基于0507蛋白的山羊支原體山羊肺炎亞種抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立

李夢(mèng)磊,張銳錚,于皓同,張 琪,許信剛

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

山羊傳染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病[1-2]。該病主要臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、鼻腔有黏性分泌液,個(gè)別患病羊有鐵銹色鼻液,剖檢可見肺臟實(shí)質(zhì)硬變,甚至肺臟與胸膜發(fā)生粘連。本病在初春及秋冬季節(jié)多發(fā),天氣寒涼、營(yíng)養(yǎng)缺乏、羊群密集等均會(huì)誘發(fā)本病[3]。山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)是山羊傳染性胸膜肺炎的主要病原[4]。因支原體體外培養(yǎng)較為困難,直到1976年才分離到Mccp,并命名為F38,隨后在世界其他多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有Mccp的分離報(bào)道[5]。Mccp 0507基因?yàn)橐阎狹ccp的毒力基因,在長(zhǎng)期的進(jìn)化歷史中未發(fā)生變化,具有較高的保守性,可作為包被抗原的選擇。

近年來,隨著我國(guó)畜牧業(yè)的不斷發(fā)展,山羊傳染性胸膜肺炎的流行呈現(xiàn)上升趨勢(shì),嚴(yán)重制約著我國(guó)羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此,對(duì)傳染性胸膜肺炎開展檢測(cè)以及流行病學(xué)調(diào)查十分必要。本研究通過對(duì)Mccp 0507基因進(jìn)行基因克隆和原核表達(dá),將0507蛋白作為包被抗原,擬建立一種能夠快速檢測(cè)Mccp抗體的間接ELISA方法,進(jìn)一步豐富Mccp的檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株質(zhì)粒與血清樣品 pet-28a(+)質(zhì)粒、山羊支原體山羊肺炎亞種陽性病料由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。山羊支原體山羊肺炎亞種陽性血清、綿羊流產(chǎn)衣原體陽性血清、綿羊立克次體陽性血清、牛支原體陽性血清均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心血清庫(kù)提供; 山羊血清樣品282份,采自陜西省部分山羊養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 DNA/RNA提取試劑盒,天隆科技有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒,北京天根生物科技有限公司產(chǎn)品;2×TaqMaster Mix,艾科瑞生物工程有限公司產(chǎn)品;HindⅢ、BamHⅠ內(nèi)切酶,NEB公司產(chǎn)品;Ni-NTA His Bind Resin鎳柱,上海七海復(fù)泰生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 梯度PCR儀、凝膠成像系統(tǒng),莫納生物科技有限公司產(chǎn)品;恒溫振蕩器,蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;低溫高速離心機(jī),曦瑪離心機(jī)(揚(yáng)州)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI上收錄的Mccp 0507基因序列(CP006959.1),用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。

表1 0507基因引物序列

1.2.2 0507基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)載體的構(gòu)建 用DNA/RNA提取試劑盒提取Mccp陽性病料DNA,以提取的DNA為模板,用1.2.1的特異性引物進(jìn)行0507基因擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:2×TaqMaster Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,模板2 μL,其余用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 5 min;95℃ 30 s,56℃ 60 s,72℃ 30 s,共循環(huán)30次;72℃延伸10 min。分別用HindⅢ、BamHⅠ內(nèi)切酶對(duì)膠回收后的目的片段及pet-28a載體雙酶切后進(jìn)行連接。并將陽性重組質(zhì)粒命名為pet-28a-0507。

1.2.3 重組0507蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 將陽性重組質(zhì)粒pet-28a-0507轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,隔天挑取單菌落搖菌后進(jìn)行菌液PCR鑒定,篩選出陽性表達(dá)菌株。將表達(dá)菌株過夜活化后,按照1∶100比例轉(zhuǎn)接于含Kan+抗性的液體LB培養(yǎng)基中,在2 h左右測(cè)定OD600,當(dāng)OD600為0.6～0.8時(shí),加入不同體積的IPTG對(duì)表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo),使菌液中IPTG終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L。37℃誘導(dǎo)8 h后離心收集菌體,將菌體重懸后制樣,經(jīng)SDS-PAGE來確定最適誘導(dǎo)濃度。選擇最適IPTG誘導(dǎo)濃度,對(duì)菌液進(jìn)行2、3、4、5、6、7 h誘導(dǎo),對(duì)不同誘導(dǎo)時(shí)間的菌液進(jìn)行12 000 r/min離心1 min,收集菌體并重懸制樣,通過SDS-PAGE篩選菌液最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.4 重組0507蛋白表達(dá)形式分析、純化及復(fù)性 在已確定的最佳誘導(dǎo)條件下擴(kuò)大菌液量進(jìn)行大量誘導(dǎo),誘導(dǎo)后離心收集菌體與上清,用不超過原菌液體積1/25 PBS對(duì)菌體進(jìn)行重懸。對(duì)重懸菌液進(jìn)行超聲裂解后離心,收集上清與沉淀并分別制樣進(jìn)行SDS-PAGE分析,以此來確定重組0507蛋白的表達(dá)形式。采用鎳柱法純化對(duì)重組0507蛋白進(jìn)行純化,采用不同濃度梯度尿素對(duì)純化蛋白進(jìn)行復(fù)性,對(duì)復(fù)性后的蛋白測(cè)定濃度后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 重組0507蛋白的Western blot分析 將復(fù)性0507蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜后加入50 g/L脫脂奶粉封閉2 h,在稀釋后的一抗孵育液中4℃孵育過夜。次日洗膜后,在稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗孵育液中室溫孵育1 h,洗膜后均勻滴加ECL工作液,排出氣泡后開始曝光。

2 結(jié)果

2.1 0507基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增后,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示得到與Mccp 0507基因片段大小(924 bp)相一致的目的片段(圖1)。重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ、BamHⅠ雙酶切鑒定為陽性(圖2),表明重組質(zhì)粒pet-28a-0507構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.0507基因的擴(kuò)增M.DNA Marker DL 2 000;1.Amplification of 0507 gene

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.重組質(zhì)粒pet-28a-0507經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切

2.2 重組0507蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

用不同濃度IPTG對(duì)重組表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)。當(dāng)IPTG終濃度為0.4 mmol/L時(shí),重組蛋白的表達(dá)量最大(圖3);在重組表達(dá)菌株進(jìn)行不同時(shí)間誘導(dǎo),當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為4 h時(shí),重組蛋白的表達(dá)量最大(圖4)。

M.預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.誘導(dǎo)的pet-28a;2～6.37℃時(shí)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG終濃度條件下誘導(dǎo)7 h的重組pet-28a-0507;8.未誘導(dǎo)的重組pet-28a-0507

M.預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.未誘導(dǎo)的pet-28a;2～7.37℃、0.4 mmol/L的IPTG終濃度條件下誘導(dǎo)2、3、4、5、6、7 h的重組pet-28a-0507;8.未誘導(dǎo)的重組pet-28a-0507

2.3 重組0507蛋白表達(dá)形式的分析與純化

在最佳誘導(dǎo)條件的基礎(chǔ)上,對(duì)大量重組表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo),經(jīng)SDS-PAGE分析,重組0507蛋白主要存在于菌體超聲裂解沉淀中,將重組蛋白進(jìn)行蛋白純化后,得到大小約39 ku的目的蛋白(圖5)。

M.預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pet-28a-0507菌液上清;2.pet-28a-0507超聲裂解菌體上清;3.pet-28a-0507超聲裂解菌體沉淀;4.純化蛋白

2.4 重組蛋白的Western blot分析

經(jīng)Western blot分析得到了39 ku的特異性條帶,表明重組0507蛋白能與Mccp陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖6)。

M.預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～2.重組N蛋白; 3.陰性對(duì)照

2.5 抗原包被量、一抗和酶標(biāo)二抗稀釋度的確定

當(dāng)抗原包被量為3 μg/mL,一抗1∶100稀釋,二抗1∶2 500稀釋時(shí),P/N值達(dá)到最大,此時(shí)為最優(yōu)的工作條件(表2)。

2.6 其他試驗(yàn)條件優(yōu)化

當(dāng)封閉時(shí)間為60 min、一抗孵育時(shí)間為120 min、二抗孵育時(shí)間為60 min、TMB顯色時(shí)間為20 min時(shí),P/N值達(dá)到最大,此時(shí)為最優(yōu)工作條件。

2.7 間接ELISA臨界值的確定

陰性血清OD450的平均值為0.143,標(biāo)準(zhǔn)差為0.026,臨界值為0.221,即當(dāng)待檢血清OD450≥0.221時(shí),樣品為陽性;當(dāng)待檢血清OD450<0.221時(shí),樣品為陰性。

2.8 特異性試驗(yàn)

用已經(jīng)優(yōu)化好的ELISA檢測(cè)方法對(duì)牛支原體、綿羊立克次氏體、綿羊流產(chǎn)衣原體的陽性血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示陰陽對(duì)照成立,樣品檢測(cè)均為陰性。表明本試驗(yàn)所建立的ELISA檢測(cè)方法能特異性檢出Mccp。

2.9 靈敏性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行2倍倍比稀釋后,用已優(yōu)化好的檢測(cè)方法對(duì)稀釋后的血清進(jìn)行檢測(cè),當(dāng)樣品稀釋到1∶1 024時(shí)OD450為0.227,依然大于臨界值,表明本試驗(yàn)所建立的方法具有較低的檢測(cè)閾值。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)陰陽性血清進(jìn)行檢測(cè)后,計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)為2.8%～4.3%,批間變異系數(shù)為2.9%～5.4%,兩者的變異系數(shù)均小于10%,表明本試驗(yàn)所建立的方法結(jié)果較穩(wěn)定,具有較好的重復(fù)性。

2.11 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)陜西地區(qū)部分奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)收集到的282份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè),37份血清為陽性,山羊支原體山羊肺炎亞種抗體陽性率為13.1%。

3 討論

山羊傳染性胸膜肺炎與其他疾病具有相似的臨床癥狀,診斷較復(fù)雜,如小反芻獸疫也會(huì)造成肺部出血性間質(zhì)性炎癥、支氣管擴(kuò)張胸腔積液[7],多殺性巴氏桿菌也會(huì)造成肺部大面積損傷。本研究所建立的檢測(cè)方法對(duì)于診斷山羊支原體山羊肺炎亞種的感染具有重要意義。我國(guó)對(duì)山羊支原體山羊肺炎亞種的檢測(cè)主要采用病原分離及PCR鑒定。但支原體體外培養(yǎng)要求較高且培養(yǎng)周期長(zhǎng)不適合臨床疾病的快速診斷。PCR檢測(cè)具有特異性高的優(yōu)點(diǎn)但對(duì)人員與試驗(yàn)條件要求較高。而ELISA檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單且不需要特定設(shè)備,還可對(duì)大批量的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。因此本試驗(yàn)選擇建立一種間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)山羊支原體山羊肺炎亞種抗體進(jìn)行檢測(cè)。

由于支原體的基因組G、C含量較低,Mccp 87001全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn) GC含量為23.68%,91.2%的密碼子在擺動(dòng)位置有A或T,導(dǎo)致75.9%的基因有TAA終止密碼子[8],且在支原體表達(dá)時(shí)編碼色氨酸的TGA在大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)中為終止密碼子,若目的基因中含有TGA則表達(dá)時(shí)會(huì)直接終止,因此,在包被抗原的選擇上極為困難。經(jīng)查閱文獻(xiàn)及對(duì)NCBI上已公布的10株Mccp進(jìn)行序列比對(duì)[8],發(fā)現(xiàn)0507基因具有較高的保守性;且基因中僅在19-21位含1個(gè)TGA,可通過引物設(shè)計(jì)將其直接突變?yōu)橥瑯泳幋a色氨酸的TGG[9];表明0507能夠作為ELISA檢測(cè)的包被抗原,可用來進(jìn)行Mccp實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

本試驗(yàn)通過克隆0507基因,構(gòu)建原核表達(dá)載體建立了一種間接ELISA檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法特異性較強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好,對(duì)282份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)有37份血清為陽性,山羊支原體山羊肺炎亞種抗體陽性率為13.1%,我國(guó)山羊支原體山羊肺炎亞種抗體陽性率范圍在10%左右[10-12],本方法檢測(cè)的陽性率與其一致。說明本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法可用于Mccp的檢測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查。