黃芩苷對(duì)自噬介導(dǎo)H6N6禽流感病毒致病損傷的作用

楊 鑫,單春蘭,楊 劍,宋旭琴,徐 浩,歐德淵*

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025;2.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550025)

禽流感(Avian influenza virus,AIV)是一種高度接觸性傳染病,常引起家禽和野鳥(niǎo)等發(fā)病,發(fā)病率和病死率較高,給家禽養(yǎng)殖造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。研究發(fā)現(xiàn),H6N6亞型禽流感病毒可在小鼠體內(nèi)引發(fā)肺組織炎癥病變,病毒的感染力較強(qiáng),證實(shí)可以跨越物種差異感染哺乳動(dòng)物[2]。自噬是免疫病原損傷機(jī)體的重要機(jī)制,當(dāng)病毒進(jìn)入細(xì)胞后,自噬體和溶酶體融合,促進(jìn)病毒顆粒的降解,在病毒感染宿主過(guò)程中有防御作用[3]。自噬對(duì)流感病毒感染機(jī)體產(chǎn)生的炎性因子起著重要的調(diào)控作用[4]。甲型流感病毒可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,自噬參與病毒的復(fù)制和發(fā)病機(jī)制[5]。中藥在調(diào)控自噬緩解流感病毒所致細(xì)胞損傷方面已經(jīng)取得一定的研究進(jìn)展[6-7]。黃芩苷是黃芩提取物中有效的黃酮類成分之一,具有抗炎、抗病毒、抗氧化等廣泛的藥理活性[8]。黃芩苷可以減少H6N6亞型禽流感病毒感染的小鼠炎癥細(xì)胞的釋放,緩解小鼠肺臟的損傷[9]。黃芩苷通過(guò)抑制H3N2病毒誘導(dǎo)的自噬阻止病毒的復(fù)制,其藥理作用尚不明確,自噬與病毒之間的作用機(jī)制將成為研究藥物治療流感病毒的新方向[10]。本研究探討黃芩苷對(duì)H6N6亞型禽流感病毒誘導(dǎo)的小鼠肺炎是否通過(guò)調(diào)控自噬途徑來(lái)緩解病理?yè)p傷,以闡明黃芩苷抗H6N6亞型禽流感病毒潛在的機(jī)制,從而為疫病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)毒株 病毒株A/duck/Guizhou/03/2016(H6N6),由貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠40只購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)在12 h的明暗交替的環(huán)境中,濕度控制為35%～45%,溫度控制為21～23℃。

1.1.3 主要試劑 黃芩苷(純度90%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品;3-甲基腺嘌呤(3-MA),美國(guó)Selleck公司產(chǎn)品;兔多抗LC3,鼠單抗Beclin-1,鼠單抗ATG7,熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;鼠單抗ATG5,武漢賽維生物科技有限公司產(chǎn)品;β-Actin小鼠單克隆抗體,山羊抗兔IgG(H+L),山羊抗小鼠IgG(H+L),BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒,上海碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品;免疫組化通用試劑盒,福州邁新生物科技有限公司產(chǎn)品;PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒,TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒,TaKaRa公司產(chǎn)品;小鼠白介素-1β(IL-1β),小鼠白介素-2(IL-2),小鼠白介素-6(IL-6),小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α),上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組與處理 選用40只昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control)、模型組(Model)、黃芩苷治療組(Baicalin treatmentgroup)、3-MA抑制劑組(3-MA inhibitor group)。參照文獻(xiàn)建立H6N6誘導(dǎo)小鼠肺炎模型,通過(guò)尾靜脈攻毒(0.2 mL/只),攻毒3 d后黃芩苷組進(jìn)行灌胃給藥,黃芩苷給藥劑量為每天0.056 mg/只[11],3-MA通過(guò)腹腔注射,藥劑量為每天15 mg/kg[12],各組每天給予等體積滅菌生理鹽水,連續(xù)治療6 d后眼球采血后脊椎處死。該試驗(yàn)嚴(yán)格按照動(dòng)物福利原則進(jìn)行,并獲得了貴州大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)EAE-GZU-2021-T096)。

1.2.2 HE染色觀察肺臟組織損傷 小鼠左側(cè)肺組織在室溫下用40 mL/L多聚甲醛固定72 h,脫水后將組織包埋制作石蠟連續(xù)切片,并進(jìn)行HE染色封片,在顯微鏡下觀察病理?yè)p傷情況。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)各組血清中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量 眼球采血收集各組小鼠血清,充分離心(3000 r/min)收集上清,并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 小鼠肺臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 小鼠處死后將小鼠的肺臟切成厚度不超過(guò)4 mm,在1 min內(nèi)迅速侵入25 mL/L戊二醛中固定4 h,10 g/L四氧化鋨再固定,依次進(jìn)行丙酮逐級(jí)脫水、滲透和包埋、超薄切片,先用醋酸鈾染色10～15 min,再用檸檬酸鉛染色1～2 min,室溫下染色。通過(guò)透射電鏡對(duì)片子進(jìn)行圖像采集。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)肺組織LC3、Beclin-1和ATG7蛋白水平 各組稱取等量的小鼠右側(cè)部分肺組織,用BCA試劑盒提取總蛋白并定量,將蛋白煮沸10 min后進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到0.22 μm硝化纖維素濾膜上,50 g/L脫脂奶粉封閉,搖床慢搖2 h,經(jīng)過(guò)TBST連續(xù)清洗后分別加一抗LC3、Beclin-1及ATG7和β-Actin抗體4℃孵育過(guò)夜,加入相應(yīng)山羊抗小鼠或抗兔的二抗一起孵育2 h,用ECL溶液化學(xué)發(fā)光對(duì)PVDF膜顯色拍照。

1.2.6 免疫熒光檢測(cè)LC3蛋白水平 取各組左側(cè)肺組織制作石蠟切片,依次進(jìn)行脫蠟、梯度乙醇復(fù)水,修復(fù),血清室溫封閉30 min,除去封閉液,滴加LC3一抗工作液4℃孵育過(guò)夜,后滴加熒光標(biāo)記的驢抗兔二抗,室溫下孵育避光孵育1 h,DAPI復(fù)染細(xì)胞核5 min。在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)LC3、Beclin-1和ATG5蛋白水平 取各組左側(cè)肺組織制作石蠟切片,依次進(jìn)行脫蠟、梯度乙醇復(fù)水,修復(fù),血清室溫封閉1 h,分別滴加稀釋好的一抗LC3II、Beclin-1和ATG5抗體4℃孵育過(guò)夜,后滴加稀釋好的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗,室溫孵育1 h,滴加DAB顯色(5 min)。封片后于顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.8 熒光定量PCR檢測(cè)自噬關(guān)鍵基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平 將各組小鼠右側(cè)部分肺組織液氮研磨至勻漿,采用Trizol法提取肺組織總RNA,依次按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和TB Green?Premix ExTaqTMⅡ說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng):95℃ 30 s,95℃ 5 s,55～59℃ 20 s,共35個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參,采用相對(duì)定量2-△△Ct法比較LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。查閱GenBank并設(shè)計(jì)相關(guān)引物(表1),引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對(duì)小鼠肺組織學(xué)的影響

對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰,沒(méi)有出現(xiàn)炎癥性病理變化(圖1),與對(duì)照組比較,模型組小鼠小支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡壁毛細(xì)血管壁充血,間質(zhì)變寬,證明H6N6感染的小鼠急性肺損傷造模成功。與模型組相比,黃芩苷治療組與3-MA抑制劑組可以顯著緩解由H6N6亞型禽流感病毒所致的病理?yè)p傷,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。

A.對(duì)照組;B.模型組;C.黃芩苷治療組;D.3-MA抑制劑組A.Control group; B.Model group; C.Baicalin treatment group; D.3-MA inhibitor group

2.2 黃芩苷對(duì)小鼠血清中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量的影響

與對(duì)照組相比,模型組IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α炎性因子含量顯著升高(P<0.01);與模型組比較,黃芩苷治療組IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α炎性因子含量顯著降低(P<0.01);3-MA抑制劑組的IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α炎性因子在也顯著降低(P<0.01)(圖2)。

A.IL-1β的含量;B.IL-2的含量;C.IL-6的含量;D.TNF-α的含量A.IL-1β content; B.IL-2 content; C.IL-6 content; D.TNF-α content1.對(duì)照組;2.模型組;3.黃芩苷治療組;4.3-MA抑制劑組1.Control group; 2.Model group; 3.Baicalin treatment group; 4.3-MA inhibitor group

2.3 黃芩苷對(duì)小鼠肺組織自噬體的影響

透射電鏡觀察各組小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞,對(duì)照組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較正常,線粒體和嗜鋨性板層小體結(jié)構(gòu)完整清晰(圖3);與對(duì)照組相比,模型組線粒體發(fā)生腫脹(嵴斷裂溶解),部分嗜鋨性板層小體變性,胞漿內(nèi)有較多自噬體;與模型組相比;黃芩組肺泡上皮細(xì)胞的少數(shù)線粒體有輕度腫脹,部分嗜鋨性板層小體變性,自噬體減少;3-MA抑制劑組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的少數(shù)線粒體出現(xiàn)輕度腫脹,少數(shù)嗜鋨性板層小體變性,胞漿內(nèi)有少量自噬。

2.4 黃芩苷對(duì)小鼠肺組織LC3II/I、Beclin-1和ATG7蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較,模型組LC3II/I、Beclin-1及ATG7蛋白水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,黃芩苷治療組LC3II/I、Beclin-1及ATG7蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.01);3-MA抑制劑能夠顯著下調(diào)LC3II/I、Beclin-1及ATG7蛋白水平(P<0.01)(圖4)。

2.5 黃芩苷對(duì)小鼠肺組織LC3蛋白表達(dá)水平的影響

免疫熒光檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)水平結(jié)果見(jiàn)圖5。與對(duì)照組相比,模型組熒光表達(dá)強(qiáng)度顯著升高(P<0.01);與模型組相比,黃芩苷治療組的熒光表達(dá)強(qiáng)度顯著降低(P<0.01);同時(shí)3-MA抑制劑組的熒光表達(dá)顯著降低(P<0.01);此結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。

A.免疫熒光檢測(cè)LC3蛋白結(jié)果;B.LC3蛋白量化結(jié)果A.LC3 protein detected by immunofluorescence; B.Quantification results of LC3 protein1.對(duì)照組;2.模型組;3.黃芩苷治療組;4.3-MA抑制劑組1.Control group; 2.Model group; 3.Baicalin treatment group; 4.3-MA inhibitor group

2.6 黃芩苷對(duì)小鼠肺組織LC3、Beclin-1和ATG5蛋白表達(dá)水平影響

免疫組化檢測(cè)LC3、Beclin-1及ATG5蛋白結(jié)果見(jiàn)圖6。與對(duì)照組相比,模型組LC3、Beclin-1及ATG5陽(yáng)性表達(dá)升高(P<0.01);與模型組相比,黃芩苷治療組的LC3、Beclin-1及ATG5陽(yáng)性表達(dá)降低(P<0.01);同時(shí)3-MA抑制劑組的LC3、Beclin-1及ATG5陽(yáng)性表達(dá)降低(P<0.01)。

A.免疫組化檢測(cè)LC3、Beclin-1及ATG5蛋白表達(dá)水平;B.LC3蛋白區(qū)域量化結(jié)果;C.Beclin-1蛋白區(qū)域量化結(jié)果;E.ATG5蛋白區(qū)域量化結(jié)果

2.7 黃芩苷對(duì)小鼠肺組織自噬關(guān)鍵基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的影響

RT-qPCR檢測(cè)自噬關(guān)鍵基因結(jié)果見(jiàn)圖7,與對(duì)照組比較,模型組LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均不同程度的升高(P<0.01);與模型組相比,黃芩苷組LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7和ATG12 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均不同程度下降(P<0.01),同時(shí)3-MA抑制劑組的LC3、Beclin-1、ATG12及ATG5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均不同程度下調(diào)(P<0.01),黃芩苷與3-MA抑制劑作用呈相同調(diào)控趨勢(shì)。

A.LC3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平;B.Beclin-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平;C.ATG3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平;D.ATG5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平E.ATG7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平;F.ATG12 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

H6N6亞型禽流感病毒可跨越物種屏障感染小鼠和豬等哺乳動(dòng)物,在家禽中的分離率較高,易與其他亞型流感病毒發(fā)生重組,對(duì)人類健康構(gòu)成威脅[13]。流感病毒感染氣道上皮細(xì)胞之后會(huì)釋放大量趨化因子,將大量的白細(xì)胞募集到感染部位來(lái)抵御病毒感染。免疫反應(yīng)對(duì)于清除外來(lái)病原體和被感染的細(xì)胞是必不可少的,但過(guò)度的免疫反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致大量炎性細(xì)胞因子的累積從而導(dǎo)致肺臟、心臟和腎臟等重要器官的損傷[14-15]。當(dāng)流感病毒感染機(jī)體后,機(jī)體內(nèi)炎性細(xì)胞因子過(guò)度釋放,導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞及器官組織的炎癥損傷,這也是肺炎性實(shí)變的原因之一[16-17]。此外,細(xì)胞自噬在機(jī)體應(yīng)對(duì)外來(lái)病原微生物感染的免疫應(yīng)答中有重要的作用[18]。細(xì)胞自噬可以介導(dǎo)流感病毒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),在誘導(dǎo)自噬時(shí)會(huì)產(chǎn)生炎性因子調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[19]。研究表明,黃芩苷可以抑制H1N1流感病毒感染小鼠IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的分泌,有效的減輕小鼠肺組織的病理?yè)p傷[20-21]。抑制細(xì)胞自噬可以降低H9N2流感病毒誘導(dǎo)小鼠肺臟病理?yè)p傷,降低肺組織炎性細(xì)胞的釋放及降低IL-1β、TNF-α、IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄水平[12]。本研究表明,黃芩苷能夠減緩由H6N6亞型禽流感病毒誘導(dǎo)小鼠肺臟的病理?yè)p傷及其降低血清中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量,與萬(wàn)巧鳳等發(fā)現(xiàn)的黃芩苷能減輕小鼠肺內(nèi)的炎性病變的結(jié)果一致[22]。說(shuō)明黃芩苷能夠緩解H6N6亞型禽流感感染小鼠肺組織損傷。在3-MA抑制劑的作用下H6N6亞型禽流感感染小鼠血清中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的含量降低。提示黃芩苷改善小鼠肺組織的病理?yè)p可能與3-MA抑制自噬的作用機(jī)制有關(guān)。

不同亞型(H5N1和H9N2)的流感病毒可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[23-24]。LC3是唯一在成熟過(guò)程中與自噬體保持穩(wěn)定相關(guān)的蛋白,與自噬小體和自噬溶酶體相對(duì)特異性相關(guān),LC3的活性的高低是衡量自噬小體的數(shù)量的金標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)在透射電鏡下觀察自噬小體和自噬溶酶體也是衡量自噬水平的金標(biāo)準(zhǔn)[25-26]。Beclin-1基因可促進(jìn)溶酶體和自噬體的融合,是自噬蛋白的標(biāo)志蛋白,對(duì)自噬的活化程度有決定性的作用,ATG家族的基因在自噬泡中的位置與活化程度同樣受到Beclin-1基因的調(diào)控[27]。ATG5、ATG7和ATG12在自噬小體的延伸過(guò)程中起重要作用,ATG7啟動(dòng)ATG5-ATG12結(jié)合并加速LC3-Ⅰ脂化反應(yīng)生成LC3-Ⅱ[27-28]。研究發(fā)現(xiàn),黃芩苷通過(guò)下調(diào)ATG5、ATG7、ATG12、LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平抑制LPS誘導(dǎo)的RSC-364細(xì)胞的自噬[29]。黃芩苷能降低ATG5-ATG12復(fù)合物和LC3-Ⅱ的表達(dá)抑制H3N2流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬[10]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,黃芩苷能降低小鼠肺臟組織中自噬體的數(shù)量以及降低LC3、Beclin-1、ATG5和ATG7蛋白表達(dá)水平,說(shuō)明黃芩苷能夠抑制H6N6禽流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬,與上述研究結(jié)果一致。進(jìn)一步用RT-qPCR檢測(cè)自噬關(guān)鍵基因驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7和ATG12 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。黃芩苷干預(yù)后與3-MA抑制劑效果呈相同調(diào)控趨勢(shì),提示黃芩苷可能通過(guò)抑制H6N6亞型禽流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬以緩解小鼠肺損傷。

綜上所述,黃芩苷對(duì)H6N6亞型流感病毒致小鼠肺損傷的保護(hù)作用可能與抑制細(xì)胞自噬有關(guān)。明確黃芩苷通過(guò)抑制H6N6亞型禽流感病毒觸發(fā)的自噬和炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系,可能是治療流感病毒引起的炎癥新的靶向目標(biāo),有助于進(jìn)一步闡釋黃芩苷抗流感病毒的藥理特性。