馬屬動(dòng)物富血小板血漿制備方法

彭 聰,李 靖,湯小朋,朱怡平

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 100193)

富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)于20世紀(jì)70年代人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提出,常用于整形外科、小兒外科、心臟外科、婦科、眼科等[1]。在獸醫(yī)學(xué)上PRP最初應(yīng)用于馬運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,用于治療馬運(yùn)動(dòng)疾病如韌帶、肌腱損傷等,后來也逐漸外用于治療馬關(guān)節(jié)炎、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等,近年來還有關(guān)于宮內(nèi)灌注PRP治療馬屬動(dòng)物子宮內(nèi)膜炎的報(bào)道[2]。

PRP促進(jìn)損傷愈合的機(jī)制比較復(fù)雜,在體外研究中PRP能促進(jìn)生物活性因子的合成和代謝,如促進(jìn)生長因子(growth factor,GF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、抗炎因子、白介素-1(interleukin-1,IL-1)受體拮抗劑的釋放[3],控制炎性反應(yīng)。在體內(nèi)研究中,PRP可提高損傷部位修復(fù)效率和修復(fù)質(zhì)量,如在肌腱損傷修復(fù)中,PRP治療后可使組織生物化學(xué)特性改善,膠原蛋白、糖胺聚糖等含量增加,加速損傷修復(fù)[4]。在骨關(guān)節(jié)疾病和骨折愈合相關(guān)研究中,PRP治療組馬匹表現(xiàn)出良好臨床恢復(fù)效果[5-6],這說明PRP可能是一種有效的骨或關(guān)節(jié)損傷治療手段。

馬PRP最佳治療濃度尚無定論,人醫(yī)中PRP推薦血小板濃度為全血的2～6倍[7]。在馬損傷修復(fù)應(yīng)用中,PRP最佳治療濃度、細(xì)胞組成和體積取決于患馬生理狀況、疾病類型和損傷部位等因素,這為PRP制備提出了更高要求。當(dāng)用于治療馬肌腱損傷或關(guān)節(jié)疾病時(shí),大約需要向損傷部位或關(guān)節(jié)內(nèi)注射2～5 mL的PRP;當(dāng)采用子宮灌洗PRP治療子宮內(nèi)膜炎時(shí),需要10～60 mL才能覆蓋整個(gè)子宮內(nèi)膜表面[8]。盡管目前已有大量馬屬動(dòng)物PRP的相關(guān)研究,但對治療不同損傷組織的最佳PRP治療濃度和細(xì)胞組成尚未達(dá)成共識(shí)。

在歐美等發(fā)達(dá)國家和地區(qū),PRP已成為馬屬動(dòng)物運(yùn)動(dòng)損傷治療的一種常用手段。美國72.5%的受訪馬獸醫(yī)曾使用過PRP治療馬關(guān)節(jié)疾病[9]。我國由于對PRP原理及其制備方法缺乏報(bào)道,該療法尚未得到廣泛應(yīng)用。本文根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)回顧了馬屬動(dòng)物PRP的幾種制備方法及影響因素,旨在為探索馬屬動(dòng)物PRP最佳制備方案提供一定參考。

1 PRP制備方法

1.1 商品化制備方法

商品化制備方法是指使用全自動(dòng)細(xì)胞分離器或商品化試劑盒制備PRP,均是基于離心技術(shù)輔以傳感器、光吸收等配件實(shí)現(xiàn)PRP的自動(dòng)分離,最初是根據(jù)人類血液特性設(shè)計(jì)的參數(shù)和程序,現(xiàn)也用于馬屬動(dòng)物PRP的制備。但馬屬動(dòng)物和人類血液學(xué)特性不盡相同,其制備效率及對PRP活性影響還需進(jìn)一步探究。近十年內(nèi),大量研究使用試劑盒制備馬PRP并進(jìn)行疾病治療效果評估,但尚無研究采用全自動(dòng)分離系統(tǒng)制備馬PRP[2]。

相較于全自動(dòng)分離系統(tǒng),商品化試劑盒更為經(jīng)濟(jì)和實(shí)用。PRP制備試劑盒根據(jù)血小板富集指數(shù)(PRP血小板濃度與全血中血小板濃度比值)可分為高富集試劑盒(5～9倍)和低富集試劑盒(2.5～3倍)。高富集試劑盒包括Biomet GPS Ⅱ、Biomet GPS Ⅲ、Harvest smartPRep 2 APC+、Arterio cyte-medtronic magellan等,低富集試劑盒包括Arthrex ACP、Cascade PPR therapy、PRGF by boitech institute vitoria等[1]。還有一種馬專用且無需離心的試劑盒——E-PETTM依靠重力富集血小板。E-PET在富集血小板、PDGF、TGF-β1方面效果更好[10]。商品化PRP制備方法具有污染小、自動(dòng)化等優(yōu)勢,但昂貴的儀器或試劑盒使其在臨床應(yīng)用中受到限制。

1.2 實(shí)驗(yàn)室制備方法

實(shí)驗(yàn)室制備方法具有成本低、PRP組成和濃度可控等特點(diǎn),是商品化制備法的有效替代。其基本原理是利用離心技術(shù)將血液中的不同成分進(jìn)行分離。在離心操作之前,需要采集馬屬動(dòng)物全血。一般通過頸靜脈穿刺并采用預(yù)置有抗凝劑的標(biāo)準(zhǔn)試管或血袋收集全血,采血量根據(jù)用途不同而有所差異。制備方法根據(jù)離心方案不同,可分為單次分離法、雙次離心法、白膜法、懸浮法、凍干法等。

1.2.1 單次分離法 實(shí)施單次離心法時(shí),采血后需在室溫下盡快進(jìn)行離心。得到上層血漿的頂部為貧血小板血漿(platelet-poor plasma,PPP),上層血漿其余部分為PRP。單次離心法具有耗時(shí)短、操作簡單、細(xì)菌污染少等優(yōu)勢,但由于僅離心一次,可能存在富集指數(shù)低、血細(xì)胞污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)[8]。目前尚無公認(rèn)的最佳單次離心方案,一般在制定離心方案時(shí),轉(zhuǎn)速和持續(xù)時(shí)間成負(fù)相關(guān)。不同研究結(jié)果表明,以120 r/min 10 min和1 200 r/min 3 min處理全血得到的PRP中血小板濃度接近[8-11]。

1.2.2 雙次離心法 采血后第1次離心用較小離心力處理全血,將含有血小板的上清血漿轉(zhuǎn)移到無菌離心管中,再以更大離心力得到血小板濃縮物。血小板濃縮物下1/3為PRP,用移液槍除去上2/3的PPP即可得到PRP[12]。該方法具有血小板回收率高、受白細(xì)胞(white blood cell,WBC)和紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)污染較少等優(yōu)勢,但需人工轉(zhuǎn)移血漿,會(huì)增加潛在細(xì)菌污染風(fēng)險(xiǎn),因此需注意無菌操作。此外,第2次離心時(shí)離心參數(shù)設(shè)置也是獲得高質(zhì)量PRP的關(guān)鍵所在。有研究比較了雙次離心法和單次離心法,認(rèn)為兩種方法均可富集血小板(1.8～5.6倍)并減少WBC和RBC殘留,但前者血小板濃度是后者2.2倍[8]。

1.2.3 白膜法 全血在離心前可儲(chǔ)存于20℃～24℃。離心時(shí)采用高轉(zhuǎn)速(通常>1 000 r/min)將全血分為3層:底層是RBC,中間層(即白膜)是WBC和血小板,頂層是PPP,移除頂層上清液,將白膜轉(zhuǎn)移到無菌離心管中,使用低速離心或過濾器分離WBC后即可得到PRP[13]。白膜法和雙次離心法在離心順序和離心力方面存在差異。在保護(hù)血小板活性方面,白膜法離心時(shí)RBC可為血小板提供生理緩沖,減少血小板的早期激活,得到的PRP可能活性更佳[14]。有證據(jù)表明,白膜法制備的PRP中血細(xì)胞污染風(fēng)險(xiǎn)更高,采用白膜法從犬血中制備的PRP與使用雙次離心法相比含有更多的WBC和RBC[15],但目前尚無這兩種方法制備馬屬動(dòng)物PRP的對比研究。

1.2.4 懸浮法 首先用預(yù)置有抗凝劑的注射器采集并保存全血,將注射器包裹在鋁箔中直立放置4 h,隨后將導(dǎo)管連接在注射器上,把注射器直立放置并以穩(wěn)定的力推動(dòng)注射器活塞,得到PPP和PRP[12]。在本方法中,PPP和PRP無肉眼可見的分界線,因此需要人為判斷富血小板血漿分界位置,一般認(rèn)為上1/6為PPP[8]。懸浮法僅依靠重力來分離PRP,其主要優(yōu)勢是操作方便、設(shè)備簡單,但耗時(shí)長、極易受WBC和RBC污染。WBC和RBC在儲(chǔ)存過程中會(huì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物,降低血小板活性,因此懸浮法制備的PRP不適合長時(shí)間保存[8]。

1.2.5 凍干法 凍干法是在已制備得到的PRP基礎(chǔ)上,將其放入-80℃冷凍,再放入凍干機(jī)干燥升華,具體參數(shù)視儀器而定,最終得到固體粉末狀PRP。凍干PRP目前常用于促進(jìn)傷口愈合和治療關(guān)節(jié)疾病[16]。液態(tài)PRP需要現(xiàn)場制備,否則全血中血小板活性會(huì)降低。液態(tài)PRP難以長時(shí)間保存,而凍干PRP具有易于保存和便于使用的優(yōu)勢,為預(yù)先制備、長期儲(chǔ)存、隨時(shí)使用提供了有利條件。同時(shí),制備異體PRP也依賴于凍干技術(shù)。有證據(jù)表明,冷凍干燥不僅不會(huì)降低PRP中生長因子活性[17],還能破壞血小板膜表面免疫球蛋白和抗原結(jié)構(gòu),減少免疫排異反應(yīng)[18]。另外,異體PRP可為血小板功能異?；蛉狈Φ幕疾●R匹提供可行的PRP治療方案。

2 PRP制備的影響因素

在制備或儲(chǔ)備PRP過程中,若操作不當(dāng)會(huì)造成血小板不可逆性激活,從而失去活性。WBC、RBC、活化凝血因子、細(xì)胞碎片和蛋白水解酶污染以及不當(dāng)離心都可能導(dǎo)致PRP活性及濃度下降,因此如何選擇合適制備方案和參數(shù)顯得尤為重要。在PRP制備過程中,影響血小板活性和濃度的因素眾多,包括離心參數(shù)、抗凝劑選擇、供血馬匹生理狀況、無菌操作技術(shù)等。

2.1 離心方案

合理的離心方案是在實(shí)驗(yàn)室制備中能否獲得合格血小板濃度的關(guān)鍵,大多數(shù)PRP制備過程涉及兩次離心用于分離和濃縮血小板,其主要影響因素是轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間。一般來說,轉(zhuǎn)速無論大小,都能獲得理想的血小板濃度,當(dāng)轉(zhuǎn)速較大時(shí),離心時(shí)間應(yīng)相應(yīng)縮短;當(dāng)轉(zhuǎn)速較小時(shí),離心時(shí)間需要適當(dāng)延長。但轉(zhuǎn)速過大會(huì)導(dǎo)致血小板破裂、活性下降[19]。離心次數(shù)也會(huì)影響血小板、WBC和RBC含量。第2次離心可以達(dá)到再次富集血小板的目的,提高血小板含量[8],還能減少PRP中WBC、RBC殘留[20],但再次離心的過程會(huì)增加來自操作人員、環(huán)境的污染風(fēng)險(xiǎn)。最常用制備方案仍為雙次離心法,根據(jù)目前已有制備方案,第1次低速離心的轉(zhuǎn)速通常為120～400 r/min,第2次離心的轉(zhuǎn)速通常為300～1 000 r/min,一般來說第2次轉(zhuǎn)速更高,離心時(shí)間可適當(dāng)延長[8-11]。截至目前,在馬屬動(dòng)物PRP相關(guān)研究中對最佳離心方案未達(dá)成一致,盡管有較多研究涉及PRP制備,但未有研究系統(tǒng)性比較不同離心方案的優(yōu)劣,仍需更多研究進(jìn)一步探索。

2.2 抗凝劑

為得到液態(tài)PRP,采集血液時(shí)需在全血中加入抗凝劑。不建議使用乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)制備PRP,因其可能會(huì)損傷血小板細(xì)胞膜并抑制血小板脫顆粒,導(dǎo)致活力下降。目前已報(bào)道可用于馬屬動(dòng)物PRP制備的抗凝劑有檸檬酸鈉(sodium citrate,SC)、枸櫞酸、腺嘌呤、枸櫞酸鈉、磷酸二氫鈉和葡萄糖溶液(CPD-A)、檸檬酸葡萄糖溶液A溶液和B溶液(ACD-A、ACD-B)[2]。ACD-A能將血小板pH保持在最佳值7.2左右,且檸檬酸鹽能與鈣結(jié)合,防止凝血級聯(lián)反應(yīng)[22],ACD-A與全血比例為1∶7～1∶9。與ACD作用效果相似,CPD-A與全血的比例為1∶7,但其維持代謝的成分較少,在維持血小板活力方面較弱[22]。ACD-A是商品化試劑盒中最常用抗凝劑,含有檸檬酸鹽的抗凝劑會(huì)降低PRP的血管再生作用且對局部組織有毒性作用[23],說明SC、ACD-A、ACD-B不適合用于PRP制備,CPD-A可能是用于制備PRP的較優(yōu)選擇。

2.3 無菌操作技術(shù)

細(xì)菌污染不僅會(huì)產(chǎn)生大量細(xì)菌代謝物質(zhì)導(dǎo)致血小板活性下降,還可能會(huì)引起治療部位感染,因此在制備過程中尤其在使用非商品化制備方法時(shí),需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則。PRP制備過程中細(xì)菌污染主要來自馬屬動(dòng)物靜脈穿刺部位皮膚表面、采血人員手部、上呼吸道以及環(huán)境。為了防止PRP產(chǎn)品被細(xì)菌污染,建議操作人員進(jìn)行適當(dāng)手部消毒并佩戴無菌外科手套,對靜脈穿刺部位可采用聚維酮碘或碘酊與酒精的組合進(jìn)行消毒。若條件允許,最好在清潔無氣流環(huán)境下或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行制備[2]。

2.4 供血馬生理狀況

供血馬品種、性別、年齡均會(huì)影響PRP中血小板濃度。雌性5歲以下馬匹血液制得的PRP中血小板含量更高,不同品種馬采用相同制備方案得到的PRP中血小板濃度也不同,這可能與不同品種馬血小板及WBC大小和重量不同有關(guān)[24]。

3 展望

盡管國外諸多文獻(xiàn)闡述了馬屬動(dòng)物PRP制備方案,但國內(nèi)依然缺乏關(guān)于馬屬動(dòng)物PRP組成、激活、活性測定和應(yīng)用方法等信息的介紹,極大限制了馬屬動(dòng)物PRP制備體系建立和標(biāo)準(zhǔn)化研究。除此之外,特定濃度或組成的馬屬動(dòng)物PRP在不同疾病或組織損傷中治療效果也亟待研究,以便建立不同疾病的PRP最佳制備方法及治療方案。同時(shí),馬屬動(dòng)物PRP研究存在較大異質(zhì)性,如全血中血小板濃度、全血體積、疾病嚴(yán)重情況等難以統(tǒng)一,影響對PRP質(zhì)量及治療效果的評估。馬屬動(dòng)物PRP制備方案仍有諸多因素有待統(tǒng)一,制備方案的標(biāo)準(zhǔn)化不僅有利于促進(jìn)PRP在馬屬動(dòng)物臨床疾病治療中的應(yīng)用,也有利于提高PRP相關(guān)研究結(jié)論的可靠性與一致性。