不同溶劑提取法對韭菜活性物質(zhì)含量及其功能的影響

胡建業(yè),洪若菲,魏秀武,韓雨燕,洪 軍

(1.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,河南 平頂山 467036;2.河南工業(yè)大學(xué) 國際教育學(xué)院,河南 鄭州 450001)

韭菜屬百合科多年生宿根草本植物,其根、莖、葉、花和籽都具有重要的藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值,具有補(bǔ)腎溫陽、行氣理血、潤腸通便、益肝健胃等藥理作用。已從韭菜中分離提取到含硫化合物、黃酮類化合物、甾體皂苷類化合物、含氮化合物、植物油類、維生素、微量元素、蛋白質(zhì)、多糖等化學(xué)成分[1]。對韭菜功能研究報(bào)道較多,韭菜醇提物具有較好的抑菌效果,如100%韭菜醇提物對沙門氏菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等都有一定的抑制作用,其中對大腸桿菌的抑菌作用最強(qiáng),不同菌株之間的抑菌效果有顯著性差異,且韭菜醇提物中含有豐富的硫醚類及酯類化合物,其中硫醚類化合物占了總樣品組分的27.39%,這些硫醚類化合物可能是韭菜抑菌作用的主要活性物質(zhì)[2]。趙剛等[3]研究表明在離體條件下韭菜水提液對蘋果輪紋病菌菌絲生長具有顯著的抑制作用。在韭菜的抗氧化作用中,孫志勇等[4]采用乙醇浸潤萃取韭菜葉及韭菜籽中活性物質(zhì),結(jié)果表明韭菜籽及韭菜葉醇提物對DPPH自由基和羥基自由基都有較強(qiáng)的清除能力。也有報(bào)道表明韭菜提取物(70%乙醇提取)可以使大鼠血清中的總膽固醇含量下降約38%,甘油三酯含量下降15%,但高密度脂蛋白膽固醇增加不顯著,表明韭菜提取物對輔助降血脂有一定的作用[5]。關(guān)于韭菜水提物和醇提物活性成分及其功能差別的研究較少。

為探討不同溶劑提取工藝對活性成分及功能的異同,以韭菜為研究對象,根據(jù)相似相溶原理,分別采用水提法和醇提法提取韭菜中活性物質(zhì),確定其多糖、蛋白質(zhì)和黃酮的含量,并對其不同提取物的抑菌率、降血脂及抗氧化能力等方面進(jìn)行研究,為韭菜的應(yīng)用提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

韭菜(市售);乙醇、蒽酮、硫酸、葡萄糖、30%H2O2、抗壞血酸、硫酸亞鐵、無水亞硫酸鈉、水楊酸、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸均由洛陽市化學(xué)試劑廠提供;考馬斯亮藍(lán)由天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供;牛血清白蛋白由北京索萊寶科技有限公司提供;瓊脂粉、酵母粉、蛋白胨由西亞化學(xué)科技(山東)有限公司提供;DPPH由上海麥克林生化科技有限公司提供;豬膽鹽、牛膽酸鈉、脫氧膽酸鈉均由上海源葉生物科技有限公司提供。

供試菌株:金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922、綠膿桿菌CGMCC1.2620,均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器與設(shè)備

GFL-125型烘箱(天津萊博特瑞儀器設(shè)備有限公司)、RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、HWS12型恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、KQ5200DE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)、Genesys 10S型紫外分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技公司)、酶標(biāo)儀(美國PE公司)、立式高壓蒸汽滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)、超凈工作臺(蘇靜集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 韭菜活性物質(zhì)的提取

取新鮮韭菜清洗,將韭菜葉切成長約3～5 cm小段,放置于45 ℃烘箱中烘干。48 h后取出粉碎,過40目篩。稱取一定量韭菜粉末,按液料比201 (mL/g)的比例加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇進(jìn)行超聲處理,設(shè)置超聲溫度為60 ℃,超聲時(shí)間為60 min,超聲功率為200 W,提取韭菜脂溶性物質(zhì),即韭菜醇提液[6-7]。韭菜水溶性物質(zhì)的提取工藝與之相似,用蒸餾水替代乙醇溶液。然后通過真空抽濾去渣,將抽濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至0.5 g/mL,裝入棕色密封瓶放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ们皩⒕虏怂嵋汉痛继嵋悍謩e用蒸餾水和乙醇稀釋10倍,得到0.05 g/mL溶液,備用。

1.3.2 韭菜不同提取物中活性成分的含量測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,采用蒽酮-硫酸比色法在625 nm處用酶標(biāo)儀測定多糖含量[8],并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,采用考馬斯亮藍(lán)法在595 nm下用酶標(biāo)儀測定蛋白質(zhì)含量[9]。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,采用硝酸鋁顯色法在510 nm處測定黃酮含量[10]。

將韭菜水溶性和脂溶性提取液按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法進(jìn)行測定,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù);將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別計(jì)算水溶性和脂溶性提取液中的多糖、蛋白質(zhì)和黃酮含量。

1.3.3 韭菜活性物質(zhì)的功能研究

1.3.3.1 韭菜不同提取物的抑菌活性測定

采用微量肉湯法檢測韭菜活性物質(zhì)的抑菌率。將制備的韭菜水溶性和脂溶性提取物稀釋液再稀釋10倍,即0.005 g/mL,進(jìn)行過濾除菌。取培養(yǎng)后對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌菌懸液,將菌懸液用液體培養(yǎng)基稀釋至106CFU/mL,取菌懸液160 μL,加入提取液40 μL,置于96孔板中;用菌懸液作陽性對照、以液體培養(yǎng)基作空白對照,每樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將96孔板置于37 ℃,70 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)18～24 h,觀察微生物生長情況,在600 nm處測量吸光度,分別計(jì)算提取物的抑菌率[11]。

1.3.3.2 韭菜不同提取物的抗氧化活性測定

(1)不同提取物對DPPH自由基清除能力的測定。

在10 mL的具塞試管中加入1 mL 0.05 g/mL的提取液和4 mL DPPH試劑(6.5×10-5mol/L醇溶液),在517 nm下測量吸光度,記為A1;用1 mL乙醇溶液代替提取液,做空白對照記為A0;測量1 mL無水乙醇溶液與相同體積提取液的吸光值,記為A2。

以相同濃度的抗壞血酸溶液作為陽性對照,將以上溶液在避光條件下反應(yīng)30 min后用酶標(biāo)儀測量相應(yīng)的吸光度。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù),求平均值以減少誤差,計(jì)算水提液和醇提液對DPPH自由基的清除效果[12]。計(jì)算公式為DPPH自由基清除率%=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

(2)不同提取物對羥基自由基清除能力的測定。

先加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液和1 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液于10 mL的具塞試管中;再加入1 mL 0.05 g/mL韭菜提取液;最后加入1 mL 0.1 mol/L H2O2溶液。將試管置于37 ℃水浴鍋中溫水浴30 min處理,在酶標(biāo)儀510 nm處測量吸光度A1,以同體積蒸餾水代替提取液樣品的吸光度為A0,以同體積蒸餾水代替H2O2溶液的吸光度為A2。在同樣條件下,以相同濃度的抗壞血酸溶液作為陽性對照。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù),計(jì)算水提液和醇提液對羥基自由基的清除能力[13]。計(jì)算公式為羥基自由基清除率 %=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

1.3.3.3 韭菜不同提取物的降血脂功效

以豬膽鹽、牛膽酸鈉、脫氧膽酸鈉作為3種膽酸鹽試劑,在10 mL的離心管中加入1 mL提取液和4 mL膽酸鹽試劑(0.3 mmol/L,用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至6.3),37 ℃恒溫振蕩1 h,后取出在6 000 r/min的離心機(jī)中,離心10 min。取上清液2.5 mL于20 mL的試管中,緩慢加入7.5 mL 60%硫酸溶液,輕輕搖勻,于70 ℃水浴鍋中水浴20 min,取出后再冰水浴5 min,最后在387 nm處測量吸光值A(chǔ)1,以蒸餾水代替提取液做空白組A0,以蒸餾水代替硫酸溶液作為對照組A2。每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算提取液對豬膽鹽、牛膽酸鈉、脫氧膽酸鈉的結(jié)合率[14]。計(jì)算公式為結(jié)合率%=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 韭菜提取物中活性成分的含量

根據(jù)測得相應(yīng)濃度下的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度,獲得葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.991 7x+0.117 2,R2=0.991 7;蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.529 5x+0.280 6,R2=0.992 7;黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.010 8x+0.023 4,R2=0.995 2。根據(jù)以上回歸方程,將不同提取液測量的OD值代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別測得韭菜提取物中活性成分含量,如表1所示。

表1 韭菜不同提取物中活性成分含量 mg/g

由表1可知,韭菜水提液中多糖的含量顯著高于韭菜醇提液,說明韭菜中的多糖易溶于水,且多糖含量豐富;水提液中的蛋白質(zhì)含量較韭菜醇提液稍高,但差別不明顯。說明韭菜中的蛋白質(zhì)種類豐富,既有水溶性蛋白,又有脂溶性蛋白;而韭菜水提液中的黃酮含量少于醇提液中的黃酮含量,但總體上韭菜中黃酮含量占比較少。此結(jié)果與劉華等[15]研究的在最優(yōu)提取工藝條件下,獲得的韭菜和韭黃中提取的總黃酮含量(分別為3.68 mg/g和0.53 mg/g)相比較少,可能與提取工藝、韭菜來源等不同有關(guān),本研究中韭菜醇提液采用95%的乙醇溶劑制備,主要成分是葉綠素。

2.2 韭菜活性物質(zhì)的功能

2.2.1 韭菜不同提取物的抑菌活性測定

在3種受試菌中,韭菜醇提液的抑菌率均顯著高于水提液的抑菌率(見表2),說明溶解在乙醇中的蛋白質(zhì)、黃酮等成分比溶解在水中的相應(yīng)成分具有更強(qiáng)的抑菌活性。從韭菜提取液對不同菌株的抑菌活性來分析,韭菜水提液和醇提液在金黃色葡萄球菌中的抑菌率分別是33.90%、60.49%;兩種提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌率均低于對另外兩種菌株(大腸桿菌和綠膿桿菌)。

表2 韭菜不同提取物的抑菌活性比較

由表2可知,韭菜醇提液的抑菌性強(qiáng)于韭菜水提液,但是韭菜水提液和醇提液對3種菌株抑菌活性的順序是一致的。這與李洪山等[2]研究100%韭菜醇提物對綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等都有一定的抑制作用相一致,但與崔東亞等[16]提出的韭菜水提液對金黃色葡萄球菌強(qiáng)于大腸桿菌存在偏差,產(chǎn)生偏差的原因推測可能與提取工藝及所用溶劑不同有關(guān)。

2.2.2 韭菜不同提取物的抗氧化活性測定

表3為韭菜不同提取物對自由基清除能力比較,韭菜醇提物對DPPH自由基的清除率比韭菜水提物的清除率高,而韭菜水提液對羥基自由基的清除率較韭菜醇提液清除率稍高,但與相同濃度的抗壞血酸相比,韭菜提取液對DPPH自由基和羥基自由基清除率相對較弱。這可能與韭菜水溶性物質(zhì)和醇溶性物質(zhì)活性成分差異有關(guān)。表明韭菜提取物具有一定的抗氧化能力,但較抗壞血酸的抗氧化能力弱。這與孫志勇等[4]研究乙醇浸潤萃取提取韭菜葉及韭菜籽中活性物質(zhì)表明韭菜的水提液和醇提液都具有明顯的抗氧化功能一致。

表3 韭菜不同提取物對自由基清除能力比較

2.2.3 韭菜不同提取物的降血脂功效

體內(nèi)降低膽固醇的主要途徑是與膽酸鹽結(jié)合,因其可有效排除體內(nèi)膽汁酸,間接降低膽固醇含量,從而使血脂含量降低。在降血脂實(shí)驗(yàn)中,計(jì)算韭菜水提液和醇提液對豬膽鹽、牛膽酸鈉、脫氧膽酸鈉的結(jié)合率,如圖1所示。在3種膽酸鹽中,韭菜水提液與膽酸鹽的結(jié)合率明顯高于韭菜醇提液的結(jié)合率,表明韭菜水提液的降血脂效果較醇提取液好。一方面說明溶解在水中的降血脂活性成分高于乙醇中的降血脂成分;另一方面可能是由于膽酸鹽本身作為鹽類物質(zhì),其水溶性就高于脂溶性。在3種膽酸鹽中,韭菜提取物對牛膽酸鈉的結(jié)合率均高于另外兩種膽酸鹽,說明韭菜提取物與含有牛膽酸鈉的血脂相結(jié)合效果較好。

圖1 韭菜不同提取物對3種鹽的結(jié)合率測定

3 結(jié)論

本研究對韭菜水溶性和脂溶性活性物質(zhì)進(jìn)行提取,并對提取物的抑菌活性、抗氧化和降血脂能力進(jìn)行研究。結(jié)果表明韭菜水提液中多糖和蛋白質(zhì)含量較高。韭菜醇提液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌的抑菌率較水提液高。醇提液對DPPH自由基的清除率高,而水提液對羥基自由基的清除率高,與抗壞血酸相比,韭菜提取物的抗氧化能力較弱。韭菜水提液對豬膽鹽、牛膽酸鈉、脫氧膽酸鈉的結(jié)合率均較醇提液高,表明水提液在輔助降血脂方面效果較好。