骨肉瘤雙硫死亡相關lncRNA 預后預測模型的構建與驗證*

李威材 秦剛 何凱毅 蘇國威 劉金富 肖世富 范以東 吳廣濤 劉俊良

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年時期[1]，其惡性程度高，病變迅速，具有高度的轉移傾向[2]。目前，新輔助化療聯(lián)合手術切除療法和術后輔助化療是OS 的主要治療方法[3]。近年來，盡管OS 治療進展提高了患者的生存率，但由于基因組的復雜性和不穩(wěn)定性對OS 患者臨床治療產(chǎn)生的重大影響，轉移性和復發(fā)性OS 患者的生存率仍然較低[4]。有報道局限性OS 患者的長期生存率約68%，而復發(fā)或轉移性OS 患者的生存率仍低于30%[5]，嚴重影響患者的生存質量。因此，迫切需要探索可靠有效的預后生物標志物和治療靶點，以指導OS 的臨床決策和個性化治療，從而提高OS 患者的生存率。

長非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度超過200 個核苷酸的常見非編碼RNA，可通過調節(jié)基因表達發(fā)揮生物功能，在癌癥的發(fā)展和進展中發(fā)揮著重要作用[6]。雙硫死亡是由二硫化物應激引起的一種全新的細胞死亡形式，其引起細胞死亡的機制不同于已知的鐵死亡、細胞凋亡、自噬和壞死性凋亡等多種細胞死亡調節(jié)機制；當高表達的SLC7A11 與葡萄糖饑餓相結合時，細胞內會產(chǎn)生大量的二硫化物分子，誘導嚴重的二硫化物應激，最終導致肌動蛋白網(wǎng)絡崩潰和細胞死亡[7]。溶質載體家族7 成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）是一種人體胱氨酸/谷氨酸反轉運蛋白，其高表達水平與OS 細胞的增殖和遷移密切相關[8]。然而，雙硫死亡基因在OS 和其他癌癥中的機制和臨床作用尚不清楚，關于雙硫死亡相關 lncRNA（disulfidptosis-related lncRNAs，DRLncs）在OS 中所起作用的研究仍不明確。因此，深入研究DRLncs 在OS 中的作用機制對OS 患者的診斷、治療和預后具有重要的臨床價值。

本研究旨在通過生物信息學分析探討DRLncs在OS 預后中的作用以及與免疫微環(huán)境和藥物敏感性之間的關系，為OS 的臨床治療和預后機制的研究提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從加利福尼亞大學圣克魯茲分校（UCSC）基因組瀏覽器下載88 例OS 患者的mRNA-seq 及臨床數(shù)據(jù)和396 例正常肌肉骨骼組織樣本，下載時間為2023年3 月。10 個雙硫死亡相關基因（disulfidptosis-related genes，DRGs）從已發(fā)表的文章中獲取[7]。

1.2 方法

1.2.1 差異表達DRGs 的篩選 排除3 例無完整生存數(shù)據(jù)的OS 組織樣本后對數(shù)據(jù)進行批次矯正獲取OS 相關的DRGs 表達矩陣，通過微陣列數(shù)據(jù)的線性模型（limma）包進行差異分析，以獲得差異表達的DRGs。篩選標準為P＜0.05 和|logFC|＞1。

1.2.2 OS 相關DRLncs 的篩選及共表達網(wǎng)絡的構建 使用R 軟件“l(fā)imma”包對差異表達DRGs 和lncRNA進行共表達分析獲得DRLncs，以|Pearson 相關系數(shù)|＞0.4 和P＜0.001 為篩選標準[9]。

1.2.3 風險預后模型的構建 將OS 樣本隨機分為訓練組（n=43）和測試組（n=42），所有患者的臨床數(shù)據(jù)見表1，訓練組和驗證組中患者的臨床特征比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。使用R 軟件“survival”包對OS 數(shù)據(jù)進行單變量Cox 回歸分析篩選出與OS 預后相關的DRLncs。在訓練組中進行LASSO 回歸分析，通過1 000 倍交叉驗證進一步篩選出關鍵的DRLncs。獲得的DRLncs 納入多變量Cox 回歸分析，以基于訓練組中的最低赤池信息量準則（Akaike information criterion，AIC）值對模型進行優(yōu)化，鑒定出用于構建OS 患者預后模型的DRLncs。使用以下公式確定了各分組中每個患者的風險評分，其中Coef（lncRNAi）表示相關系數(shù)，Expr（lncRNAi）表示DRLncs 的表達量。

表1 所有OS 患者的臨床數(shù)據(jù)

表2 測試組與驗證組中患者的臨床特征

1.2.4 風險預后模型的驗證 根據(jù)風險評分的中位數(shù)將各樣本組分為高、低風險組，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）驗證分組的準確性，對各分組進行生存分析、ROC 曲線以驗證模型的準確性。通過獨立預后分析，鑒定出獨立預后的因素。最后構建列線圖預測OS 患者的 1、3 和5 年生存率，并用校準曲線評估列線圖的預后價值。

1.2.5 腫瘤微環(huán)境和免疫細胞浸潤的評估 使用R軟件“l(fā)imma”“estimate” 和“ggpubr”包進行腫瘤微環(huán)境分析。利用單樣本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis,ssGSEA）分析總樣本組中高、低風險組患者與免疫細胞和免疫功能的差異，使用“ggboxplot”包將結果可視化。

1.2.6 藥物敏感性分析 為篩選治療OS 患者的潛在藥物，本研究使用R 軟件“l(fā)imma”、“ggpubr”和“oncoPredict”包對總樣本數(shù)據(jù)進行藥物敏感性分析，以P＜0.001 為篩選標準，預測兩個風險亞組OS 患者潛在治療藥物的敏感性。

1.2.7 qRT-PCR 檢測 為了進一步生物信息學分析的結果，本研究選取近10 年自廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院OS 患者的腫瘤組織及健康人的正常組織各30 例以用于進行qRT-PCR 實驗驗證。使用Trizol 試劑盒（購自美國Invitrogen 公司）從各受試組織中提取總RNA。使用HiFiScript cDNA 第一條鏈合成試劑盒（購自江蘇省泰州市康為世紀公司）將總RNA 合成為cDNA。CFX ConnectTM熒光定量PCR 儀（購自美國Bio-Rad 公司）以95℃ 15 min 1 個循環(huán)，95℃10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s 40 個循環(huán)反應程序下進行qRT-PCR 定量每個基因的表達水平，β-actin 作為內參，并用2-△△CT方法計算。引物序列見表3，實驗驗證的OS 患者臨床數(shù)據(jù)表4 所示。

表3 RERG-IT1、AL035446.1、AC010894.1 和β-actin 引物序列

表4 實驗驗證中OS 患者的臨床數(shù)據(jù)

1.3 統(tǒng)計學分析

采用R.4.2.3、GraphPad Prism v8.2.1 和SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。結果采用（±s）表示，通過單因素方差分析確定統(tǒng)計學顯著性。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 OS 差異DRGs 和共表達DRLncs 的鑒定

共鑒定出RPN1、SLC7A11、GYS1、NDUFS1、NDUFA11、NCKAP1 6 個OS 差異表達DRGs（圖1A）。通過共表達分析，鑒定出125 個OS 相關的DRLncs（圖1B）。

圖1 OS 數(shù)據(jù)樣本中差異DRGs 的鑒定

2.2 風險預測模型的構建

單變量Cox 回歸確定了AC005082.1、AC13910 0.2、AL035446.1、AC010894.1、RERG-IT1 5 種與OS預后相關的DRLncs（圖2A）。通過LASSO 回歸和多因素Cox 回歸分析最終鑒定出3 個DRLncs 參與預后模型的構建（圖2B～2D，表5）。使用以下公式計算風險評分：（0.678087244×RERG-IT1 expression）-（1.317581601×AL035446.1 expression）-（1.262917565×AC010894.1 expression），根據(jù)風險評分中位值分別將總樣本組、訓練組和驗證組分為高風險組和低風險組。

圖2 風險預后模型的構建

表5 多變量Cox 回歸分析結果

2.3 風險預后模型的驗證

PCA 結果表明，該風險預后預測模型能有效區(qū)分OS 患者的風險狀態(tài)（圖3）。生存分析顯示，各分組中高風險組患者的死亡率均高于低風險組（圖4）；死亡風險隨著風險評分的增加逐漸上升（圖5）。風險熱圖提示，隨著風險值的增加，RERG-IT1 的表達水平逐漸增高，而AL035446.1 和AC010894.1 的表達水平逐步降低（圖6）。ROC 曲線顯示，各分組在1、3 和5 年時均顯示較高的曲線下面積（area under curve，AUC），見圖7。單因素和多因素Cox 回歸分析表明，風險評分和腫瘤轉移均可作為OS 患者獨立的預后因素（圖8）。利用獨立預后因素構建列線圖（圖9A），結合校準曲線（圖9B），表明預測結果與實際OS 生存率之間具有良好的一致性。

圖3 主成分分析結果

圖4 生存分析結果

圖5 風險評分及生存狀態(tài)

圖6 風險熱圖

圖7 ROC 曲線

圖8 單因素和多因素Cox 回歸分析結果（P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義）

圖9 列線圖與校準曲線

2.4 風險預后模型與OS 患者的免疫微環(huán)境分析

腫瘤微環(huán)境分析結果顯示，高危OS 患者的免疫評分和總分低于低?；颊撸▓D10A）。免疫細胞浸潤箱線圖（圖10B）顯示，與低風險患者相比，單核細胞和M2 巨噬細胞在高風險組顯著下調（P＜0.05）。ssGSEA分析表明，在高風險組中，細胞溶解活性、APC 共同抑制、APC 共同激活和檢查點等9 種免疫相關功能顯著下調（圖10C）。

圖10 DRLncs 預后模型與腫瘤微環(huán)境、免疫細胞浸潤和免疫功能之間的相關性

2.5 OS 藥物敏感性分析

如低風險患者對瑞博西尼比高危組患者更敏感；然而高?；颊邉t對BI-2 536 顯示較高的敏感性（圖11）。本研究結果表明，瑞博西尼和BI-2 536 可能是OS 的潛在治療藥物。

圖11 高風險組和低風險組患者之間的藥物敏感性分析（P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義）

2.6 qRT-PCR 結果

qRT-PCR 結果顯示，與正常組織相比，RERGIT1 在OS 組織中顯著上調，而AL035446.1 和AC0 10894.1 則顯著下調（圖12），結果與此前分析結果一致，進一步驗證了生物信息學分析的準確性。

圖12 qRT-PCR 實驗結果

3 討論

OS 是兒童和青少年常見的惡性骨腫瘤，其復發(fā)率高、易發(fā)生轉移，常導致OS 患者不良的預后[10]。因此，亟需尋找與OS 相關的新生物標志物以進一步改善OS 患者的預后。雙硫死亡是一種新的細胞死亡形式，二硫化物的代謝可影響細胞的增殖與凋亡。二硫化物的代謝與氧化還原狀態(tài)的調節(jié)密切相關，氧化還原狀態(tài)是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[11]。腫瘤細胞通過改變細胞內氧化還原環(huán)境來提高其存活率和耐受性[12]。二硫化物在腫瘤治療中可能具有潛在的應用價值。Yue 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，二烯丙基二硫化物可通過調節(jié)PI3K/Akt/mTOR 信號通路抑制人OS 細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移。因此，針對雙硫死亡的治療可能成為OS 臨床治療的新策略。lncRNA 與OS 的發(fā)生發(fā)展密切相關，可對OS 患者的預后進行預測[14]。然而，目前鮮見關于OS 中DRLncs 預后價值的研究報道。

本研究基于3 個DRLncs 構建了預后預測模型，在此模型中，RERG-IT1 可能是OS 預后不良的風險因子，而AL035446.1 和AC010894.1 則是保護因子，然而模型中3 個DRLncs 與OS 的相關研究鮮見報道。對此，本研究進行了實驗驗證，進一步驗證了生物信息學分析的準確性。

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）在OS 細胞的增殖和侵襲中發(fā)揮著重要作用[15]，lncRNA可通過影響TME 進而影響腫瘤的進展[16]。本研究顯示，高風險組患者的免疫評分較低，與腫瘤的不良預后相關[17]。免疫浸潤分析顯示，高風險組OS 患者中的單核細胞和M2 巨噬細胞顯著下調。低免疫評分的患者中M2 巨噬細胞水平顯著降低，與風險評分呈負相關[18]。單核細胞浸潤水平的降低常導致較差的免疫環(huán)境，從而促進腫瘤遷移[19]。9 種免疫相關功能在高風險組中下調，進一步驗證了TME 和免疫浸潤分析的結果。因此，本研究認為低免疫評分和弱免疫狀態(tài)可能與OS 患者的不良預后有關。

本研究首次構建了OS 的DRLncs 預后模型，為OS 的臨床治療和預后機制研究提供了新方向。但本研究仍存在局限性：1）OS 數(shù)據(jù)樣本過于單一，缺乏lncRNA 表達譜，易出現(xiàn)誤差；2）DRLncs 在OS 診斷和治療中的潛在機制需更多的實驗進行驗證。

本文無影響其科學性與可信度的經(jīng)濟利益沖突。