以水蚤為指示生物探究表面活性劑十二烷基三甲基氯化銨的急性毒性

張軍政,靳淑博,楊治廣,陳 碩,郝晴圓,楊靜也,王晨曦,賀曉曉,孫文浩,孔令展

(河南城建學(xué)院 河南省水體污染防治與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 平頂山 467000)

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展,越來(lái)越多的新化合物被合成出來(lái),這些化合物的出現(xiàn)對(duì)于人類有利有弊,對(duì)環(huán)境也如此。其對(duì)環(huán)境會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行判斷。

水蚤(大型蚤)具有個(gè)體小、繁殖快、易獲取、便于操作、二次處理量小等優(yōu)點(diǎn),利用水蚤對(duì)水生生物安全的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)是一種快速高效的途徑。張晶晶等[1]對(duì)比了吡丙醚、氟鈴脲、除蟲脲、滅蠅胺、噻嗪酮、蟲酰肼6種昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及吡蟲啉、三唑磷、高效氯氰菊酯、氟蟲腈、丁硫克百威原藥5種殺蟲劑對(duì)大型蚤的急性毒性。Claudia等[2]研究并建立了農(nóng)藥對(duì)大型蚤的急性毒性模型。Tinkov等[3]研究了有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)對(duì)大型蚤急性毒性的影響。Xu等[4]研究了塑料顆粒對(duì)大型蚤的急性毒性。王倓倓[5]研究了多氯聯(lián)苯醚在巢湖中分布特征及其在大型蚤體內(nèi)的富集轉(zhuǎn)化和毒性效應(yīng)。高磊[6]研究了印染廢水的生物毒性測(cè)試方法。王娜[7]及胡奕[8]研究了納米銀對(duì)大型蚤毒性的影響。堵錫華等[9]研究了苯砜基乙酸酯類化合物對(duì)大型蚤急性毒性的結(jié)構(gòu)信息指數(shù)。李渭印等[10]進(jìn)行了次氯酸鈉、表面活性劑、苯酚對(duì)大型蚤的急性毒性研究。李建鳳等[11]對(duì)芳烴類化合物結(jié)構(gòu)與大型蚤急性毒性關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)的研究。廉潔等[12]探究了三氯生對(duì)蚤狀溞急性毒性。

十二烷基三甲基氯化銨是一種無(wú)色或淡黃色膠體,化學(xué)式C15H34NCl,可溶于水和乙醇。它的化學(xué)穩(wěn)定性良好,耐熱、耐光、耐壓、耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿,具有優(yōu)良的滲透性、乳化性、柔軟性、抗靜電性和殺菌性能,因此在化工等領(lǐng)域使用較為廣泛。十二烷基三甲基氯化銨在使用過程中會(huì)通過各種途徑進(jìn)入自然水體,對(duì)水生態(tài)產(chǎn)生影響。利用水體中常用的指示生物水蚤探究十二烷基三甲基氯化銨對(duì)水生生物的影響較為方便安全,同時(shí)與利用個(gè)體較大的魚等動(dòng)物相比還能節(jié)約資源,保護(hù)環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蚤種

試驗(yàn)水蚤為河北省邢臺(tái)市魚藝傳統(tǒng)金魚漁場(chǎng)引種并在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過3年穩(wěn)定馴化培養(yǎng)后的水蚤。隨機(jī)選取20只健康母蚤,將母蚤置于水族箱中進(jìn)行繁殖培養(yǎng),培養(yǎng)水采用靜置3 d的自來(lái)水,水族箱置于陽(yáng)光散射光能夠照射到的地方,用小球藻喂養(yǎng)。種群密度為每升水約50只,溫度為室溫。經(jīng)過母蚤孤雌生殖純系培養(yǎng)3代以后,選用培養(yǎng)3代以上的健康幼蚤為試驗(yàn)蚤。

1.2 試驗(yàn)試劑

重鉻酸鉀為河北省保定化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的分析純?cè)噭?十二烷基三甲基氯化銨為天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)的分析純?cè)噭?/p>

1.3 試驗(yàn)儀器設(shè)備

水族箱材質(zhì)為有機(jī)玻璃,規(guī)格為900 mm×600 mm×300 mm;分組試驗(yàn)采用100 mL常規(guī)玻璃燒杯;藥品和水蚤的稱量使用萬(wàn)分之一電子分析天平。

1.4 試驗(yàn)方法

參考《GB/T 16125—2012大型溞急性毒性實(shí)驗(yàn)方法》進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。試驗(yàn)期間不喂食,定時(shí)觀察記錄水蚤的死亡數(shù),以水蚤心臟停止跳動(dòng)為死亡標(biāo)準(zhǔn),得出半致死濃度24 h LC50。

1.5 試驗(yàn)蚤的敏感性測(cè)試

采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)《水質(zhì)——大型蚤運(yùn)動(dòng)抑制的測(cè)定》(ISO6341:1996)進(jìn)行敏感性測(cè)試。以重鉻酸鉀作為敏感性測(cè)定毒物,對(duì)水蚤進(jìn)行24 h LC50測(cè)試試驗(yàn),檢驗(yàn)所用水蚤是否符合敏感性要求。重鉻酸鉀對(duì)水蚤的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見表1。3次試驗(yàn)水蚤的24 h LC50平均值為1.304 mg/L,3次試驗(yàn)濃度變化較小,誤差為0.54%,說(shuō)明試驗(yàn)水蚤具有非常好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。重鉻酸鉀對(duì)水蚤24 h有效濃度的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)值為0.9～2.0 mg/L,說(shuō)明所用水蚤的敏感性符合試驗(yàn)要求。

表1 重鉻酸鉀對(duì)水蚤的急性毒性試驗(yàn)

1.6 十二烷基三甲基氯化銨試驗(yàn)濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)

采用靜置3 d的自來(lái)水為培養(yǎng)水體,十二烷基三甲基氯化銨水溶液濃度0.10 mg/L、1.00 mg/L為預(yù)實(shí)驗(yàn)濃度,經(jīng)24 h急性毒性試驗(yàn)后,0.10 mg/L濃度條件下的30只水蚤死亡1只,1.00 mg/L濃度條件下30只水蚤全部死亡。因此,十二烷基三甲基氯化銨對(duì)水蚤的急性毒性效應(yīng)濃度按對(duì)數(shù)濃度設(shè)定為:0.00 mg/L、0.10 mg/L、0.16 mg/L、0.25 mg/L、0.40 mg/L、0.63 mg/L、1.00 mg/L。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

根據(jù)受試物濃度與水蚤死亡數(shù),利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 26(IBM SPSS Statistics 26),結(jié)合數(shù)據(jù)繪圖工具Origin 2021和Microsoft Office Excel 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 十二烷基三甲基氯化銨對(duì)水蚤的急性毒性效應(yīng)

采用靜置3 d的自來(lái)水為培養(yǎng)水體,十二烷基三甲基氯化銨線性對(duì)數(shù)濃度0.10～1.00 mg/L為試驗(yàn)濃度,24 h急性毒性試驗(yàn)濃度與水蚤死亡數(shù)關(guān)系如圖1所示。

圖1 24 h濃度與水蚤死亡數(shù)關(guān)系圖

空白對(duì)照組30只水蚤生長(zhǎng)正常,未有死亡現(xiàn)象,說(shuō)明所用培養(yǎng)水體對(duì)水蚤生長(zhǎng)代謝不會(huì)產(chǎn)生毒性作用,在十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度為0.10 mg/L時(shí)24 h死亡數(shù)為1只,由圖1可以看出,水蚤死亡數(shù)隨著十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度的變大而增加。濃度為0.10～0.25 mg/L時(shí),水蚤死亡數(shù)低于3,說(shuō)明在此濃度范圍內(nèi)水蚤對(duì)十二烷基三甲基氯化銨不敏感。當(dāng)溶液濃度增加到0.40 mg/L時(shí),水蚤死亡數(shù)從3指數(shù)式快速增大到9,說(shuō)明水蚤對(duì)十二烷基三甲基氯化銨的敏感性突然增大。濃度為0.63 mg/L時(shí),水蚤死亡數(shù)為21只。濃度為1.00 mg/L時(shí),30只水蚤全部死亡。

不同濃度的十二烷基三甲基氯化銨在不同時(shí)間段內(nèi)對(duì)水蚤的影響如圖2所示。前4 h內(nèi)水蚤的死亡數(shù)基本為0,說(shuō)明在前4 h內(nèi)水蚤對(duì)十二烷基三甲基氯化銨的敏感性較低。從第4 h到第8 h的這段時(shí)間,在濃度為0.63 mg/L和1.00 mg/L的條件下水蚤死亡數(shù)分別從1、2增加到7、23,水蚤死亡數(shù)量的突然增大說(shuō)明水蚤對(duì)十二烷基三甲基氯化銨的耐受性在8 h左右,且從第8 h到24 h時(shí)間段內(nèi)濃度越高水蚤的死亡數(shù)越高。

圖2 不同濃度不同時(shí)間段水蚤死亡數(shù)的關(guān)系圖

圖3是16 h和24 h水蚤死亡數(shù)隨濃度的變化與指數(shù)Exp3P2模型曲線。由圖3a可以看出,16 h的兩條曲線幾乎重合,說(shuō)明水蚤的死亡數(shù)隨著十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度的增大呈指數(shù)增長(zhǎng)。由圖3b可以看出,十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度為0.10～0.63 mg/L時(shí),其水蚤的死亡曲線與指數(shù)擬合曲線幾乎重合,溶液濃度為1.00 mg/L時(shí)水蚤的死亡數(shù)低于指數(shù)擬合曲線,水蚤試驗(yàn)數(shù)由30只改為60只,相同條件下試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)60只水蚤也全部死亡,說(shuō)明試驗(yàn)時(shí)間為24 h、溶液濃度為1.00 mg/L的條件下,水蚤的死亡數(shù)與指數(shù)擬合曲線偏離較大的原因是試驗(yàn)水蚤的樣本數(shù)量不同。

a 16 h

16 h和24 h水蚤死亡數(shù)與溶液濃度之間的關(guān)系可用指數(shù)Exp3P2模型描述,其指數(shù)擬合曲線方程為

y=ea+bx+cx2

(1)

其中16 h和24 h指數(shù)擬合曲線所對(duì)應(yīng)方程(1)的具體參數(shù)值如表2所示。

表2 16 h和24 h對(duì)應(yīng)方程(1)的具體參數(shù)值

由表2可知,16 h時(shí)R2值為0.999 29,表明水蚤的死亡數(shù)與十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度在Exp3P2模型下擬合度非常高,說(shuō)明水蚤的死亡數(shù)與溶液濃度之間的關(guān)系符合Exp3P2指數(shù)模型,水蚤的死亡數(shù)隨著溶液濃度的增大呈指數(shù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。24 h同理可得,R2值為0.999 17,其擬合度也非常高,水蚤的死亡數(shù)也符合隨溶液濃度的增大呈指數(shù)增長(zhǎng)的規(guī)律。

將表2數(shù)據(jù)輸入SPSS 26軟件所得結(jié)果如下:

(1) 卡方檢驗(yàn):由皮爾遜擬合優(yōu)度檢驗(yàn)得,在樣品濃度不取對(duì)數(shù)時(shí)得到的卡方值為0.609;在樣品濃度取對(duì)數(shù)時(shí)得到的卡方值為11.638;卡方值越接近零時(shí)擬合效果越好,因此采用樣品濃度不取對(duì)數(shù)時(shí)的卡方值作為最終的檢驗(yàn)值。

(2) 概率估算:由參數(shù)估算值得到線性回歸方程為:y=-2.388+4.717x,95%置信區(qū)間為3.513～5.921。概率為0.500時(shí)對(duì)應(yīng)的估算值為0.506,下限值為0.451,上限值為0.576。

由內(nèi)插法計(jì)算十二烷基三甲基氯化銨轉(zhuǎn)換后概率響應(yīng)如圖4所示,當(dāng)y=0.5(概率為50%)時(shí),x的值為0.625,即十二烷基三甲基氯化銨的24 h LC50=0.625 mg/L。說(shuō)明十二烷基三甲基氯化銨在濃度為0.625 mg/L的條件下對(duì)水生生物即有較高毒性,對(duì)水生態(tài)影響較大。十二烷基三甲基氯化銨能溶解紅細(xì)胞,水蚤屬于枝角類動(dòng)物,其血液含有血紅素,血紅素溶于血漿,肌肉、卵巢和腸壁的細(xì)胞中也含血紅素,因此十二烷基三甲基氯化銨可通過破壞血紅素對(duì)水蚤生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生影響,從而導(dǎo)致其死亡。

圖4 十二烷基三甲基氯化銨轉(zhuǎn)換后概率響應(yīng)圖

2.2 水蚤急性毒性分級(jí)

樣品的急性毒性主要根據(jù)動(dòng)物經(jīng)口、經(jīng)皮半數(shù)致死量(LD50)、吸入半數(shù)致死濃度(LC50)進(jìn)行分級(jí),由受試動(dòng)物體重與樣品的半數(shù)致死量(濃度)進(jìn)行評(píng)價(jià)。水體中污染物對(duì)動(dòng)物的急性毒性分級(jí)不但與污染物濃度有關(guān),還與受試動(dòng)物體重有關(guān)。

2.2.1 水蚤稱重實(shí)驗(yàn)

水蚤稱重實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)兩種稱重方法。

方法一:將水蚤分為大水蚤(≥4 mm)、中水蚤(1～4 mm)、小水蚤(≤1 mm),如圖3所示。這3種水蚤分別隨機(jī)選取10只,用吸水紙將其表面水分吸干,用接種環(huán)將其移放至稱量紙上,稱量后記錄數(shù)據(jù)并將水蚤放回原處,再重新隨機(jī)選取10只水蚤,重復(fù)操作以上步驟,稱取10次,得到大水蚤、中水蚤、小水蚤稱量10次的數(shù)據(jù),分別求取平均值,再將得到的3組平均值求取平均值,為0.007 61 g。

方法二:不分大小隨機(jī)選取十只水蚤按照方法一的步驟進(jìn)行稱重,稱取10次,求取平均值,為0.006 48 g。

由圖5可知,將水蚤實(shí)體用顯微鏡全部放大70倍,獲得的圖片經(jīng)測(cè)量得到隨機(jī)選取的大水蚤實(shí)際長(zhǎng)度為5 mm。同理可得中水蚤實(shí)際長(zhǎng)度為2 mm,小水蚤實(shí)際長(zhǎng)度為1 mm。據(jù)此劃分大、中、小水蚤的范圍為:長(zhǎng)度≤1 mm的水蚤劃分為小水蚤;長(zhǎng)度在1～4 mm的水蚤劃分為中水蚤;長(zhǎng)度≥4 mm的水蚤劃分為大水蚤。

小水蚤

在探究十二烷基三甲基氯化銨對(duì)水蚤影響的試驗(yàn)中,每個(gè)燒杯的試驗(yàn)蚤數(shù)量都是10只,因此將10只水蚤作為一個(gè)整體所得到的平均質(zhì)量用于后續(xù)步驟的比例縮放。將兩種方法所得10只水蚤平均質(zhì)量再取平均值(0.007 045 g),得到最終將用于后續(xù)推算步驟中使用的數(shù)值。

2.2.2 水蚤急性毒性分級(jí)推算

由于國(guó)家目前對(duì)藥品急性毒性的劃分是經(jīng)過大鼠或者小鼠實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果進(jìn)行劃分,沒有通過水蚤急性毒性試驗(yàn)進(jìn)行劃分,所以根據(jù)目前已知的急性毒性分級(jí)推算得到以水蚤為研究對(duì)象的急性毒性分級(jí)。

推算步驟如下:根據(jù)前面水蚤稱重實(shí)驗(yàn)所得10只水蚤平均質(zhì)量為0.006 67 g,用于急性毒性使用小鼠體重以18～25 g、大鼠180～240 g、豚鼠200～250 g、家兔2.0～2.5 kg、貓1.5～2.0 kg為宜。表3為工業(yè)毒物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

表3 工業(yè)毒物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

將小鼠作為研究對(duì)象,用于急性毒性使用小鼠體重以18～25 g,取其平均值為21.5 g。10只水蚤平均質(zhì)量為0.007 045 g,即小鼠的平均質(zhì)量是10只水蚤平均質(zhì)量的3 052倍。由表4可知,小鼠吸入2 h不同毒性分級(jí)LC50值為已知。將這些數(shù)值乘以12得到的數(shù)值,再除以3 052即可得到新的毒性分級(jí)以及相對(duì)應(yīng)的濃度范圍。將最終得到的數(shù)值作為水蚤在溶液中接觸24 h LC50值。結(jié)果如表4所示。十二烷基三甲基氯化銨的24 h LC50為0.625 mg/L,經(jīng)過查詢比對(duì)發(fā)現(xiàn)推算得到的十二烷基三甲基氯化銨毒性與其他實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果基本一致,屬于高毒性物質(zhì)。

表4 新急性毒性劃分等級(jí)

李渭印等[10]研究了次氯酸鈉、表面活性劑、苯酚對(duì)大型蚤的急性毒性并根據(jù)相關(guān)毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)次氯酸鈉、表面活性劑、苯酚進(jìn)行等級(jí)劃分。其試驗(yàn)結(jié)果表明次氯酸鈉、表面活性劑、苯酚對(duì)大型蚤的24 h LC50分別為0.216 mg/L、8.590 mg/L、41.295 mg/L。劃分結(jié)果為:次氯酸鈉屬于高毒等級(jí),表面活性劑屬于中毒等級(jí),苯酚屬于低毒等級(jí)。將其試驗(yàn)結(jié)果按照表4急性毒性劃分等級(jí)進(jìn)行毒性劃分,結(jié)果為:次氯酸鈉屬于高毒等級(jí),表面活性劑屬于中等毒級(jí),苯酚屬于低毒等級(jí),所得結(jié)果和李渭印等得到的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

以水蚤(大型蚤)為研究對(duì)象,探究了十二烷基三甲基氯化銨對(duì)水蚤的急性毒性影響,并設(shè)計(jì)相關(guān)試驗(yàn)得到了以水蚤為研究對(duì)象的急性毒性劃分等級(jí),結(jié)果如下:

(1)十二烷基三甲基氯化銨的24 h LC50值為0.625 mg/L,對(duì)應(yīng)急性毒性劃分等級(jí)為高毒性,對(duì)水生生物毒性較高,如果進(jìn)入自然水體中的濃度高于LC50值,將對(duì)水生態(tài)環(huán)境造成一定的負(fù)面影響,產(chǎn)生安全風(fēng)險(xiǎn)。

(2)對(duì)目前已知的急性毒性等級(jí)劃分進(jìn)行改進(jìn),得到了以水蚤為研究對(duì)象的新的急性毒性劃分等級(jí),并通過相關(guān)案例的對(duì)比驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

(3)水蚤的急性毒性試驗(yàn)可以快捷方便地初步評(píng)估判斷水體中是否含有有毒有害物質(zhì)及其是否會(huì)對(duì)周圍生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定的影響。