核黃素參與水稻非生物脅迫的響應分析

夏清珊,周正琨,譚炎寧,劉選明,秦迪嵐,林建中*

(1 湖南大學 生物學院 植物功能基因組學和發(fā)育調(diào)控湖南省重點實驗室/國家耐鹽堿水稻技術(shù)創(chuàng)新中心,長沙 410082;2 湖南雜交水稻研究中心,長沙,410125;3 湖南省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心 國家環(huán)境保護重金屬污染監(jiān)測重點實驗室,長沙 410019)

水稻是中國的第一大糧食作物,隨著人口的增加和耕地面積的減少,提高糧食的產(chǎn)量是現(xiàn)代水稻研究的重中之重[1]。水稻在生長過程中,常會受到自然界各種不利環(huán)境的影響,如高溫、干旱、高鹽、低溫、氧化脅迫、大氣污染等非生物因素,病原微生物、害蟲等生物因素[2-3]。

這些逆境脅迫會引起水稻一系列形態(tài)和生理生化上的變化,影響水稻的正常生長發(fā)育,尤其會對產(chǎn)量和品質(zhì)帶來損失,嚴重時甚至可導致死亡[4-5]。水稻在生長過程中不能主動避開逆境脅迫帶來的危害,但在漫長的進化過程中已經(jīng)形成了一系列復雜且有序的機制來感知環(huán)境的變化、抵御環(huán)境帶來的不利影響[6-7]。

核黃素(riboflavin)又稱維生素B2(VB2),因其結(jié)構(gòu)中含有核糖且呈黃色,故取名核黃素[8-9]。核黃素是酶輔因子黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前體,FAD和FMN是許多氧化還原酶的輔基,參與許多生物過程,如生物鐘調(diào)節(jié)[10]、固氮[11]和激素代謝[12-13]。所有的植物和真菌以及大多數(shù)細菌都能產(chǎn)生核黃素[14],核黃素的基本功能就是以FMN或FAD的形式作黃素酶的輔基,與黃素蛋白或金屬黃素蛋白組成復酶,參與動植物、微生物以氧化還原反應為特征(包括氨基酸去氨基化作用、嘌呤降解、醛類物質(zhì)的降解、呼吸電子傳遞鏈等)的50多個生理生化過程,與機體的糖、脂類及蛋白質(zhì)的生物氧化有密切關(guān)系。植物體外施用核黃素可以促進許多生理代謝過程、減輕病害;同時,核黃素在植物體內(nèi)可以與各種多糖結(jié)合,形成糖基化核黃素。這些研究結(jié)果表明,植物可能有一種機制對核黃素在體內(nèi)進行重新分配,調(diào)控環(huán)境脅迫反應[15-17]。已有研究發(fā)現(xiàn),核黃素能夠增加植物的抗病性。例如,董漢松等[18]發(fā)現(xiàn)核黃素能作為植物抗病性激發(fā)子而激活免疫信號轉(zhuǎn)導通路,誘導植物對多種病害產(chǎn)生抗性。

最近,Hu等[19]發(fā)現(xiàn)核黃素影響水稻體內(nèi)活性氧的代謝平衡和葉綠體的發(fā)育。Tian等[20]在玉米中發(fā)現(xiàn),核黃素通過協(xié)同線粒體能量代謝和細胞周期來調(diào)控胚乳發(fā)育;異源過表達核黃素合成酶基因ZmRIBA1能顯著提高擬南芥的滲透脅迫耐受性。盡管有跡象顯示核黃素參與了植物非生物脅迫響應,但關(guān)于核黃素緩解非生物脅迫傷害的機制仍知之甚少。

因此,在高溫、鹽、堿、干旱等非生物逆境脅迫條件下,本研究測定了粳稻品種Kitaake和秈稻品種T98B的核黃素含量及其合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,并分析了施加外源核黃素后水稻對不同逆境脅迫的響應特征,以證實核黃素是否參與了調(diào)控植物非生物逆境響應的調(diào)控,為后續(xù)分子機制研究提供重要線索和啟示。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選擇粳稻品種Kitaake(Oryzasativassp.japonicavar. Kitaake)和秈稻品種T98B(Oryzasativassp.indicavar. T98B)進行模擬逆境處理、核黃素含量測定、RNA提取、生理指標測定等。水稻種子保存于4 ℃冰箱,而幼苗均在人工氣候箱(Conviron,加拿大)中培養(yǎng)。

1.2 水稻逆境處理

選用在水培溶液[21]中正常生長14 d的Kitaake和T98B幼苗進行逆境脅迫處理。其中,逆境脅迫處理參考本課題組方法[22],包括:(1)鹽脅迫處理,140 mmol/L NaCl的水培營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗;(2)滲透脅迫處理(模擬干旱脅迫),20% PEG的水培營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗;(3)氧化脅迫處理,4 μmol/L甲基紫精(MV) 的水培營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗;(4)堿脅迫處理,50 mmol/L 的NaHCO3+Na2CO3水培營養(yǎng)液處理幼苗;(5)高溫脅迫處理,將生長于正常水培溶液中的幼苗置于45 ℃的高溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。另外,在各逆境脅迫處理培養(yǎng)溶液中添加核黃素[15](10 μmol/L)作為平行處理,用于考察施加外源核黃素對逆境脅迫響應的影響。處理時間為6～12 d,直至出現(xiàn)明顯的逆境脅迫表型為止,然后進行相關(guān)指標觀測。

1.3 觀測指標及方法

1.3.1 表型和生長指標

脅迫處理結(jié)束后,觀察植株表型、測量株高和鮮重并統(tǒng)計存活率[21]。(1)株高:分別取脅迫處理前后的水稻幼苗(選取時間與逆境處理時間保持一致),測量從根部到莖葉頂部的高度。(2)鮮重:分別取脅迫處理前后的水稻幼苗(選取時間與逆境處理時間一致),擦干根和葉表面水分,稱取單株幼苗重量。

1.3.2 核黃素含量

參照Hiltunen等[23]的方法并加以改進,進行核黃素含量測定。主要步驟如下:稱取0.1 g植物材料,用液氮研磨,然后懸浮于0.5 mL甲醇/二氯甲烷(9∶10)中,在4 ℃溫和攪拌下孵育2 h,離心取上清待測。樣品在高效液相色譜系統(tǒng)1100(安捷倫,美國)上進行分析,使用Agilent HC-C18柱(高250 mm,直徑4.6 mm),以1 mL/min的速度在27 min內(nèi)以水和甲醇(5%～90%)的線性梯度洗脫。用熒光法(λex= 265 nm,λem= 530 nm)檢測核黃素并用正品標準確認。

1.3.3 實時熒光定量PCR (QRT-PCR)分析

按照引物設(shè)計原則,利用軟件Premier 5.0設(shè)計核黃素合成相關(guān)基因的特異性引物(表1)。采用Trizol試劑(No.9109,TaKaRa)提取水稻幼苗的總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后參照文獻[24]采用qRT-PCR分析核黃素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。

表1 PCR引物序列

1.3.4 生理指標

生長14 d的水稻幼苗用鹽和高溫脅迫處理0,3,5,7 d,取幼苗地上部分用于后續(xù)生理指標檢測。其中,參照 Cao等[25]的電導儀法測定水稻葉片相對電導率;采用丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒 (BC0025;Solarbio)、過氧化氫(H2O2)含量檢測試劑盒(BC3590;Solarbio)和過氧化氫酶檢測試劑盒(S0051;Beyotime)分別測定鹽和高溫脅迫處理幼苗中的MDA和H2O2含量,以及過氧化氫酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示,采用SPSS23.0統(tǒng)計分析軟件,顯著性水平為0.05,采用GraphPad Prism 8計算機軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源核黃素對水稻非生物脅迫響應的影響

Kitaake 和T98B水稻幼苗在鹽、高溫、滲透、堿和氧化等5種非生物脅迫處理6～12 d后的生長情況如圖1所示。其中,在鹽脅迫處理8 d后,Kitaake和T98B均表現(xiàn)出了生長受到抑制和葉片壞死等明顯的脅迫表型;施加外源核黃素(10 μmol/L)則顯著提高了T98B的耐鹽性,其幼苗存活率、高度和鮮重比鹽脅迫分別顯著提升了約75%、9%和11%,而Kitaake的改善效果不明顯(圖1,A、F);在高溫(45 ℃)處理8 d后,Kitaake 和T98B均表現(xiàn)出了葉片卷曲和干枯的脅迫表型,而施加外源核黃素則小幅度提高了Kitaake的高溫耐受性,而對T98B的改善效果不明顯,但是Kitaake 和T98B幼苗的鮮重均顯著增加(圖1,B、F)。在滲透脅迫處理6 d后,Kitaake 和T98B均表現(xiàn)出了明顯的脅迫表型,且Kitaake受傷害更嚴重;施加外源核黃素則使T98B則對滲透脅迫更敏感,尤其是幼苗存活率和鮮重顯著降低,而對Kitaake的滲透脅迫響應沒有明顯影響(圖 1,C、F)。

A～E. 生長14 d的粳稻Kitaake和秈稻T98B施加或不施加外源核黃素時分別進行鹽(140 mmol/L的NaCl處理8 d)、高溫(45 ℃處理8 d)、滲透(20% PEG處理6 d)、堿(50 mmol/L的NaHCO3+Na2CO3處理10 d)和氧化脅迫處理(4 μmol/L甲基紫精處理12 d)的表型分析;F. 秈稻和粳稻幼苗在不同脅迫處理下的存活率、幼苗高度和鮮重,其中的數(shù)值代表平均值±標準方差(n=40,t檢驗,*和**分別表示施加與不施加外源核黃素處理間在0.05和0.01水平存在顯著性差異)。

在堿脅迫處理10 d后,Kitaake 和T98B均表現(xiàn)出脅迫表型,且施加外源核黃素對脅迫表型均沒有影響(圖1,D、F)。在氧化脅迫處理12 d后,Kitaake和T98B才表現(xiàn)出脅迫表型,且Kitaake受傷害更嚴重;施加外源核黃素對2個材料幼苗的脅迫表型均沒有明顯影響(圖1,E、F)。這些結(jié)果說明,核黃素能明顯改善水稻對鹽和高溫的耐受性,而對氧化和堿脅迫響應沒有影響,反而提高了水稻對滲透脅迫的敏感性;同時,在逆境脅迫響應和外源核黃素作用效果方面,秈稻和粳稻亞種之間也存在一定程度的差異?？傊?核黃素不同程度地參與了水稻非生物脅迫響應的調(diào)控。

2.2 非生物脅迫處理下水稻幼苗核黃素含量的變化

Kitaake和T98B水稻幼苗在鹽、滲透、高溫、氧化和堿等5種非生物脅迫處理后,分別在處理0,3,7 d取樣檢測各脅迫處理前后幼苗中核黃素的含量。檢測結(jié)果表明在遭受5種非生物逆境脅迫后,粳稻Kitaake幼苗體內(nèi)的核黃素含量均不同程度升高,尤其是在鹽、滲透和高溫脅迫下核黃素含量升高最為明顯,在處理7 d時分別為未處理時的9,5,7倍(圖2)。同樣,秈稻品種T98B在遭受5種非生物脅迫后體內(nèi)核黃素含量也呈不同程度的升高,但是在滲透和堿脅迫下的升高不顯著(圖 3)。以上結(jié)果說明,鹽、高溫和氧化等非生物脅迫均能顯著促進水稻體內(nèi)核黃素的合成和積累,滲透和堿脅迫也能不同程度促進核黃素的合成和積累,但是在秈稻和粳稻亞種間存在較大差異。值得說明的是,粳稻Kitaake的核黃素合成受逆境脅迫促進程度較秈稻T98B更為顯著。因此,筆者猜測核黃素參與了水稻對這些非生物脅迫響應的調(diào)控。為了進一步研究核黃素參與脅迫響應的調(diào)控,后續(xù)研究主要聚焦于對促進核黃素合成最為顯著的鹽和高溫脅迫。

A～E. 鹽(140 mmol/L的NaCl)、滲透(20% PEG)、高溫(45 ℃)、氧化脅迫處理(4 μmol/L甲基紫精)和堿(50 mmol/L的NaHCO3+Na2CO3)處理下水稻幼苗體內(nèi)核黃素熒光強度;F. 各個脅迫處理前后幼苗核黃素含量,其中的數(shù)值代表平均值±標準方差(n=3,t檢驗,* P <0.05,** P <0.01)。下同。

圖3 秈稻T98B幼苗在不同非生物脅迫下核黃素熒光強度和含量變化

2.3 鹽和高溫脅迫對水稻核黃素合成相關(guān)基因表達的影響

通過生物信息學和序列同源性分析,筆者從水稻基因組中找到與核黃素合成代謝相關(guān)的8個基因(Os05g0460600、Os02g0572400、Os08g0481950、Os03g0117200、Os04g0177400、Os12g0541000、Os04g0497400、Os03g0801700)。其中,Os05g0460600、Os02g0572400和Os08g0481950編碼ribA(鳥苷三磷酸合成酶);Os03g0117200和Os04g0177400編碼ribD(5-氨基-6-核糖氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮);Os12g0541000編碼ribE(5-氨基-6-核糖氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5′-磷酸);Os04g0497400編碼ribH(6,7二甲基-8-核糖二羥基蝶啶);Os03g0801700編碼FADs(FAD合成酶)。將Kitaake和T98B幼苗進行鹽和高溫處理7 d,然后測定8個核黃素合成相關(guān)基因在脅迫處理前后的轉(zhuǎn)錄水平。qRT-PCR結(jié)果表明,在鹽和高溫脅迫下水稻大部分核黃素合成相關(guān)基因的表達量均不同程度上調(diào)(圖4)。

*和**分別表示處理前后在0.05和0.01水平有顯著性差異。

其中,在高溫脅迫下,Kitaake中8個基因均顯著上調(diào),而T98B中僅3個基因顯著上調(diào);在鹽脅迫下,Kitaake和T98B中的上述基因表達變化趨勢基本類似。這些結(jié)果說明,鹽和高溫脅迫能誘導核黃素合成基因的表達,從而促進核黃素在水稻體內(nèi)的合成和積累。同時也可以看出,秈稻和粳稻在響應高溫脅迫時,其核黃素合成基因的表達有明顯差別,粳稻的上調(diào)幅度更大,說明粳稻對高溫脅迫較秈稻更敏感。

2.4 核黃素對鹽和高溫脅迫下水稻幼苗生理變化的影響

水稻受到非生物脅迫后,體內(nèi)一些基本的生理指標如相對電導率、MDA、H2O2含量以及過氧化氫酶(CAT)的活性等會出現(xiàn)紊亂,并能反映出植物體所受的傷害程度。Kitaake和T98B幼苗在鹽和高溫脅迫下這些生理指標測定結(jié)果(圖5)表明,在未進行鹽和高溫處理時,水稻幼苗的相對電導率沒有明顯的差異;施加外源核黃素后,除了在T98B的高溫脅迫中沒有效果外,均能有效降低其余處理、水稻幼苗相對電導率(圖 5,A、B)。同樣,核黃素除了在T98B的鹽脅迫中沒有明顯效果外,均能有效降低其余處理、材料幼苗的MDA含量(圖 5,C、D)。這些結(jié)果說明,核黃素能有效降低鹽和高溫脅迫對細胞膜的傷害,提高水稻的逆境耐受性,且該結(jié)果與前面的幼苗存活率測定結(jié)果(圖1,A、B和F)一致。

圖5 水稻幼苗在140 mmol/L NaCl(C,E,G)和45 ℃高溫(D,F,H)脅迫下生理指標的變化

另外,植物在逆境下會積累活性氧如H2O2,若不及時清除會導致嚴重的氧化損傷。過氧化氫酶在逆境H2O2的清除中起著重要作用。Kitaake和T98B幼苗過氧化氫酶活性和H2O2含量測定顯示,核黃素能有效提高鹽和高溫脅迫下水稻體內(nèi)的過氧化氫酶活性,并降低其體內(nèi)H2O2含量(圖 5,E～H)。

該結(jié)果說明,核黃素能提高水稻體內(nèi)活性氧清除酶的活性,降低體內(nèi)活性氧的積累,減輕或消除因鹽和高溫脅迫而導致的氧化損傷?？傊?在鹽和高溫等逆境脅迫下,水稻通過促進體內(nèi)核黃素的合成和積累來改善逆境脅迫的耐受性。

3 討 論

植物本身可以合成核黃素,且主要以酶輔因子FMN和FAD的形式參與許多體內(nèi)的生化過程[12-13]。Ouyang等[26]和Hedtke等[27]發(fā)現(xiàn)核黃素缺乏會導致擬南芥的葉色異常。最近,Hu等[19]發(fā)現(xiàn)核黃素影響水稻細胞分裂素的穩(wěn)態(tài)和葉綠素的合成,進而調(diào)控葉綠體和葉色的形成。Tian等[20]發(fā)現(xiàn)核黃素通過協(xié)同線粒體能量代謝和細胞周期來調(diào)控玉米胚乳發(fā)育。本研究分析了外源核黃素對秈稻和粳稻響應鹽、滲透、高溫、氧化和堿等5種非生物脅迫的影響,同時分析了這些逆境脅迫對水稻體內(nèi)核黃素合成的影響。研究發(fā)現(xiàn),施加外源核黃素能夠提高水稻對鹽和高溫脅迫的耐受性,且5種逆境脅迫均能不同程度地促進核黃素在水稻中的積累,尤其鹽和高溫脅迫的促進效果最明顯。隨后的qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),鹽和高溫脅迫能顯著誘導水稻幼苗中大部分核黃素合成相關(guān)基因的表達,進一步證實鹽和高溫脅迫能促進核黃素在水稻體內(nèi)的合成和積累。值得指出的是,高溫脅迫下核黃素合成基因的表達在粳稻中上調(diào)幅度更大,說明粳稻對高溫脅迫較秈稻更敏感。在生產(chǎn)中,粳稻適于在北方溫帶地區(qū)栽培,而秈稻適于南方熱帶和亞熱帶地區(qū)栽培,就已說明粳稻較秈稻對高溫更敏感,這與本研究結(jié)果高度一致。進一步的生理指標檢測發(fā)現(xiàn),核黃素能提高鹽和高溫脅迫下水稻體內(nèi)的過氧化氫酶活性,并降低其體內(nèi)H2O2含量。Hu等[19]最近也發(fā)現(xiàn)核黃素合成關(guān)鍵酶之一的二氧四氫喋啶合成酶的缺失,會導致水稻體內(nèi)核黃素合成下降和活性氧積累。這些結(jié)果均說明,核黃素能通過促進體內(nèi)活性氧的清除,消除氧化損傷,提高植物的逆境脅迫耐受性。

同時,核黃素對植物脅迫響應的影響存在較大差異。在研究中發(fā)現(xiàn),核黃素能顯著提高水稻的耐鹽性,而對耐堿性沒有影響。雖然在粳稻Kitaake中,堿脅迫也能一定程度提高核黃素合成基因的表達,但是外源核黃素并沒有改良其耐堿性。筆者認為可能的原因與核黃素自身的理化性質(zhì)有關(guān)。核黃素微溶于水且溶液易變質(zhì)[28],在堿性溶液中或遇光變質(zhì),在鹽溶液中溶解性提高。在鹽脅迫下,由于核黃素溶解度提高,使其能充分參與調(diào)控鹽脅迫響應,提高水稻耐鹽性。在堿脅迫條件下,由于溶解度低或結(jié)構(gòu)被破壞,從而無法參與調(diào)控堿脅迫響應。另外,筆者也推測在氧化脅迫條件下,可能造成了核黃素的結(jié)構(gòu)破壞,使其無法在氧化脅迫響應中發(fā)揮作用。本研究中核黃素除了在鹽脅迫下能改善T98B的幼苗高度外,對于其余處理幼苗高度的影響不明顯,可能是核黃素的濃度還沒有達到促進幼苗生長的程度。當然,這些猜測還有待進一步研究和證實。雖然滲透脅迫(模擬干旱)能促進核黃素在水稻體內(nèi)的合成,但是外源施加核黃素卻提高了水稻對滲透脅迫的敏感性,意味著核黃素負調(diào)控水稻的滲透或干旱脅迫耐受性。最近,Tian等[20]將玉米核黃素合成酶基因ZmRIBA1異源過表達于擬南芥,發(fā)現(xiàn)核黃素合成增加,并改善了轉(zhuǎn)基因植株的滲透脅迫耐受性。這些結(jié)果說明,核黃素參與滲透或干旱脅迫響應的機制與其他非生物脅迫響應不同,而且在不同物種間還存在差異,但其背后的分子機制尚不清楚,仍需要進一步研究。

總之,本研究初步證實核黃素在水稻的非生物脅迫響應中發(fā)揮著重要作用。特別是發(fā)現(xiàn),核黃素正調(diào)控水稻鹽和高溫脅迫的耐受性,而負調(diào)控滲透或干旱脅迫耐受性。該研究結(jié)果為進一步探究核黃素參與非生物脅迫響應的分子機制提供了線索,也為耐逆水稻的培育提供了啟示。