miR-449a在乳腺癌組織中的表達及生物信息學分析

林 慧,陳佳菁,王燦明,鄭素瓊,邱建龍

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九一醫(yī)院 病理科,福建 泉州 362000)

乳腺癌是當前全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率仍呈上升趨勢。作為一種高度異質(zhì)性的疾病,基于組織病理、基因表達或基因組-轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有多種分類方法,臨床工作中常根據(jù)雌激素受體(Estrogen receptor,ER)、孕激素受體(Progesterone receptor,PR)和人表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的表達將其分為管腔型、HER2過表達型和三陰性乳腺癌[1]。不同分子亞型的乳腺癌具有獨特的臨床表現(xiàn)、組織病理學特征、治療反應以及預后,深入了解其內(nèi)在機制的差異對改進分類方法和發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點至關重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA,主要通過抑制翻譯或降解靶mRNA調(diào)控基因表達,在癌癥發(fā)病機制中發(fā)揮致癌或抑癌作用[2]。部分miRNA在乳腺癌中的表達存在異質(zhì)性,與特定的分子亞型相關聯(lián),可用于腫瘤的風險判斷和精準分類[3]。研究顯示miR-449a在乳腺癌、宮頸癌、肺癌、鼻竇腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中異常表達,參與調(diào)控腫瘤增殖、遷移、侵襲等過程,但對其在不同亞型乳腺癌的作用了解有限[4-6]。本研究通過檢測miR-449a在乳腺癌組織中的表達,分析其與臨床病理特征的關系,并采用生物信息學方法探索其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能的作用機制,以期為乳腺癌的研究提供一定的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織標本和臨床資料

選取本院2017年至2021年行手術切除的83例乳腺癌患者作為研究對象。納入標準:①首診患者,經(jīng)病理組織學確診;②臨床病理資料完整,明確ER、PR和HER2蛋白的表達狀態(tài);③病灶無明顯出血壞死區(qū)。排除標準:①術前接受過新輔助治療;②合并其他器官惡性腫瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,患者或家屬簽署知情同意書?；颊甙l(fā)病年齡27～81歲,平均年齡(50.48±12.11)歲,組織學類型包括浸潤性導管癌70例、伴髓樣特征的浸潤性癌9例、化生性癌4例;分子亞型包括管腔型43例、HER2過表達型19例、三陰性乳腺癌21例。選擇腫瘤石蠟包埋組織為觀察組,距腫物邊緣>2 cm的正常乳腺組織作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測miR-449a表達水平

將石蠟標本以15 μm厚度切片,按石蠟組織切片miRNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司)說明書提取RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國APExBIO公司)操作步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-449a逆轉(zhuǎn)錄引物序列:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCAGC。將合成的cDNA 稀釋為統(tǒng)一濃度后,按照熒光定量PCR試劑盒說明書(南京諾唯贊生物科技公司)進行操作,配制20 μL反應體系:cDNA模板2 μL、引物0.8 μL、SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、ddH2O 7.2 μL。miR-449a上游引物:CGCGTGGCAGTGTATTGTTA,下游引物:AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s,循環(huán)45次。記錄Ct值,以U6為內(nèi)參照,采用2-ΔΔCt法計算miR-449a的相對表達量。

1.2.2 生存數(shù)據(jù)分析

使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(https://kmplot.com/analysis/)進行在線分析,選擇METABRIC數(shù)據(jù)集和默認參數(shù),比較miR-449a表達與不同亞型乳腺癌患者總生存率的關系。

1.2.3 靶基因預測和富集分析

從ENCORI網(wǎng)站(https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)下載miRNA-mRNA相互作用數(shù)據(jù),選擇TargetScan、miRanda和PicTar三個數(shù)據(jù)庫共同的預測結(jié)果作為預測靶基因集合。應用metascape在線數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對所預測的靶基因集合進行基因本體(Gene ontology,GO)分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析。

1.2.4 編碼蛋白互作網(wǎng)絡分析

使用string數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)進行編碼蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡分析。將數(shù)據(jù)結(jié)果導入Cytoscape 3.9.1軟件,使用MCODE插件進行PPI子網(wǎng)絡的聚類模塊分析。

1.2.5 miR-449a與靶基因表達的相關性分析

使用ENCORI數(shù)據(jù)庫探索乳腺癌組織miR-449a與靶基因表達的相關性,mRNA和miRNA數(shù)據(jù)來源于癌癥基因組圖譜(The cancer genome atlas,TCGA),并經(jīng)log2(FPKM/RPM + 0.01)轉(zhuǎn)換。

1.3 統(tǒng)計學處理

運用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理,計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間差異比較采用配對t檢驗,多組資料兩兩比較采用Games-Howell法,計數(shù)資料以例和百分率表示,行χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果分析

2.1 乳腺癌和癌旁正常組織miR-449a表達水平比較

乳腺癌組織中miR-449a表達水平(1.33±0.67)高于癌旁正常組織(1.02±0.41),差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.801,P<0.001,見圖1a)。進一步比較每例樣本癌旁組織和癌組織的表達,結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,miR-449a在38.6%(32/83)的乳腺癌組織中表達下調(diào)(見圖1b),其中包括13例管腔型乳腺癌、6例HER2過表達型乳腺癌和13例三陰性乳腺癌,說明miR-449a在乳腺癌組織中的表達存在明顯的異質(zhì)性。

圖1 miR-449a在乳腺癌和癌旁組織中的表達水平Fig.1 Expression level of miR-449a in breast cancer tissues and adjacent tissues

2.2 不同分子亞型乳腺癌miR-449a表達水平比較

進一步比較不同分子亞型乳腺癌miR-449a的表達,結(jié)果顯示其在三陰性乳腺癌中表達水平最低(0.90±0.39),在管腔型乳腺癌中的表達水平最高(1.56±0.71),兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001),而HER2過表達型乳腺癌(1.29±0.63)與其他亞型之間的差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖2)。

圖2 miR-449a在不同分子亞型乳腺癌中的表達水平Fig. 2 Expression level of miR-449a in different molecular subtypes of breast cancer

2.3 miR-449a表達水平與患者臨床病理特征的關系

根據(jù)乳腺癌組織miR-449a表達水平的平均值,將患者分為低表達組43例,高表達組40例。分析miR-449a表達水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關系,結(jié)果顯示其與腫瘤組織學級別、腫瘤大小以及ER、PR的表達狀態(tài)有關(P<0.05),與患者年齡、腫瘤發(fā)生部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及HER2表達狀態(tài)無相關性(P>0.05,見表1)。

表1 miR-449a表達水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關系 n(%)Table 1 Relationship between the expression level of miR-449a and the clinicopathological features of patients with breast cancer n(%)

2.4 miR-449a表達水平與不同分子亞型乳腺癌患者預后的關系

使用Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析miR-449a表達水平與不同亞型乳腺癌患者總生存率的關系,結(jié)果顯示,在管腔B型乳腺癌中miR-449a高表達組總生存率顯著低于低表達組(P<0.01),在三陰性乳腺癌中miR-449a低表達組總生存率顯著低于高表達組(P<0.05,見圖3),相反的趨勢提示miR-449a在不同分子亞型乳腺癌的作用可能存在差別。此外,管腔A型、HER2過表達型乳腺癌患者的總生存率與miR-449a的表達水平無關(P>0.05)。

圖3 miR-449a表達水平與不同分子亞型乳腺癌患者預后的關系Fig. 3 Relationship between miR-449a expression level and prognosis of patients with different molecular subtypes of breast cancer

2.5 miR-449a靶基因預測和富集分析結(jié)果

預測結(jié)果篩選出186個miR-449a靶基因,GO分析提示蛋白功能主要涉及細胞成分形態(tài)發(fā)生、間充質(zhì)細胞分化、器官發(fā)育、組蛋白修飾、細胞遷移的正向調(diào)控、囊泡介導的轉(zhuǎn)運調(diào)控等生物學過程(見圖4)。KEGG分析結(jié)果顯示miR-449a靶基因富集于內(nèi)分泌抵抗、粘附連接、粘著斑、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)以及NOTCH、TGF-β、Wnt、Ras、MAPK、PI3K-Akt等介導的信號通路,其中多個靶基因已知與乳腺癌關系密切(見表2)。

表2 miR-449a預測靶基因KEGG通路分析結(jié)果Table 2 Result of KEGG pathway anaysis of predicted miR-449a target genes

圖4 miR-449a預測靶基因GO分析結(jié)果Fig.4 Result of GO analysis of predicted miR-449a target genes

2.6 編碼蛋白互作網(wǎng)絡分析

將靶基因集合上傳至string數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡,該網(wǎng)絡包含137個節(jié)點和276條邊,平均局部聚類系數(shù)為0.357,數(shù)據(jù)導入Cytoscape進行可視化(見圖5a)。使用MCODE插件進行分析,篩選出以Notch受體1(Notch receptor 1,NOTCH1)、Notch配體1(Jagged canonical Notch ligand 1,JAG1)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1,CCND1)等為核心的子網(wǎng)絡(見圖5b)。

圖5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡分析結(jié)果Fig. 5 Result of analysis of protein-protein interaction network

2.7 miR-449a與靶基因表達的相關性分析

進一步分析miR-449a與NOTCH信號通路靶基因(見表2)表達的相關性,結(jié)果顯示miR-449a與NOTCH1在乳腺癌組織中的表達呈負相關(r=-0.186,P<0.001,見圖6)。

圖6 miR-449a與NOTCH1在乳腺癌組織中表達的相關性Fig. 6 Correlation of miR-449a expression with NOTCH1 in breast cancer tissues

3 討 論

miR-449家族包括miR-449a、miR-449b、miR-449c,由位于染色體5q11.2的基因簇所編碼,這一區(qū)域已被鑒定是癌癥易感區(qū)域[7]。miR-449a在人類肺、氣管和睪丸中高表達,在非小細胞肺癌、肝細胞癌、鼻竇腺癌等多種惡性腫瘤中常常下調(diào)表達,發(fā)揮抑癌作用[6-8]。目前miR-449a與乳腺癌相關的研究結(jié)論存在一些矛盾。有報道顯示miR-449a在乳腺癌組織和細胞系表達下調(diào),過表達miR-449a對乳腺癌細胞起抑制作用[9]。但也有研究發(fā)現(xiàn)miR-449a在淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的浸潤性導管癌中高表達,其表達與患者復發(fā)率增加和總生存期、無病生存期降低顯著相關,在體外可促進多種乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲[10]。本研究結(jié)果顯示miR-449a在乳腺癌組織中的表達呈現(xiàn)出高度的異質(zhì)性,雖然總體水平高于癌旁組織,但其中有38.6%的病例出現(xiàn)表達下調(diào),因此不同研究結(jié)論的矛盾在一定程度上與納入的樣本有關。

本組資料顯示miR-449a的表達與腫瘤組織學級別和大小有關,在高級別、體積大的乳腺癌中表達降低,提示其在乳腺癌進展中一定程度上發(fā)揮抑癌作用。乳腺癌是具有不同生物學和表型特征的異質(zhì)性疾病,miR-449a的表達水平在不同分子亞型乳腺癌間存在差異,尤其是三陰性乳腺癌表達水平顯著低于管腔型。三陰性乳腺癌是一種高侵襲性亞型,具有很強的增殖能力和高轉(zhuǎn)移風險,上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關的形態(tài)學和功能改變是其獲得侵襲性的關鍵事件。靶基因及富集分析結(jié)果顯示miR-449a的功能涉及間充質(zhì)細胞分化、細胞遷移、粘附連接、粘著斑、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)等生物學過程,提示miR-449a的功能與腫瘤獲得侵襲性密切相關。體外實驗表明在三陰性乳腺癌細胞系中上調(diào)miR-449a的表達后可抑制細胞遷移和EMT進程并促進細胞凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用[2]。生存分析結(jié)果顯示miR-449a低表達的三陰性乳腺癌患者總生存率顯著低于高表達者。

miR-449a在管腔型乳腺癌中高表達,表達水平與激素受體ER、PR陽性狀態(tài)有關。先前有研究發(fā)現(xiàn)miR-449a在ER陽性的乳腺癌細胞株MCF-7中的表達顯著高于正常乳腺上皮細胞,敲低后則會抑制癌細胞增殖和遷移[11]。管腔B型是ER陽性乳腺癌中侵襲性較強的類型,生存分析結(jié)果顯示miR-449a在該亞型中表達較高的患者預后更差,提示miR-449a在該亞型腫瘤進展過程中可能發(fā)揮重要作用,但具體機制目前尚未闡明。有研究發(fā)現(xiàn)miR-449a表達增加與磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α(Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha,PIK3CA)突變狀態(tài)有關,后者是ER陽性乳腺癌中最常見的體細胞突變癌基因[12]。PIK3CA突變導致PI3K-Akt信號通路的異常激活,可促進乳腺癌細胞的生長和侵襲[13]。靶基因預測結(jié)果也顯示miR-449a調(diào)控PI3K-Akt信號通路的多個基因,因此miR-449a在乳腺癌中發(fā)揮抑癌或致癌作用,可能取決于不同亞型或發(fā)展階段。

KEGG富集分析結(jié)果顯示miR-449a參與NOTCH、TGF-β、Wnt、PI3K-Akt等多種信號通路,通過PPI網(wǎng)絡分析篩選關鍵子網(wǎng)絡,主要由NOTCH1、JAG1和cyclin D1等蛋白所構(gòu)成。NOTCH信號通路是一種細胞間通信系統(tǒng),可廣泛調(diào)控細胞生物學特性,如干細胞維持、上皮細胞極性/粘附、細胞增殖和凋亡等,在器官發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[14]。異常激活的NOTCH信號與多種惡性腫瘤的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關,NOTCH1作為NOTCH受體家族成員之一,在信號轉(zhuǎn)導中起關鍵作用[15]。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)miR-449a在乳腺癌組織中的表達與NOTCH1呈負相關。NOTCH1在三陰性乳腺癌中的表達最為顯著,可能通過誘導多種EMT相關基因的表達,促進管腔細胞向基底型分化,從而參與三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[16]。JAG1是NOTCH信號通路的重要配體,在乳腺癌中的表達水平與腫瘤侵襲進展、轉(zhuǎn)移及不良預后有關[17]。JAG1表達陽性率在不同亞型的乳腺癌中同樣也存在差異,在三陰性乳腺癌中表達率最高且與ER、PR的表達呈負相關[18]。Poddar等[19]已證實miR-449a可靶向作用于JAG1從而在骨骼肌細胞中調(diào)控NOTCH信號。cyclin D1在細胞周期控制中起核心作用,是NOTCH1的直接靶點,在三陰性乳腺癌中JAG1可介導NOTCH1對cyclin D1啟動子的轉(zhuǎn)錄激活,從而促進腫瘤細胞增殖[20]。而在ER陽性的乳腺癌中,cyclin D1則是雌激素調(diào)控細胞周期進程的重要組成,并可直接結(jié)合ER的激素結(jié)合域,在雌激素缺乏的情況下也能介導基因轉(zhuǎn)錄,過表達與腫瘤的高增殖和不良預后相關[21-22]。

4 結(jié) 論

miR-449a的表達水平在三陰性和管腔型乳腺癌中存在顯著差異,可通過影響多種信號通路參與腫瘤發(fā)展過程,調(diào)控NOTCH信號通路可能是其在乳腺癌中的重要機制。鑒于調(diào)控網(wǎng)絡復雜,miR-449a在乳腺癌分型和靶向治療方面的潛在價值仍有待深入研究。