP.CW 區(qū)樣品差異主要受ORP、TP 濃度和NH4+-N 濃度的影響；AW 區(qū)樣品差異主要受pH、DO 濃度、ORP 和TP 濃度的影響；UW 和VW 區(qū)樣品差異主要受COD、NO3--N、NO2--N、TN 濃度及ORP的影響.排序結(jié)果也表明，Limnohabitans、hgcI_clade、Acidibacter和CL500-29_marine_group與TP、NH4+-N、COD 濃度及ORP 均呈顯著負(fù)相關(guān)；MWH-UniP1_aquatic_group和Acinetobacter與pH 和DO 濃度均呈正相關(guān).

為進(jìn)一步明確浮游細(xì)菌與環(huán)境因子之間的關(guān)系，將優(yōu)勢(shì)菌門(mén)和優(yōu)勢(shì)菌屬與環(huán)境因子做Spearman 相關(guān)性分析.由圖8(a)可知，影響微生物菌門(mén)的主要環(huán)境因子有化學(xué)指標(biāo)COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN和TP，以及物理指標(biāo)ORP 和EC，且這些指標(biāo)與擬桿菌門(mén)和Epsilonbacteraeota 門(mén)均呈顯著正相關(guān)，與藍(lán)菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、異常球菌-棲熱菌門(mén)(Deinococcus-Thermus)、衣原體門(mén)、酸桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、疣微菌門(mén)、Patescibacteria、綠彎菌門(mén)、放線菌門(mén)和 Dependentiae門(mén)均呈顯著負(fù)相關(guān).

圖8 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子Spearman 相關(guān)性熱圖Fig.8 Bacterial community structure and environmental factor Spearman correlation heat map

優(yōu)勢(shì)菌屬多為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和藍(lán)藻菌門(mén).由圖8(b)可知，變形菌門(mén)的Pseudorhodobacter、Limnohabitans和Limnobacter屬均與COD、NH4+-N、NO2--N 和NO3--N 濃度呈顯著相關(guān)；擬桿菌門(mén)的Sediminibacterium、Solitalea、Flavobacterium和Fluviicola均與NO2--N、NO3--N、TN 和COD 濃度呈顯著正相關(guān)；藍(lán)菌門(mén)的Cyanobium_PCC-6307與NO2--N、NO3--N 和TP 濃度均呈顯著負(fù)相關(guān).

2.4 微生物群落氮轉(zhuǎn)化功能分析

為了解汛期前后不同土地利用類型河流浮游細(xì)菌功能的差異，采用PICRUSt2 軟件將樣本的ASV序列與內(nèi)部參與序列進(jìn)行對(duì)比，預(yù)測(cè)每個(gè)ASV 的基因拷貝數(shù)，確定樣本的基因豐度，結(jié)果如圖9 所示.通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，在一級(jí)水平上獲得樣本的6 大功能信息[26-27]，發(fā)現(xiàn)新陳代謝是清潩河流域的主要功能，占比為81.4%～82.2%，在UW 區(qū)占比最大，AW 區(qū)占比最小，汛期前后占比不變.在二級(jí)水平上主要由29 個(gè)子功能組成，其中細(xì)胞活性、脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝等9 個(gè)功能在CW 區(qū)占比為68.4%，遠(yuǎn)高于其他三區(qū)；汛期后，癌癥概要、其他氨基酸代謝、聚糖生物合成與代謝等8 個(gè)功能在UW 區(qū)占比最高，其他次生產(chǎn)物的生物合成、翻譯、膜運(yùn)輸?shù)? 個(gè)功能在AW區(qū)占比最高.

進(jìn)一步將樣本基因序列和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中65個(gè)氮代謝相關(guān)的基因進(jìn)行比對(duì)，篩選出參與氮代謝過(guò)程豐度最高的基因[28]，發(fā)現(xiàn)反硝化、氮同化和異化還原過(guò)程相關(guān)基因豐度較高，固氮和硝化過(guò)程相關(guān)基因豐度較低.由圖10 可知，編碼固氮酶的nifK、nifH和nifK基因在汛期后VW 區(qū)和汛期前AW 區(qū)占比均較高；編碼氨單加氧酶的amoA、amoB、amoC和編碼羥胺氧化還原酶的hao基因在CW 區(qū)和汛期前AW 區(qū)豐度均較高.反硝化過(guò)程中，編碼硝酸鹽還原酶的narG和narH基因在AW 區(qū)豐度均較高，且汛期后大 于汛期前；編碼亞硝酸還原酶的nirK基因在汛期前VW 和AW 區(qū)豐度均較高；編碼一氧化氮還原酶的norB、norC基因，以及編碼氧化亞氮還原酶的nosZ基因在VW 和AW 區(qū)豐度均較高.硝酸鹽異化還原過(guò)程中，編碼硝酸鹽異化還原酶的napA和napB基因與編碼固氮酶的基因豐度分布相同；編碼甲酸依賴型亞硝酸鹽還原酶的nrfA基因豐度汛期后高于汛期前，且在汛期后UW 和VW 區(qū)豐度較高；編碼亞硝酸鹽還原酶的nirD基因豐度最高.硝酸鹽同化還原過(guò)程中，編碼硝酸鹽同化還原的nasA和nirB基因豐度均高于narB、nasB和nirA基因.

圖10 氮代謝功能基因熱圖Fig.10 Heat map of functional genes of nitrogen metabolism

3 討論

3.1 汛期前后不同土地利用類型河流浮游細(xì)菌多樣性變化特征

汛期前浮游細(xì)菌多樣性高于汛期后.汛期前，流速較慢，穩(wěn)定的水體為浮游細(xì)菌提供了良好的環(huán)境，有利于處于競(jìng)爭(zhēng)弱勢(shì)的細(xì)菌繁殖，提高了細(xì)菌多樣性[29]；河流水溫偏高，水體中細(xì)菌活性較強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致浮游細(xì)菌在不同環(huán)境中表現(xiàn)出較大的空間差異性[30].汛期時(shí)，徑流量增大，水位升高，河道連通性加強(qiáng)，促進(jìn)了細(xì)菌的擴(kuò)散和稀釋作用，使得細(xì)菌空間差異性變小[31]；強(qiáng)降雨將土壤中積累的營(yíng)養(yǎng)鹽帶入河流，使NH4+-N 和NO3--N 濃度增加，導(dǎo)致降解污染物的特異性菌群大量繁殖抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)[4]，造成多樣性下降，這種效應(yīng)在汛期后仍然存在.

不同土地利用類型河流浮游細(xì)菌多樣性和豐富度差異明顯.汛期前，各區(qū)域Chao 指數(shù)和Shannon-Wiener 指數(shù)均表現(xiàn)為UW 區(qū)＞VW 區(qū)＞AW 區(qū)＞CW 區(qū)，該排序與人口密度大小排序一致.其原因可能是，UW 區(qū)人口密集，居民生活污水排放較多，水體中COD、NO3--N 和TN 濃度均較高，為細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖提供了良好的生存環(huán)境[32-34]；VW 和AW 區(qū)人口密度較小，污水排放量少，且VW 區(qū)河流匯入AW 區(qū)，AW 區(qū)細(xì)菌多樣性和豐富度均低于VW 區(qū)，說(shuō)明污水排放對(duì)浮游細(xì)菌的影響程度大于農(nóng)業(yè)面源污染；CW區(qū)受人類干擾最小，水質(zhì)穩(wěn)定，細(xì)菌多樣性和豐富度指數(shù)最低.汛期后，UW 區(qū)Chao 指數(shù)和Shanon 指數(shù)下降最多，其次為VW，CW 區(qū)下降最少.CW 與UW區(qū)屬上下游關(guān)系，汛期后CW 與UW 區(qū)多樣性指數(shù)相近，也論證了河流連通性增大，浮游細(xì)菌空間差異性減小；AW 和VW 區(qū)相交，但VW 區(qū)多樣性指數(shù)低于AW 區(qū)，說(shuō)明汛期對(duì)人類干擾較強(qiáng)區(qū)域的河流(UW 和VW 區(qū))中浮游細(xì)菌的多樣性影響較大，且影響程度大于區(qū)域的影響.

PCoA 和RDA 分析也得到了類似的結(jié)果.汛期前，VW 和UW 區(qū)差異明顯，汛期后，VW、UW 和AW區(qū)重疊，表明汛期減弱了人類活動(dòng)對(duì)河流浮游細(xì)菌空間差異性的影響，該結(jié)果與韓雪梅等[30]在老灌河研究浮游細(xì)菌多樣性的結(jié)果一致.汛期前，影響AW 和UW 區(qū)細(xì)菌空間差異的主要環(huán)境因子分別為COD 濃度、NH4+-N 濃度、WT、EC，以及pH、DO 濃度、NO3--N濃度.汛期后主要為pH、NO3--N 濃度、NO2--N 濃度、TN 濃度和ORP.以上結(jié)果也驗(yàn)證了人類活動(dòng)(包括氮和磷的輸入)的輕度干擾有利于細(xì)菌多樣性增加的結(jié)論.另外，已有研究表明受各種外部環(huán)境因素和內(nèi)部物種間相互作用的影響，浮游細(xì)菌的時(shí)期性演替是一個(gè)每年重復(fù)的過(guò)程[35].

3.2 汛期前后不同土地利用類型河流浮游細(xì)菌群落組成變化特征

變形菌門(mén)是UW、VW 和AW 區(qū)的第1 優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，在水環(huán)境中普遍存在，α-變形菌在氮循環(huán)中起到固氮作用[36]，β-變形菌在淡水中占主導(dǎo)地位[13]，γ-變形菌是化能異養(yǎng)菌，介導(dǎo)氫、硫和鐵的生物地球化學(xué)循環(huán)[37]，還有研究表明變形菌門(mén)在參與氮循環(huán)、氧化硫化物和降解有機(jī)物等方面具有重要作用[38].α-變形菌、β-變形菌和γ-變形菌占UW、VW 和AW 區(qū)總變形菌門(mén)的66.2% 以上，因此推斷在受人類干擾的UW、VW 和AW 區(qū)河流中，變形菌門(mén)是物質(zhì)循環(huán)的重要參與者.綠彎菌門(mén)和酸桿菌門(mén)是已知指示氮素污染物的微生物[39]，該菌門(mén)相對(duì)豐度均表現(xiàn)出汛期前大于汛期后的特征，與TN 濃度變化一致.浮霉菌門(mén)在缺氧條件下能夠利用亞硝酸鹽氧化銨離子脫氮，汛期后NH4+-N 和NO2--N 濃度較高可能是造成該菌門(mén)相對(duì)豐度相對(duì)較高的原因.裝甲菌門(mén)是廣泛分布在湖泊尤其是溫泉、熱泉的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群[40]，汛期前高溫天氣為該菌的繁殖提供了良好的環(huán)境.

hgcI_clade和CL500-29_marine_group與藍(lán)藻密切相關(guān)[41]，CW 中hgcI_clade和CL500-29_marine_group的相對(duì)豐度均明顯高于其他區(qū)域，說(shuō)明該地區(qū)存在藍(lán)藻異常增殖的風(fēng)險(xiǎn)；Limnohabitans偏好非酸性環(huán)境[42]，在硝酸鹽還原和磷循環(huán)中起著關(guān)鍵作用[43]，該菌在AW 和VW 區(qū)相對(duì)豐度較高，與AW 和VW區(qū)河流NO3--N 和TP 濃度均呈正相關(guān).Acinetobacter是污水細(xì)菌群落的核心類群，常見(jiàn)于人類和動(dòng)物腸道及分泌物中，被作為人類干擾污染的指示菌種[44]，除CW 外，其余三區(qū)Acinetobacter的相對(duì)豐度均較高.Thiobacillus通過(guò)氧化各種含硫化合物獲得能量，可以為各種水生植物提供硫元素，但也增加了水污染的風(fēng)險(xiǎn)[45]，該菌在汛期后的UW、VW 和AW 區(qū)較多且高于汛期前，說(shuō)明汛期后水污染風(fēng)險(xiǎn)增加.Flavobacterium靠分解有機(jī)物生存，使得水質(zhì)在一定程度得以提高[46-47].汛期后該菌的相對(duì)豐度顯著升高，且在UW 區(qū)相對(duì)豐度最高，說(shuō)明汛期增加了河流中有機(jī)物濃度，該結(jié)論與2.1 節(jié)一致.另外，F(xiàn)lavobacterium中的某些菌種具有致病作用，集中分布在江河、土壤沉積物和魚(yú)的發(fā)病組織中[48]，同時(shí)它還可以引起醫(yī)院內(nèi)感染，尤其是嬰幼兒更容易感染[49].因此，對(duì)于該菌屬也不容忽視，需強(qiáng)防護(hù)意識(shí).

3.3 汛期前后不同土地利用類型河流浮游細(xì)菌功能預(yù)測(cè)空間變化特征

河流過(guò)量的氮輸入會(huì)影響介導(dǎo)氮循環(huán)過(guò)程關(guān)鍵基因的豐度和比例，從而影響各個(gè)氮循環(huán)過(guò)程的速率[50].董志穎等[51]采用PICRUSt 功能預(yù)測(cè)分析過(guò)量氮輸入對(duì)細(xì)菌群落代謝潛力的影響，發(fā)現(xiàn)氮輸入在一定程度上影響了微宇宙中的固氮、硝化、反硝化、異化硝酸鹽還原到銨和同化硝酸鹽還原途徑的關(guān)鍵基因.

本文采用PICRUSt2 功能預(yù)測(cè)分析汛期前后細(xì)菌氮代謝潛力的差異，發(fā)現(xiàn)參與氮代謝過(guò)程的反硝化、氮異化和同化還原基因豐度最高，是河流中生物脫氮的關(guān)鍵基因[52]，且脫氮能力在受人類干擾的UW、VW 和AW 區(qū)最強(qiáng).汛期前，有8 個(gè)涉及脫氮過(guò)程的基因豐度高于汛期后，分別為反硝化基因(nirK、norB和norC)、氮同化基因(napB) 和氮異化基因(narB、nasA、nirA和nirB)；其中反硝化基因在AW區(qū)豐度最高，氮同化基因主要在UW 區(qū)，氮異化基因主要在VW 區(qū)，說(shuō)明AW 區(qū)反硝化能力最強(qiáng)，UW 和VW 區(qū)硝態(tài)氮主要通過(guò)氮同化和氮異化的方式去除.汛期后，有6 個(gè)涉及脫氮的基因豐度高于汛期前，分別為反硝化基因(narG、narH和nosZ)、氮同化基因(nasB)和氮異化還原基因(nrfA和nirD).結(jié)合基因功能家族預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)和氮循環(huán)相關(guān)基因豐度分析，汛期后氮代謝能力整體高于汛期前，且反硝化和氮異化還原基因豐度在UW 和VW 區(qū)顯著升高，編碼亞硝酸還原酶的nirD與編碼一氧化氮還原酶的norB和norC基因豐度增加最多，結(jié)合2.1 節(jié)分析，發(fā)現(xiàn)汛期后人類干擾區(qū)的NO3--N 和TN 濃度均升高，反硝化和硝酸鹽異化還原細(xì)菌繁殖，促進(jìn)了NO2--N 向氮?dú)獾霓D(zhuǎn)化.的轉(zhuǎn)化.

4 結(jié)論

a) 汛期前后清潩河流域不同土地利用類型河流浮游細(xì)菌多樣性存在顯著性差異，且汛期對(duì)有人類干擾的UW、VW 和AW 區(qū)多樣性影響最大.汛期前浮游細(xì)菌Shannon-Wiener 指數(shù)和Chao 指數(shù)高于汛期后，且人口密集的UW 區(qū)數(shù)值最大；汛期后，浮游細(xì)菌群落空間差異性減小，TN、NH4+-N 和COD 濃度增加，浮游細(xì)菌多樣性和豐富度指數(shù)下降，且UW 區(qū)指數(shù)下降最多.

b) 差異性分析結(jié)果表明，汛期前共17 個(gè)門(mén)、54個(gè)屬存在顯著性差異，汛期后共有12 個(gè)門(mén)、40 個(gè)屬存在顯著性差異，不同土地利用類型是影響細(xì)菌群落組成的主要因素.CW 區(qū)與藍(lán)藻密切相關(guān)的hgcI_clade和CL500-29_marine_group豐度最高，存在水體富營(yíng)養(yǎng)化的風(fēng)險(xiǎn)；UW 區(qū)Limnohabitans、Rhodobacter和Rhodobacter豐度最高，氮素污染嚴(yán)重；AW 和VW區(qū)Flavobacterium、Nitrospira和Thiobacillus 豐度最高，氮磷循環(huán)能力最強(qiáng).

c) PICRUSt2 功能預(yù)測(cè)分析表明，反硝化、氮同化和異化還原是清潩河流域的主要氮代謝功能，不同土地利用類型河流中氮代謝功能差異明顯，在人類干擾較強(qiáng)的UW、VW 和AW 區(qū)氮代謝基因豐度遠(yuǎn)高于CW 區(qū).