豬塞內(nèi)卡病毒A、豬水皰病毒和口蹄疫病毒三重熒光定量PCR檢測方法的建立與應用

蘇 博,吳志敏,張馨月,趙 涵,鮑 迪,張?zhí)礴?張嘉鈺,梁湘雨,孟凡茹,王 開,胡桂學

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,吉林長春 130118)

塞內(nèi)卡病毒A(Senecavirus A,SVA)、豬水皰病毒(Swine veslcular disease virus,SVDV)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)均為小RNA科病毒[1-5],都能引起感染豬產(chǎn)生水皰癥狀[6-9],仔豬病死率較高,僅憑臨床癥狀難以鑒別3種病毒感染豬[10-13]。已報道的引起豬出現(xiàn)水皰癥狀的病毒多為二重熒光定量檢測方法[14-16]。為了實現(xiàn)快速鑒別有水皰癥狀的病毒感染豬,本試驗建立一種可以鑒別3種病毒的三重熒光定量檢測方法,為臨床診斷鑒別提供科學方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、質(zhì)粒 SVA純培養(yǎng)物由四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術(shù)中心惠贈,FMDV水皰液為確診來自四川、重慶病豬。含有SVA、FMDV、SVDV病毒部分保守序列的重組陽性質(zhì)粒由上海生工生物工程有限公司合成。豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、經(jīng)典豬瘟病毒(CFSV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)由本實驗室保存,偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓病毒環(huán)2型(PCV2)病料來自吉林省2020-2021年送檢的陽性組織樣本。

1.1.2 主要試劑 ProTaqHS premix probe qPCR kit和ROX reference dye (4 μmol/L),Accurate公司產(chǎn)品;DEPC treated water、Trizol,Sangon公司產(chǎn)品;2×EsTaqmaster mix(dye),CWBIO公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker DL 1 000、6×Loading buffer,TAKARA公司產(chǎn)品;病毒DNA提取試劑盒,OMEGA生物技術(shù)公司產(chǎn)品;50×TAE,Coolaber公司產(chǎn)品;Gel red,Bio sharp公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 Applied biosystemTM7500熒光PCR儀和Nano Drop微量核酸蛋白濃度測定儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品;EP Mastercycler nexus PCR儀和臺式高速冷凍離心機,Eppendorf公司產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng),Bio red公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物探針的設(shè)計與合成 用Primer5/Oligo7軟件對比GenBank數(shù)據(jù)庫中3種病毒不同毒株基因序列,在3種病毒的高度保守區(qū)域分別設(shè)計多對候選引物和探針,FMDV引物探針設(shè)計區(qū)間為(GenBank:AF308157.1)5′UTR區(qū)域(571-1 069 bp),SVDV引物探針設(shè)計區(qū)間為(GenBank:MK038999.1)3D序列(6 459-6 875 bp),SVA引物探針設(shè)計區(qū)間為(GenBank:MK802890.1) 3D序列(6 999-7 149 bp)。引物用Primer Blast工具進行序列比對,預測特異性。確認序列后將其發(fā)送至Sangon公司進行合成,探針發(fā)送Takara公司合成(表1)。

表1 熒光定量PCR候選引物和探針

1.2.2 重組質(zhì)粒的合成與稀釋 質(zhì)粒的合成選擇覆蓋試驗設(shè)計引物擴增區(qū)間的堿基序列,由Sangon公司合成。3種病毒的合成質(zhì)粒分別為FMDV-plasmid (499 bp)、SVDV-plasmid (417 bp)、SVA-plasmid (451 bp)。使用NanoDrop微量核酸蛋白濃度測定儀對合成的質(zhì)粒進行濃度測定,根據(jù)拷貝數(shù)計算公式得出3種質(zhì)粒標準品的拷貝數(shù)。按對應比例加入Elution buffer稀釋至1×1010copies/μL,再10倍梯度稀釋至101copies/μL,分裝后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 核酸提取 按照試劑盒說明書提取對照DNA病毒的DNA,保存在-20℃冰箱備用。RNA病毒提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,放入-20℃冰箱備用。

1.2.4 引物篩選 在探針序列固定的條件下,使用每種病毒提前設(shè)計的3組候選引物對陽性質(zhì)粒進行擴增,反應體系為2×ProTaqHS Probe Premix 10 μL,RO×Reference Dye(4 μmol/L)0.4 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,探針(10 μmol/L)各0.2 μL,模板共2 μL,DEPC水補足20 μL;反應程序為95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 30 s,40個循環(huán)。擴增對應病毒106～101copies/μL梯度濃度陽性質(zhì)粒,每個濃度梯度設(shè)置3個重復孔,取平均值,以擴增效率高、不出現(xiàn)非特異性信號時循環(huán)數(shù)小的條件作為優(yōu)先選擇因素,篩選靈敏度高的引物對。

1.2.5 反應條件的優(yōu)化

1.2.5.1 溫度優(yōu)化 使用普通PCR方法對篩選出的引物對進行退火溫度的優(yōu)化。將濃度為103copies/μL的3種病毒質(zhì)粒作為模板,分別在56.5、57.7、58.5、59.5、60.8、61.5℃退火進行 PCR反應,結(jié)束后在反應管內(nèi)加入6×Loading buffer,瓊脂糖凝膠電泳,確定反應溫度。

1.2.5.2 引物和探針含量優(yōu)化 結(jié)合熒光定量試劑說明書,在確定退火溫度的條件下,引物(10 μmol/L)添加量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL。探針(10 μmol/L)添加量分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μL篩選最佳濃度。

1.2.6 特異性、靈敏性、重復性試驗

1.2.6.1 特異性試驗 以SVA、FMDV、PRRSV、CFSV、PEDV、PCV2、PRV陽性樣品cDNA或DNA以及SVDV的陽性質(zhì)粒作為模板,觀察實時熒光定量PCR擴增結(jié)果。

1.2.6.2 靈敏性試驗 篩選出引物后使用梯度濃度為106～101copies/μL的SVA、SVDV、FMDV陽性質(zhì)粒作為模板,DEPC H2O為陰性對照模板,進行TaqMan熒光定量PCR和普通PCR擴增,測試對比兩種PCR的靈敏性差異。SVA、SVDV和FMDV普通PCR產(chǎn)物大小分別為103 bp、73 bp和133 bp。

1.2.6.3 重復性試驗 選取濃度為106～104copies/μL的SVA、SVDV、FMDV陽性質(zhì)粒作為模板,以DEPC水作為陰性對照,進行3次獨立且重復的實時熒光PCR試驗作為批間重復試驗,每次試驗的每個模板做3個重復作為批內(nèi)重復試驗。記錄檢測的Ct值及變異系數(shù),測試并評價實時熒光定量PCR方法的重復性。

1.2.7 三重熒光定量PCR方法的標準曲線建立 將梯度稀釋濃度為106～101copies/μL的SVA、SVDV、FMDV質(zhì)粒作為模板,DEPC H2O為陰性對照,使用篩選的引物及優(yōu)化后的反應條件進行TaqMan熒光定量PCR擴增,繪制標準曲線。

1.2.8 三重熒光定量PCR方法的初步應用 采用本試驗建立的SVA、SVDV、FMDV三重熒光定量PCR方法對吉林省部分地區(qū)送檢死亡仔豬或流產(chǎn)死胎的肝、腎、脾、肺、腸、血清、口腔鼻腔拭子以及本實驗室保存的豬血清進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒濃度測定

測得3種質(zhì)粒的濃度分別為146.8 ng/μL(FMDV)、62.9 ng/μL(SVDV)、166 ng/μL(SVA),經(jīng)計算得出3種質(zhì)粒的拷貝數(shù)分別為4.17×1010(FMDV)、1.83×1010(SVDV)、4.79×1010(SVA),再分別將3種質(zhì)粒梯度稀釋成1010～101copies/μL。

2.2 引物的篩選

在探針序列固定的條件下用3種病毒對應的3組候選引物進行實時熒光定量PCR反應。F2R2(SVA)在同靈敏度條件下Ct值較小,F4R4(SVDV)能達到101copies/μL,F9R9(FMDV)靈敏度能達到101copies/μL。Ct值小于32時,結(jié)果判定為有效。選擇靈敏度高的引物,靈敏度相同時選擇Ct值較小的引物對(表2)。因此,選擇F2R2作為SVA熒光定量PCR引物,F4R4作為SVDV熒光定量PCR引物,F9R9作為FMDV熒光定量PCR引物。

表2 使用不同引物檢測對應各濃度梯度質(zhì)粒標準品的Ct值

2.3 反應條件的優(yōu)化

2.3.1 反應溫度優(yōu)化 篩選出的引物對在56.5、57.7、58.5、59.5、60.8、61.5℃退火溫度下進行PCR擴增相應病毒103copies/μL標準品,SVA引物在60.8℃和61.5℃時條帶較為明顯,SVDV引物在56.5℃和60.8℃、61.5℃時條帶較為明顯,FMDV引物在56.5～60.8℃退火溫度條件下未見明顯差異(圖1)。選擇60.8℃作為最佳退火溫度。

M.DNA標準DL 150;1～6.56.5℃、57.7℃、58.5℃、59.5℃、60.8℃、61.5℃;7.陰性對照

2.3.2 引物探針含量優(yōu)化 在確定退火溫度的條件下,隨著引物濃度的增加,熒光定量PCR的Ct值有輕微變化,但無明顯規(guī)律(表3～表5,表中列出的Ct值為批內(nèi)重復孔的平均Ct值)。以未檢出異常擴增信號時Ct值較小的組合作為篩選的優(yōu)先選擇條件,出現(xiàn)近似數(shù)據(jù)時選擇熒光強度高且引物探針添加量少的條件。多重熒光定量PCR除了上述條件外還應將擴增效率高的引物和和擴增效率低的引物在添加量方面進行平衡,以保證體系內(nèi)3對引物的均等擴增。在20 μL體系下,選擇SVA引物添加量為0.4 μL,探針添加量為0.2 μL;SVDV引物添加量為0.5 μL,探針添加量為0.4 μL;FMDV引物添加量為0.5 μL,探針添加量為0.2 μL作為最佳引物探針添加量。

表3 不同濃度引物和探針檢測SVA質(zhì)粒的Ct值

表4 不同濃度引物和探針檢測SVDV質(zhì)粒的Ct值

表5 不同濃度引物和探針檢測FMDV質(zhì)粒的Ct值

2.4 特異性靈敏性重復性試驗

2.4.1 特異性試驗 利用熒光定量PCR方法分別檢測SVA、FMDV、PRRSV、CFSV 、PEDV、PCV2、PRV陽性樣品cDNA或DNA以及SVDV的陽性質(zhì)粒(圖2),只能擴增對應陽性病毒樣品或質(zhì)粒,SVA、SVDV、FMDV的Ct值分別為24.4、24.9、25.3,其他結(jié)果均顯示陰性,表明該實時熒光定量PCR方法具有良好的特異性。

1.SVA;2.SVDV;3.FMDV;4.PRRSV;5.CSFV;6.PEDV;7.PCV2;8.PRV;NC.陰性對照

2.4.2 靈敏性試驗 使用濃度梯度為106～101copies/μL的質(zhì)粒進行普通PCR擴增,3種病毒普通PCR最低檢出極限處核酸條帶與預期大小相符(圖3),SVA普通PCR最低檢出極限為103copies/μL,SVDV普通PCR最低檢出極限為104copies/μL,FMDV普通PCR最低檢出極限為104copies/μL。根據(jù)普通PCR的擴增結(jié)果,選擇標準濃度為1×101copies/μL的3種病毒標準質(zhì)粒進行TaqMan熒光定量PCR擴增,本方法對3種病毒的靈敏度均達到1×101copies/μL(圖4)。

M.DNA標準DL 150;1～6.106～101copies/μL質(zhì)粒普通PCR擴增產(chǎn)物;7.陰性對照

1～3.1×101 copies/μL標準模板的SVA、SVDV、FMDV TaqMan多重實時熒光定量PCR擴增曲線;NC.陰性對照

2.4.3 重復性試驗 以106～104copies/μL的病毒質(zhì)粒為模板,以DEPC水作為陰性對照,進行批間和批內(nèi)重復試驗,Ct值及變異系數(shù)均低于4%(表6)。

表6 TaqMan多重實時熒光定量PCR重復性試驗

2.5 標準曲線的建立

在106～101copies/μL的梯度濃度區(qū)間內(nèi),根據(jù)擴增曲線繪制3條標準曲線的相關(guān)系數(shù)接近1(表7),符合預期結(jié)果。3種病毒對應的擴增曲線都呈現(xiàn)較為標準的“S型”曲線。

表7 標準曲線相關(guān)參數(shù)

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果

使用本試驗建立的三重熒光定量PCR方法,檢測臨床病料305份,檢出7份FMDV核酸陽性樣品,1份SVA核酸陽性樣品,未檢測到SVDV核酸。7份FMDV陽性樣品均為確診樣品,1份SVA樣品為病毒分離培養(yǎng)物,吉林省送檢的297份病料和實驗室保存的豬血清未檢出SVA、FMDV、SVDV核酸。

3 討論

SVA、SVDV和FMDV感染豬在臨床上的癥狀高度相似,鑒別診斷困難。多重熒光定量 RT-PCR技術(shù)能同時檢測多種核酸擴增,非常適合快速鑒別不同病原[17]。但多重熒光定量需要考慮現(xiàn)有實驗室熒光定量儀器支持同時檢測的信號,除此之外包括引物與引物、引物與探針的匹配、競爭和錯配都需要進行優(yōu)化[18-19]。3種病毒都是小RNA科病毒,容易產(chǎn)生變異,因此本試驗大量對比國內(nèi)已報道的3種病毒序列,結(jié)合國外學者的研究成果[20-22],選擇口蹄疫病毒的非編碼區(qū)域和塞內(nèi)卡病毒A、豬水皰病毒的3D序列并覆蓋口蹄疫O、A和亞洲Ⅰ血清型設(shè)計引物以及探針并合成質(zhì)粒。通過引物篩選和反應條件優(yōu)化,建立了三重熒光定量PCR方法,并用于臨床樣品的檢測,實現(xiàn)了單管同時檢測SVA、FMDV、SVDV。

為了鑒別引起豬出現(xiàn)水皰癥狀病毒,國內(nèi)外已有不少學者建立了多重熒光定量RT-PCR檢測方法,但鮮見SVA與FMDV及SVDV的三重TaqMan 熒光定量RT-PCR方法。史喜菊等人建立了CSFV、ASFV和SVDV多重熒光PCR檢測方法以及SVDV、VSV和FMDV的多重實時熒光PCR檢測方法,并比對了單重熒光定量與多重熒光定量檢測結(jié)果的差異以及RNA和質(zhì)粒檢測結(jié)果的區(qū)別,結(jié)果顯示兩項對比的擴增效率、特異性、敏感性并無明顯差異[23]。施開創(chuàng)等人建立的SVA與O型、A型及亞洲Ⅰ型FMDV多重熒光定量方法能對國內(nèi)流行的FMDV血清型和SVA進行區(qū)別[24]。

在驗證檢測方法的過程中,應用本研究建立的三重熒光定量PCR方法對來自四川、重慶的7份FMDV確診水皰液核酸樣品和1份SVA病毒純培養(yǎng)物核酸樣品進行驗證,100%符合。

資料顯示,吉林省也屬于口蹄疫免疫無疫區(qū),2018年1月-2022年1月中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也未發(fā)布任何有關(guān)吉林省發(fā)生口蹄疫疫情的相關(guān)信息。對吉林省部分地區(qū)的調(diào)查顯示,該地區(qū)O型口蹄疫抗體水平最低時超過國家標準11.6%[25]。豬水皰病已很多年未見大陸報道,有研究建立了豬病四重普通PCR方法,其中包含SVDV,將其建立的方法對48份臨床樣品進行檢測也未檢出SVDV[26]。對河北省及周邊部分地區(qū)進行過SVA的流行病學調(diào)查,其結(jié)果顯示在河北省規(guī)模豬場采集的總樣品中,SVA陽性率僅為0.5%,表明SVA并未在其調(diào)查區(qū)域大面積流行[27]。對吉林省塞內(nèi)卡病毒A流行病學調(diào)查后再無學者對吉林省水皰病毒進行流行病學相關(guān)調(diào)查研究[28]。本試驗收集了2020-2022年吉林省轄區(qū)內(nèi)的長春市九臺區(qū)、雙陽區(qū)、農(nóng)安縣、德惠市、公主嶺市、雙遼市、吉林市、永吉縣、磐石市、蛟河市、通化市、梅河口市和四平市地區(qū)的不明原因死亡仔豬和流產(chǎn)死胎組織檢測樣本共計267份和實驗室凍存血清檢測樣本30份。對297份樣品進行檢測,未檢測到3種致豬水皰癥狀病毒的核酸,與國內(nèi)報道的吉林省3種病毒的流行病學調(diào)查情況一致,提示SVA、SVDV和FMDV 3種致豬水泡癥狀病毒未在吉林省豬群中流行。