湘蓮根際促生菌的篩選及其效應(yīng)研究

于 輝，肖 璐

（湖南科技大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院，經(jīng)濟作物遺傳改良與綜合利用湖南省重點實驗室，湖南 湘潭 411201）

蓮（Nelumbo nuciferaGaertn.）為睡蓮科多年生水生植物。蓮子是蓮去胚的干燥成熟種子，含有生物堿、磷脂以及類黃酮等多種營養(yǎng)成分，是我國的特產(chǎn)優(yōu)質(zhì)資源，也是一種重要的出口創(chuàng)匯特色農(nóng)副產(chǎn)品。產(chǎn)自湖南的湘蓮具有低脂肪、高蛋白、口感好等特色，歷史上作為進(jìn)貢朝廷的珍品，因而被稱為“中國第一蓮子”。蓮的生育期長，生長過程需肥量大。而大量化肥的使用不但導(dǎo)致耕地質(zhì)量日趨惡化，還會影響蓮子的質(zhì)量。植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR） 是 一類生活在土壤或附生于植物根際并能定殖于植物根際系統(tǒng)、促進(jìn)植物生長的有益菌。它可以創(chuàng)造良好的根際生態(tài)環(huán)境，在改善土壤理化性質(zhì)、提高土壤肥力、降低化肥用量、抑制病蟲害和減少農(nóng)藥污染等方面具有重要作用[1]。國內(nèi)外已相繼從水稻（Oryza sativa）[2]、小麥（Triticum aestivum）[3]、甘蔗（Saccharum officinarum）[4]、馬鈴薯（Solanum tuberosum）[5]、花生（Arachis hypogaea）[6]等作物根際分離培養(yǎng)出多種優(yōu)良菌株并加以利用，但蓮根際促生菌的篩選目前未見報道。筆者通過對湘蓮種植基地土壤根際固氮菌和解磷菌的分離篩選，尋找有利用價值的菌株，并采用盆栽試驗來驗證其促生效應(yīng)，為開發(fā)蓮生物菌肥提供菌種資源，并為進(jìn)一步促進(jìn)湘蓮產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤樣本采集湘蓮根際土壤取自湖南湘潭湘蓮種植基地。以“S”形采樣法取5 個采樣點，每個采樣點各取根附著土壤樣品1 kg，將5 個采樣點的土壤混合，采用四分法棄多余土樣，所采集的土壤置于冰盒（4℃）立即帶回實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基的配置LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，H2O 1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 值7.0～7.2，121℃滅菌30 min。PKO 液體培養(yǎng)基（無機磷細(xì)菌培養(yǎng)基）：NaCl 0.3 g，葡萄糖10 g，KCl 0.3 g，Ca3(PO4)25 g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO40.03 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，H2O 1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 值7.0～7.2，121℃滅菌 30 min。Ashby 無氮培養(yǎng)基：甘露醇 10.0 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.2 g，CaCO35.0 g，pH 值7.2 ，121℃滅菌 30 min。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的篩選取1 g 蓮根際土壤，將其加入裝有100 mL 無菌水的錐形瓶中，恒溫振蕩箱中振蕩30 min 形成土壤均質(zhì)液。移液槍取1 mL 土壤液至9 mL 無菌水試管中，將土壤液依次稀釋5 次，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋倍數(shù)的土壤液。將各個稀釋梯度的土壤液按照稀釋涂布平板法涂布至牛肉膏固體培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。挑取不同形態(tài)特征的單菌落，以點接種法接種在PKO、Ashby 培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)3～5 d，通過觀察Ashby培養(yǎng)基上的生長情況和PKO 培養(yǎng)基的透明圈情況，篩選出同時具備固氮和溶磷能力的菌株。

1.2.2 溶磷能力測定定性測定：采用點接種法，在PKO 培養(yǎng)基上接種篩選出的菌株，恒溫培養(yǎng)，觀察透明圈情況。培養(yǎng)至第7 天時，記錄透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），計算出D/d 值，初步評價各菌株的溶磷能力。定量測定：菌株接種于盛有50 mL PKO 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，恒溫?fù)u床（30℃、180 r/min）上振蕩培養(yǎng)3 d，將10 mL 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中離心15 min（4℃、10 000 r/min），收集上清液，用鉬藍(lán)比色法測定上清液中有效磷的含量。

1.2.3 固氮能力測定將篩選到的菌株搖至成菌液，在Ashby 培養(yǎng)基上接種菌液2.5 μL，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，以無菌水接種為對照，觀察培養(yǎng)基上菌株的生長情況，初步評定其固氮能力。

1.2.4 分泌IAA能力測定采用Salkowski 比色法判定菌株分泌植物生長素IAA 的能力。將供試菌株等量接種到裝有King 液體培養(yǎng)基的試管中，28℃、120 r/min 培養(yǎng)2 d。將菌株培養(yǎng)液在5 000 r/min 離心3 min，取上清液1 mL 加比色液1 mL 在黑暗中靜置30 min。設(shè)定10、30、50 mg/L 3 個IAA 濃度作為對照，比較粉紅色顏色深度。

1.2.5 菌株鑒定采用菌落 PCR 方法擴增16S rDNA，所得產(chǎn)物交由生物工程（上海）股份有限公司測序。將測得的 16S rDNA 序列在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列檢索，并與已測定的細(xì)菌菌株的 16S rDNA 序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 菌懸液的制備將菌株接種于 LB 液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)（30 ℃、180 r/ min）48 h 。將菌懸液稀釋成濃度108CFU/mL 備用。

1.2.7 促生菌對蓮種子活力的影響挑選顆粒飽滿的蓮子，先用 l% 次氯酸鈉溶液滅菌10 min，然后用無菌水沖洗 5～7 次晾干，置于菌懸液中于 25 ℃下恒溫浸種 48 h。晾干后置于塑料盆中，每盆 20 粒，注入制備好的菌懸液50 mL，對照不加菌懸液，以無菌水浸泡。每個處理重復(fù) 4 次，置于25 ℃ 溫室中做萌發(fā)試驗。隔1 d 補充相應(yīng)菌懸液或無菌水10 mL，以確保種子正常萌發(fā)。不定期觀察種子萌發(fā)和幼苗生長的情況。第4 天測發(fā)芽勢，第10 天測發(fā)芽率、苗長、不定根數(shù)、苗重及不定根干重。

1.2.8 促生菌對蓮幼苗生長的影響取稻田表層土壤（0～20 cm）土樣，剔除枯枝落葉及根系后，過2 mm 篩保存?zhèn)溆?。土壤基本性狀如下，有機質(zhì)2.15 g/kg，全磷3.19 g/kg，速效磷3.64 mg/kg，全鉀20.62 g/kg，速效鉀21.22 mg/kg，pH 值 6.8。盆栽促生試驗于 2021年11 月在湖南科技大學(xué)生科樓溫室內(nèi)進(jìn)行。每盆裝土100 g，將配置好的菌懸液50 mL 加入土壤中。蓮種子催芽2 d 后，選取萌發(fā)狀況一致的種子每盆種植2 顆，每盆加水150 mL 以沒過蓮子幼芽。待長勢穩(wěn)定后定植為每盆1 棵。對照處理土壤以等體積滅活菌懸液代替菌懸液。每個處理設(shè)置設(shè) 6 個重復(fù)，試驗過程中不再施入其他肥料。蓮子幼苗生長一個月（30 d）后采集植株樣品和土壤樣品，測定土壤礦質(zhì)氮、速效磷、速效鉀含量以及植株生物量、全氮、全磷、全鉀含量。以上各指標(biāo)的測定方法參考鮑士旦的《土壤農(nóng)化分析》。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 和Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮根際土壤固氮解磷菌的篩選

從湘蓮根際土壤中分離出7 株同時具有固氮和解磷的細(xì)菌，分別命名為XL1、XL2、XL3、XL4、XL5、XL6、XL7。將分離得到的菌株接種至PKO固體培養(yǎng)基，36℃恒溫培養(yǎng)7 d，記錄透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），計算D/d 值，結(jié)果分別為：1.10、1.40、1.28、1.66、1.37、1.50、1.75。其中，XL7 的D/d 比值最大，XL4 次之，XL3 和XL1 的D/d 比值最小。因此，選取上述4 株菌株定量測定其解無機磷能力，比較其溶磷差異。

定量測定檢測結(jié)果與定性檢測結(jié)果相一致，XL7溶磷能力最強，最高有效磷含量達(dá)到1.743 mg/L；XL4溶磷能力次之，最高有效磷含量達(dá)到1.145 mg/L；溶磷能力較差的是XL3 ，有效磷含量最高達(dá)到0.566 mg/L；溶磷能力最差的是XL1，有效磷含量最高達(dá)到0.561 mg/L。固氮能力方面，XL3、XL4、XL6、XL7 菌株在Ahbsy 固體培養(yǎng)基上生長良好，初步判斷其固氮能力較好。另外3 個菌株長勢較小，初步判斷其固氮能力較弱。分泌IAA 的能力通過暗反應(yīng)后的紅色深淺來顯示。通過觀察顏色變化，可以推斷XL4、XL6、XL7 具有分泌IAA 的能力，其中XL7 分泌IAA 的能力較強。另外4 個菌株沒有發(fā)現(xiàn)明顯的顏色變化，推斷其沒有分泌IAA 的能力。因此，選取XL7 為高效的固氮、解磷以及合成 IAA 的多功能促生菌，并通過蓮子種子發(fā)芽和盆栽試驗檢測其促生效果。

2.2 XL7 菌株鑒定

將 16S rDNA 的測序結(jié)果和 GenBank 中已登錄的核苷酸序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)菌株與Bacillus altitudinis具有很高的同源性（圖1），菌株XL7 鑒定為高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）。

圖1 基于16S rDNA 基因序列構(gòu)建的菌株XL7 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 促生菌對蓮子種子活力的影響

促生菌對蓮子種子發(fā)芽的影響如表1 所示。促生菌處理下的種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率都略高于對照組，但差異不顯著。苗長、苗重和不定根重均顯著高于對照，分別是對照的1.20、1.22 和1.36 倍。不定根數(shù)2 種處理下差異不顯著，均在20 條左右。

表1 菌株對蓮子種子活力的影響

2.4 促生菌對蓮子幼苗生長及土壤速效養(yǎng)分含量的影響

2.4.1 促生菌對蓮子幼苗生長的影響盆栽促生試驗結(jié)果（表2）表明，與對照處理相比，促生菌株顯著提高了蓮子幼苗的生物量，為對照的1.25 倍。養(yǎng)分含量方面，XL7 菌株處理下蓮子幼苗地上部的氮、磷、鉀含量均高于對照。植株全氮含量達(dá)到顯著性差異，增加了18.3%，而全磷、全鉀差異則達(dá)到極顯著水平，分別增加了80.5%和38.7%。推測XL7 菌株促進(jìn)了蓮幼苗地下部的生長，促使了其地上部生物量以及養(yǎng)分積累量的相應(yīng)增加。

表2 接種菌株對蓮幼苗的影響

2.4.2 促生菌對土壤速效養(yǎng)分含量的影響XL7 菌株接種蓮子盆栽后對土壤中養(yǎng)分的影響如表3 所示。一個月后與對照相比，土壤中礦質(zhì)態(tài)氮增加了5.3%，但差異不顯著。速效磷和速效鉀分別提高了31.8%和26.1%，差異顯著。促生菌的固氮作用能夠為作物提供氮素營養(yǎng)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可以相應(yīng)降低化肥用量，從而有利于改善蓮子的品質(zhì)。

表3 接種菌株對土壤速效養(yǎng)分含量的影響

3 小結(jié)與討論

從湘蓮根際土壤中分離出7 株兼具固氮和解磷功能的細(xì)菌，并對其固氮和解磷能力進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)4 株菌株具有較強的固氮能力，其中XL7 溶磷能力最強。采用Salkowski 比色法進(jìn)一步比較了菌株產(chǎn)IAA 的能力，顏色變化顯示XL7 分泌IAA 的能力最強。故選取XL7 進(jìn)行下一步的促生研究。結(jié)果表明，接種XL7 能促進(jìn)蓮子的萌發(fā)，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、苗長、苗重和不定根重均高于對照。土壤中礦質(zhì)態(tài)氮、速效磷和速效鉀分別提高了5.3%、31.8%和26.1%。蓮幼苗植株生物量、全氮、全磷和全鉀分別增加了25.0%、18.3%、80.5%和38.7%。這說明XL7 菌株對湘蓮具有良好的促生作用。

具備固氮和溶磷功能的菌株可以通過生物固氮或者生物溶磷為植物提供氮素及磷素營養(yǎng)，是微生物肥料中主要的菌株。Alam 等[7]的研究發(fā)現(xiàn)接種固氮菌（Azotobactersp.）使水稻干物質(zhì)量、水稻產(chǎn)量及氮的積累量增加6%～24%。雷學(xué)軍等[8]、梅新蘭等[9]對玉米和甜高粱（Sorghum bicolor）根際溶磷菌進(jìn)行分離和應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)接種溶磷菌的處理植株生物量均有提高。細(xì)菌可以通過直接或間接的方式促進(jìn)植物生長，如產(chǎn)氨、鐵載體、生長素、抗生素等[10]。如IAA 已被研究證明能夠促進(jìn)植物的生長并提高植物的抗逆能力[11-12]。Goswami 等[13]從鹽漬地中篩選得到一株產(chǎn)IAA 的菌株Kocuria turfanensis2M4，盆栽試驗表明該菌株能顯著促進(jìn)花生生長。促生菌株的實際應(yīng)用效果是檢驗其能否發(fā)揮促生作用的重要指標(biāo)。Shah 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，用芽孢桿菌處理番茄（Solanum lycopersicum）能提高番茄種子的發(fā)芽率、幼苗活力指數(shù)和株高、根長、鮮重等生長參數(shù)。郭雨晴等[15]用篩選的株菌對高粱種子進(jìn)行處理，與對照組相比，處理組的高粱幼苗發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長、根長、株高及鮮重均表現(xiàn)出促生作用。郭英等[16]盆栽試驗表明，接種促生菌株可使大豆（Glycine max）幼苗株高增長，提高了大豆幼苗的莖干重、葉干重、根干重等。種子萌發(fā)狀態(tài)影響著成苗率和幼苗質(zhì)量，是關(guān)系田間植株質(zhì)量的重要因素。此研究用篩選的菌株進(jìn)行種子萌發(fā)試驗，通過發(fā)芽率、發(fā)芽勢、芽長、根長、苗長等探明種子活力的高低。結(jié)果顯示促生菌處理下的種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率都高于對照組，但差異不顯著，苗長、苗重和不定根重均顯著高于對照，與趙偉進(jìn)等[17]研究的結(jié)果相似。盆栽試驗中，促生菌處理組顯著提高了蓮子幼苗的生物量，進(jìn)一步驗證了其對種子萌發(fā)和幼苗生長的促生效作用。

由于根際促生菌具有固氮、解磷、溶鉀、產(chǎn)IAA 等能力，因此，能夠改變根際土壤的理化性質(zhì)，從而改善土壤肥力并促進(jìn)植物對養(yǎng)分的吸收。如劉曄等[6]將篩選的根際菌株接種花生盆栽后，與對照相比，土壤中養(yǎng)分礦質(zhì)態(tài)氮、速效磷、速效鉀以及IAA 含量均得到提高。同時，由于根際菌株促進(jìn)了花生根系的生長，從而使花生地上部的生物量以及養(yǎng)分積累量都顯著增加。此試驗中，接種了促生菌的蓮?fù)寥乐械V質(zhì)態(tài)氮、速效磷、速效鉀含量均高于對照，地上部生物量顯著增加。結(jié)合種子發(fā)芽試驗和盆栽促生試驗可以看出，根際促生菌影響的是整個植株地上部和地下部的統(tǒng)一系統(tǒng)。施用促生菌后，促進(jìn)了植物根系生長，提高了對土壤養(yǎng)分的吸收效率以及利用率，而土壤養(yǎng)分的提高又反過來影響了植物的根系分布。在土壤與植株互相影響相互促進(jìn)之下，植株生物量和地上部養(yǎng)分含量都得到了提高。在我國實現(xiàn)農(nóng)藥化肥零增長，“減肥增效”的大背景下，以根際促生菌為基礎(chǔ)的新型微生物肥料的研發(fā)具有巨大的發(fā)展?jié)摿褪袌銮熬啊?/p>