五味子甲素對(duì)炎性腸病小鼠結(jié)腸NF-κB/COX-2 信號(hào)通路的影響*

王紹潔，張 瑩，梁晗業(yè)，張明波，徐志立△

1 大連市兒童醫(yī)院，遼寧 大連 116012； 2 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

炎性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）為一種常見的、慢性、反復(fù)發(fā)作性、非特異性腸炎癥性疾病，病因尚未完全闡明。主要臨床表現(xiàn)包括腹瀉、黏液膿血便、腹痛等，病變連續(xù)性、彌漫性分布于結(jié)腸黏膜及黏膜下層，多數(shù)可累及直腸和乙狀結(jié)腸［1］。

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.（北五味子）的干燥成熟果實(shí)?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》載：五味子性溫，味酸、甘，歸肺、心、腎經(jīng)，具有益氣滋腎、生津斂汗、澀精止瀉、寧心安神等功效［2］。主要化學(xué)成分為木脂素類，其中五味子甲素（去氧五味子素、五味子素A，deoxyschisandrin）為其主要活性成分之一。關(guān)于五味子甲素的相關(guān)研究，以往主要集中于保肝等方面［3］，對(duì)炎性腸病的治療作用報(bào)道甚少，本研究對(duì)此進(jìn)行初步探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物昆明種小鼠60 只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001。

1.2 藥物與試劑五味子甲素（純度≥98%，購(gòu)自南京道斯夫生物科技有限公司，批號(hào)：W-005-151221），使用時(shí)以蒸餾水配制所需濃度。柳氮磺吡啶（SASP）結(jié)腸溶膠囊（廣東強(qiáng)基藥業(yè)有限公司，批號(hào)：160101）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma公司，批號(hào)：SLBP0899V）；核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)ELISA 檢 測(cè) 試 劑 盒（批號(hào)：20160502）、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase，COX-2)ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160503）、羊抗兔IgGHRP（批號(hào)：20160710）、兔抗NF-κB 抗體（批號(hào)：20160605）、兔抗COX-2 抗體（批號(hào)：20160605）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；全蛋白提取試劑盒（批號(hào)：18020220）、BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：17090820）均購(gòu)自江蘇凱基生物股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，賽默飛公司，批號(hào)：61160020）。

1.3 儀器MR-96A 型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；UV-5600 型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；TG-16W 型臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司）；MA240D 型電子分析天平（上海第二天平儀器廠）。

1.4 方法

1.4.1 IBD 模型制備及給藥［4-5］將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、柳氮磺吡啶組及五味子甲素高（80 mg/kg）、中（40 mg/kg）、低（20 mg/kg）劑量組，每組10 只。將500 mg TNBS 溶于50%乙醇制成2.5%TNBS乙醇溶液。小鼠禁食24 h后，腹腔注射10%烏拉坦0.01 mL/g麻醉，將靜脈留置針套管通過小鼠肛門輕輕插入結(jié)腸，至套管頂端距離肛門約3 cm，使小鼠倒立，除正常對(duì)照組外，各組小鼠均向相連的1 mL 注射器內(nèi)緩緩注入TNBS 60 μL。拔出套管，使小鼠保持倒立60 s，放入籠中。正常對(duì)照組小鼠注入同體積50%乙醇溶液。24 h 后各組小鼠按上述方法重復(fù)操作1 次，制備炎性腸病小鼠模型。

小鼠經(jīng)TNBS誘導(dǎo)炎性腸病48 h后，五味子甲素高、中、低劑量組分別灌胃五味子甲素80、40、20 mg/kg，柳氮磺吡啶組灌胃柳氮磺吡啶500 mg/kg，正常對(duì)照組與模型對(duì)照組灌胃等體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)14天。

1.4.2 IBD小鼠活動(dòng)、排便及糞便隱血情況 造模結(jié)束，稱量小鼠體質(zhì)量，觀察小鼠一般狀態(tài)，記錄活動(dòng)及排便情況。末次給藥后，各組小鼠單只放入小鼠盒內(nèi)3 h，觀察各組小鼠糞便形狀、質(zhì)地，記錄排便次數(shù)。以每?；蛎慷眩ú荒芊智辶?shù)者）為1次，記錄排便總次數(shù)。以濾紙上有無污跡作為稀便、干便區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，記錄稀便次數(shù)。稀便率（%）=稀便次數(shù)/總便次數(shù)×100%。收集各組小鼠3 h糞便，稱糞便濕重，置于80 ℃烘箱中30 min 后，稱糞便干重，計(jì)算糞便含水率（%）=（糞便濕重-糞便干重）/糞便濕重×100%。

使用隱血試劑盒說明書測(cè)定小鼠糞便隱血程度。考察各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI），用大便性狀改變和有無便血作為DAI 評(píng)價(jià)小鼠IBD 評(píng)分。糞便性狀評(píng)分：稀便率0%～19%計(jì)0分，20%～39%計(jì)1分，40%～59%計(jì)2分，60%～79%計(jì)3 分，80%～100%計(jì)4 分；隱血程度：陰性0分，弱陽性1分，陽性2分，強(qiáng)陽性3分，肉眼可見便血4 分。DAI 評(píng)分=糞便性狀評(píng)分+隱血程度評(píng)分。

1.4.3 ELISA 實(shí)驗(yàn) 末次給藥2 h 后，頸脫臼法處死小鼠，迅速取血及剪取結(jié)腸，結(jié)腸用預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈，用冰生理鹽水制成10%組織勻漿，離心半徑8 cm，3500 r/min 離心10 min，取上清，檢測(cè)IBD 小鼠結(jié)腸組織中NF-κB、COX-2 及血清COX-2含量。

1.4.4 免疫組化實(shí)驗(yàn)［6］末次給藥2 h 后，頸脫臼法處死將小鼠，馬上剖取結(jié)腸組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、一抗孵育，DAB顯色，復(fù)染，中性樹膠封片等步驟，檢測(cè)結(jié)腸組織中NF-κB和COX-2表達(dá)。

1.4.5 Western Blot 實(shí)驗(yàn)［7］總蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，取膜，置于5%脫脂奶粉37 ℃孵育2 h。將NF-κB、COX-2 以及β-actin 蛋白抗體分別配成1∶1000 和1∶800 濃度，4 ℃孵育過夜，TTBS室溫下脫色搖床洗3次，每次5 min。同上方法稀釋二抗（1：2000），室溫下孵育90 min，室溫下TTBS洗3次，每次5 min。DAB顯色，Image J掃描分析。以NF-κB、COX-2 與β-actin 面積灰度比值作為NF-κB、COX-2表達(dá)量。

1.4.6 RT-PCR實(shí)驗(yàn)［8］將各組小鼠0.1 g結(jié)腸組織勻漿，常規(guī)方法提取總RNA，按試劑盒說明書所示比例配制反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳。各反應(yīng)引物序列為NF-κB：上游5'-TGCCAAGAGTGATGACGAGGAGAG-3'，下游5'-TGAGCGTGGAGGTGGATGATGG-3'（327 bp）；COX-2：上游5'-CCACCTCTGCGATGCTCTTC-3'，下游5'-ACATTCCCCACGGTTTTGAC-3'（107bp）；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）：上游5'-GGG AAA TCG TGC GTG ACA T-3'，下游5'-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3'（381 bp），引物均由生工生物工程（上海）公司制備。PCR 反應(yīng)條件設(shè)定為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性5 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s （共37個(gè)循環(huán)）。凝膠成像系統(tǒng)拍照，應(yīng)用待測(cè)基因與β-actin 條帶積分光密度比值檢測(cè)待測(cè)基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.5軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量和DAl正常對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，行為活躍，毛發(fā)光澤，肛周潔凈，大便成形；模型對(duì)照組小鼠精神萎靡，攝食減少，活動(dòng)明顯減少，皮毛松聳，拱背，大便稀軟或腹瀉，體質(zhì)量減少明顯，隱血檢測(cè)呈強(qiáng)陽性。各給藥組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，體質(zhì)量逐漸增加。給藥14 天后，與模型對(duì)照組相比，各給藥組小鼠體質(zhì)量增加明顯，五味子甲素高、中劑量組與柳氮磺吡啶組小鼠隱血程度及DAI 降低（P＜0.05）。見表1—2。

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s）g

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s）g

注：*表示與模型對(duì)照組比較，P＜0.05；#表示與正常對(duì)照組比較，P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組五味子甲素高劑量組五味子甲素中劑量組五味子甲素低劑量組柳氮磺吡啶組給藥14天25.2±1.5*16.6±1.3#23.3±1.3*21.9±1.8*21.3±2.4*22.7±1.2*鼠數(shù)10 10 10 10 10 10給藥前21.6±1.2 21.9±1.8 21.8±2.3 21.3±2.2 21.1±1.4 21.5±2.1給藥1天19.9±1.4 19.1±2.1 19.0±1.9 18.6±1.8 18.5±2.0 19.1±1.8給藥7天22.8±1.6*18.9±1.4#21.7±2.8*20.6±1.5 20.4±2.9 21.2±1.8*

表2 各組小鼠隱血程度和DAl評(píng)分比較（±s）分

表2 各組小鼠隱血程度和DAl評(píng)分比較（±s）分

注：*表示與模型對(duì)照組比較，P＜0.05；#表示與正常對(duì)照組比較，P＜0.05

DAI 1.6±0.7*5.4±0.7#3.1±0.8*4.0±1.1*5.1±0.9 3.0±0.7*組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組五味子甲素高劑量組五味子甲素中劑量組五味子甲素低劑量組柳氮磺吡啶組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10隱血程度1.4±0.7*2.6±0.5#1.7±0.6*1.9±0.7*2.5±0.5 1.9±0.6*

2.2 小鼠腹瀉情況與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠排便次數(shù)、稀便率及糞便含水率均增加（P＜0.01），與模型對(duì)照組比較五味子甲素高、中劑量組小鼠排便次數(shù)、稀便率及糞便含水率均改善（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠腹瀉情況比較（±s）

表3 各組小鼠腹瀉情況比較（±s）

注：*表示與模型對(duì)照組比較，P＜0.05；#表示與正常對(duì)照組比較，P＜0.05

稀便（%）14.1±3.3*72.2±11.2#33.1±7.6*49.8±12.4*65.8±14.3 32.0±5.3*組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組五味子甲素高劑量組五味子甲素中劑量組五味子甲素低劑量組柳氮磺吡啶組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10排便次數(shù)（次）6.7±1.6*11.1±2.5#7.6±1.3*8.6±1.3*10.4±2.5 7.8±1.5*糞便含水量（%）37.4±8.9*79.1±6.1#48.9±8.2*56.7±7.4*72.0±11.2 46.7±3.2*

2.3 小鼠NF-κB、COX-2 含量與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清COX-2及結(jié)腸組織NF-κB、COX-2 含量增加（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，五味子甲素高劑量組及柳氮磺吡啶可抑制小鼠體內(nèi)NF-κB、COX-2水平。見表4。

表4 各組小鼠體內(nèi)NF-κB及COX-2含量比較（±s）

表4 各組小鼠體內(nèi)NF-κB及COX-2含量比較（±s）

*表示與模型對(duì)照組比較，P＜0.05；#表示與正常對(duì)照組比較，P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組五味子甲素高劑量組五味子甲素中劑量組五味子甲素低劑量組柳氮磺吡啶組結(jié)腸組織中NF-κB（ng/0.1 g）0.258±0.396*0.858±0.126#0.507±0.131*0.633±0.094*0.766±0.125 0.581±0.114*鼠數(shù)10 10 10 10 10 10血清中COX-2（ng/mL）0.238±0.836*0.880±0.157#0.377±0.098*0.593±0.120 0.816±0.077 0.396±0.120*結(jié)腸組織中COX-2（ng/0.1 g）0.130±0.030*0.284±0.068#0.138±0.024*0.214±0.043 0.254±0.048 0.179±0.061*

2.4 小鼠NF-κB、COX-2 蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織NF-κB和COX-2表達(dá)增加，各給藥組降低，其中高劑量組與柳氮磺吡啶組減少更顯著。正常對(duì)照組、高劑量組及柳氮磺吡啶組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞陽性染色很少；模型對(duì)照組大部分上皮細(xì)胞及浸潤(rùn)的炎細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，染色呈深棕色；中、低劑量組部分上皮細(xì)胞呈陽性反應(yīng)。見圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸中NF-κB、COX-2表達(dá)（免疫組化法，×400）

2.5 小鼠結(jié)腸組織NF-κB、COX-2 表達(dá)與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織COX-2 表達(dá)增加（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，五味子甲素各劑量組小鼠結(jié)腸平滑肌內(nèi)NF-κB、COX-2 表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖2及表5。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)電泳圖

表5 各組小鼠結(jié)腸組織NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組小鼠結(jié)腸組織NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)比較（±s）

注：*表示與模型對(duì)照組比較，P＜0.05；#表示與正常對(duì)照組比較，P＜0.05

COX-2/β-actin 0.47±0.07*1.17±0.17#0.62±0.09*0.82±0.07*0.87±0.16*組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組五味子甲素高劑量組五味子甲素中劑量組五味子甲素低劑量組鼠數(shù)NF-κB/β-actin 0.56±0.12*1.02±0.18#0.58±0.09*0.68±0.10*0.74±0.07*6 6 6 6 6

2.6 小鼠結(jié)腸組織NF-κB、COX-2 mRNA 表達(dá)與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組COX-2、NF-κB mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，五味子甲素高劑量組與柳氮磺吡啶組COX-2、NF-κB mRNA表達(dá)減少（P＜0.05）。見表6、圖3。0.22±0.05*0.70±0.12#0.27±0.05*0.59±0.05*0.79±0.09 0.33±0.07*

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織NF-κB、COX-2 mRNA表達(dá)電泳圖

表6 各組小鼠結(jié)腸組織NF-κB mRNA、COX-2 mRNA表達(dá)（±s）

表6 各組小鼠結(jié)腸組織NF-κB mRNA、COX-2 mRNA表達(dá)（±s）

注：*表示與模型對(duì)照組比較，P＜0.05；#表示與正常對(duì)照組比較，P＜0.05

COX-2 mRNA/β-actin組別鼠數(shù)NF-κB mRNA/β-actin 0.22±0.05*0.70±0.12#0.27±0.05*0.59±0.05*0.79±0.09 0.33±0.07*正常對(duì)照組模型對(duì)照組五味子甲素高劑量組五味子甲素中劑量組五味子甲素低劑量組柳氮磺吡啶組6 6 6 6 6 6 0.32±0.09*1.01±0.10#0.42±0.03*0.89±0.15 0.91±0.13 0.44±0.05*

3 討論

IBD 是一種慢性反復(fù)發(fā)作的炎癥性腸道疾病，主要包括克羅恩?。–rohn's disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）［9］，環(huán)境因素、免疫因素及遺傳因素等均影響炎性腸病的進(jìn)展。近年來，IBD 的發(fā)病率尤其在社會(huì)經(jīng)濟(jì)高度發(fā)達(dá)的國(guó)家和地區(qū)持續(xù)增高［10］。近年，IBD 在我國(guó)的發(fā)病率及確診率亦逐年增加［11］。

IBD 屬中醫(yī)“泄瀉”范疇。“泄瀉”是機(jī)體感受外邪、飲食所傷、情志失調(diào)及臟腑虛弱等原因?qū)е碌钠⑽甘軗p、濕困脾土、腸道功能失司。“泄瀉”的主要病變?cè)谄⑽概c大小腸，病變主臟在脾，脾失健運(yùn)是關(guān)鍵，同時(shí)與肝、腎密切相關(guān)。病理因素主要是濕，濕為陰邪，易困脾陽，脾受濕困，則運(yùn)化不健，《醫(yī)宗必讀》載“無濕不成瀉”。“泄瀉”可夾寒、夾熱、夾滯。脾虛濕盛是導(dǎo)致泄瀉的關(guān)鍵［12］。

NF-κB 在許多細(xì)胞中均有表達(dá)，是一種普遍存在的具有多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，并且NF-κB 為多種重要生理過程的主要調(diào)節(jié)因子，對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。在IBD復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)中，NF-κB 活化是其中一個(gè)中心環(huán)節(jié)。NF-κB 長(zhǎng)期激活可加重腸上皮慢性炎癥［13］，并且NF-κB 的長(zhǎng)期激活所致炎癥與多種類型癌癥風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（如IBD 與典型結(jié)腸癌等）［13-14］。COX-2是環(huán)氧酶的一種亞型，正常組織細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，但在刺激因素（細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、腫瘤促進(jìn)劑及癌基因等）作用下可大量合成而高表達(dá)，COX-2上調(diào)與炎癥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。NF-κB過表達(dá)可激活下游靶基因COX-2表達(dá)上調(diào)；而COX-2 也可通過參與ROS 代謝促進(jìn)NF-κB 激活和破壞上皮屏障完整性［15］。

五味子中主要成分包括揮發(fā)油、木脂素類、多糖以及有機(jī)酸類。現(xiàn)代研究表明五味子具有廣泛的生物活性，中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面，可保護(hù)腦組織、增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力、鎮(zhèn)靜安眠、抗衰老、鎮(zhèn)痛等；在消化系統(tǒng)方面可抗?jié)?；心血管系統(tǒng)方面具有抗心肌缺血、抑制心肌收縮力、減慢心率及降血壓等作用；亦有降血糖、肝保護(hù)、增強(qiáng)免疫功能等作用［16-18］。五味子甲素為五味子中含有的木脂素類活性成分，但目前缺乏對(duì)其藥理活性的深入研究。

本研究結(jié)果顯示，五味子甲素可抑制IBD 小鼠體質(zhì)量減輕，減少TNBS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠排便次數(shù)，降低稀便率及糞便含水量，并能緩解IBD 小鼠糞便隱血程度及疾病活動(dòng)指數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，五味子甲素能夠抑制IBD 小鼠體內(nèi)NF-κB、COX-2 基因轉(zhuǎn)錄和mRNA表達(dá)，下調(diào)COX-2、NF-κB蛋白表達(dá)。

總之，五味子甲素可能通過抑制IBD的NF-κB/COX-2 通路激活從而抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，發(fā)揮抗炎作用，達(dá)到治療IBD的目的。