基于GEO 芯片探究槲皮素對銀屑病外周血中性粒細胞的分子作用機制*

陳廣芳，文昌暉

1 貴州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，貴州 貴陽 550002；2 貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550002

銀屑病是一種慢性炎癥性和自身免疫性疾病，典型病理學特征為大量中性粒細胞浸潤于表皮［1］，中性粒細胞外誘捕網(wǎng)參與心血管、腎臟損傷等血管內(nèi)皮損傷過程［2］，增加心血管事件風險，抑制中性粒細胞活化可減輕銀屑病皮損。銀屑病尚無根治方案，目前銀屑病的中醫(yī)藥治療確有療效，相比多數(shù)治療方案，可減輕患者經(jīng)濟負擔。

前期參照孫遜等［3］的中藥復方網(wǎng)絡(luò)藥理學研究思路及過程，分別分析4 位名家驗方干預銀屑病的主要有效成分，包括趙炳南先生涼血活血湯［4］、國醫(yī)大師禤國維教授皮膚解毒湯［5］、李斌教授益氣活血方［6］、賈敏教授消疕湯［7］，通過對比分析發(fā)現(xiàn)其干預銀屑病的有效成分均含有槲皮素。

目前無銀屑病外周血中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）病理機制以及槲皮素干預銀屑病外周血NE 作用機制文獻報道，本研究通過GEO 芯片分析及分子對接原理分析銀屑病外周血NE 的病理機制，并探究槲皮素干預銀屑病外周血NE的作用機制。

1 數(shù)據(jù)庫與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫本研究主要運用的數(shù)據(jù)庫和平臺包括GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、GO數(shù)據(jù)庫（gene ontology，http：//geneontology.org/）、KEGG數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https：//www.kegg.jp/）、中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、DrugBank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/）、DGIdb 數(shù)據(jù)庫（http：//www.dgidb.org/）、MY CANCER GENOME數(shù)據(jù)庫（https：//www.mycancergenome.org/）、SwissTargetPrediction 數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、String平臺（https：//string-db.org/）及RCSB PDB（https：//www.rcsb.org/）等。

1.2 疾病GEO芯片熱圖繪制通過GEO數(shù)據(jù)庫收集GSE106087芯片與平臺數(shù)據(jù)信息，通過R軟件及edgeR、pheatmap等插件，設(shè)定P＜0.05，F(xiàn)DR＜1，將差異基因?qū)隕xcel表格，繪制熱圖。

1.3 疾病差異性基因基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG 富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）運用R 軟件及enrichplot、ggplot2、DOSE、cluster Profiler、colorspace、stringi等插件，上傳銀屑病NE差異性基因至GO和KEGG數(shù)據(jù)庫，按照P＜0.01和q＜0.05 標準篩選，將槲皮素干預銀屑病外周血NE的靶點基因富集分析結(jié)果分別導入Excel表格，繪制氣泡圖及圈圖。

1.4 化合物靶標基因收集通過TCMSP、Drug-Bank［8］、DGIdb 和MY CANCER GENOME 數(shù)據(jù)庫收集槲皮素預測靶點基因，與Excel 表格取交集基因，匯總到txt文件中。

1.5 槲皮素干預銀屑病外周血NE 的拓撲網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及驗證將槲皮素與銀屑病外周血NE的差異基因取交集后導入Cytoscape 3.7.2中，依次運用Bisogenet和CytoNCA 插件，設(shè)置計算中心度（DC）＞61，構(gòu)建蛋白互助拓撲網(wǎng)絡(luò)，收集核心基因。運用String平臺驗證槲皮素干預銀屑病外周血NE差異性基因，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(proteinprotein interactions，PPI)，剔除PPI 網(wǎng)絡(luò)中游離蛋白，收集核心差異性蛋白及基因。

1.6 分子對接證據(jù)支持收集Pubchem 數(shù)據(jù)庫中槲皮素結(jié)構(gòu)，通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載槲皮素干預銀屑病外周血NE 核心差異性蛋白結(jié)構(gòu)，運用PyMOL軟件去除水分子、小分子配體，并運用AutoDock軟件加氫等處理后，運用Vina 進行分子對接模擬并獲取對接能量，通過PyMOL 獲得受體與配體分子對接可視化圖。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病外周血NE 的GEO 芯片熱圖從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE106087芯片與平臺數(shù)據(jù)，共6個樣本，獲得下調(diào)基因36個，上調(diào)基因153個。展示上調(diào)基因和下調(diào)基因各30 個，顏色深度代表基因表達程度，顏色越紅，基因表達越顯著；顏色越綠，基因表達越不顯著。Con 代表健康人NE 樣本基因、Treat代表銀屑病患者樣本基因。見圖1。

圖1 正常人與銀屑病患者外周血NE差異基因熱圖

2.2 銀屑病外周血NE差異性基因GO富集分析銀屑病外周血NE 差異性基因GO 富集分析包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組成（cellular component，CC），按照P＜0.01 和P.adjust＜0.05篩選，共461種生物功能，其中432條BP、23條CC、6 條MF，均展示前10 條。綜合P 值及富集程度，繪制圈圖，fold change＞0 為上調(diào)，反之為下調(diào)。主要與生物過程中性粒細胞活化、對細菌來源分子反應等上調(diào)，以及與生物過程嗜中性粒細胞脫顆粒、中性粒細胞激活參與免疫反應、中性粒細胞介導的免疫等下調(diào)密切相關(guān)。見圖2—3。

圖2 銀屑病患者外周血NE的GO富集分析氣泡圖

圖3 銀屑病患者外周血NE的GO富集分析圈圖

2.3 銀屑病外周血NE 差異性基因KEGG 富集分析按照P＜0.01和P.adjust＜0.05篩選，共12條信號通路。綜合P值及富集程度，繪制氣泡圖和圈圖，fold change＞0 為上調(diào)，反之為下調(diào)，結(jié)果顯示銀屑病外周血NE 的病理機制主要與ECHDC3、ARG1、OLFM4、CLEC12A 基因及中性粒細胞活化、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用等信號通路等上調(diào)，以及XIST、BTNL3、CCR3、SPP1 基因和中性粒細胞脫顆粒生物過程、NOD 樣受體信號通路等下調(diào)關(guān)系密切。見圖4—5。

圖4 銀屑病患者外周血NE的KEGG富集分析氣泡圖

圖5 銀屑病患者外周血NE的KEGG富集分析圈圖

2.4 槲皮素干預銀屑病外周血NE 基因的拓撲網(wǎng)絡(luò)將槲皮素與銀屑病外周血NE 的差異基因取交集后，共收集11個差異性基因于txt文件中，導入Cytoscape 3.7.2 軟 件，使 用Bisogenet 和Cyto NCA，設(shè)置計算中心度（DC）＞61，構(gòu)建蛋白互助拓撲網(wǎng)絡(luò)。拓撲網(wǎng)絡(luò)共得到JUN、SSP1 等28 個候選基因，其中JUN 處于最核心位置。將txt 與Excel 進行交集分析，獲得槲皮素下調(diào)銀屑病外周血NE 基因為MAOA、FLT3、MPO、CYP1B1、CDK5R1、ARG1、NQO2，上調(diào)銀屑病NE 基因為CCL2、IL1B、JUN、SPP1。此外，將JUN、SPP1等11個差異性基因上傳至String平臺，進行PPI分析，可見下調(diào)銀屑病外周血NE 基因FLT3、MPO、CDK5R1、ARG1 以及上調(diào)銀屑病外周血NE 基因CCL2、IL1B、JUN、SPP1 處于核心位置。綜上可知JUN、SPP1 靶標處于核心地位。見圖6—7。

圖6 槲皮素干預銀屑病外周血NE的基因拓撲網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息

2.5 槲皮素干預銀屑病外周血NE靶點基因GO富集分析使用R 軟件，根據(jù)槲皮素干預銀屑病外周血NE靶點基因，進行GO富集分析，并分別以BP、CC和MF歸類收集，以P＜0.01和q＜0.05標準篩選，共收集291條BP、7條CC、14條MF。根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度，繪制氣泡圖和圈圖，fold change＞0為上調(diào)，反之為下調(diào)，可知，槲皮素干預銀屑病外周血NE 主要與ERK1 和ERK2 級聯(lián)調(diào)控、對脂多糖的反應、JAK-STAT 信號通路的脂多糖和受體等上調(diào)，以及ERK1 和ERK2 級聯(lián)反應、對細菌來源分子的反應等下調(diào)密切相關(guān)。見圖8—9。

圖8 槲皮素干預銀屑病患者外周血NE的GO富集分析氣泡圖

圖9 槲皮素干預銀屑病患者外周血NE的GO富集分析圈圖

2.6 槲皮素干預銀屑病外周血NE靶點基因KEGG富集分析取P＜0.02 和P＜0.05，共篩選出34條（展示前20 條），主要涉及：可卡因成癮、類風濕性關(guān)節(jié)炎、IL-17信號通路、糖尿病并發(fā)癥的AGERAGE 信號通路、美洲錐蟲病、Toll 樣受體信號通路、TNF 信號通路、耶爾森菌感染、液體剪切應力和動脈粥樣硬化、色氨酸代謝、NOD 樣受體信號通路。綜合P值及富集程度，繪制氣泡圖，fold change＞0 為上調(diào)，反之為下調(diào)。結(jié)果顯示槲皮素干預銀屑病外周血NE 主要與類風濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號通路、NOD 樣受體信號通路等上調(diào)，以及可卡因成癮、IL-17 信號通路、TNF 信號通路等下調(diào)密切相關(guān)，logFC＞0 為上調(diào)信息，反之為下調(diào)信息。見圖10—13。

圖10 槲皮素干預銀屑病患者外周血NE的KEGG富集分析氣泡圖

圖11 槲皮素干預銀屑病患者外周血NE的KEGG富集分析圈圖

圖12 白細胞介素17信號通路

圖13 腫瘤壞死因子信號通路

2.7 分子對接證據(jù)支持通過RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫，分別收集槲皮素可下調(diào)的FLT3、MPO、CDK5R1、ARG1 以及上調(diào)CCL2、IL1B、JUN、SPP1 蛋白（受體）結(jié)構(gòu)信息，運用PyMOL、AutoDock、Vina 等軟件處理受體與配體（槲皮素）結(jié)構(gòu)信息并進行分子對接模擬，分別收集分子對接模擬的最佳對接能量，繪制可視化圖，以能量最低的結(jié)構(gòu)為最佳結(jié)構(gòu)，能量小于0 說明配體和受體可自主結(jié)合，繪制槲皮素與JUN、SPP1 等6 種受體的分子對接可視化圖，而槲皮素與FLT3、CDK5R1 蛋白無法進行分子對接。圖中紅色箭頭處為槲皮素與蛋白分子對接最佳結(jié)構(gòu)。見圖14、表1。

表1 槲皮素及其相關(guān)蛋白分子對接模擬能量

以上結(jié)果表明，槲皮素干預銀屑病外周血NE機制主要與下調(diào)MPO、ARG1 和上調(diào)CCL2、IL1B、JUN、SPP1 及其影響的病理過程密切相關(guān)，進而下調(diào)IL-17 信號通路、TNF 信號通路，以及上調(diào)類風濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號通路、NOD 樣受體信號通路等，其中與下調(diào)IL-17 信號通路、TNF信號通路關(guān)系最大。

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性和自身免疫性疾病，目前病理機制尚不清楚，文獻認為IL-23/Th17 軸深度參與了銀屑病的發(fā)病機制，調(diào)節(jié)IL-23/Th17軸可以減輕銀屑病皮損［1］。中性粒細胞是含量最多的固有免疫細胞，其致病機制主要與慢性炎癥性、自身免疫性疾病相關(guān)［9］，中性粒細胞浸潤與銀屑病的初始和維持階段有關(guān)［1］。IL-23/Th17 軸由中性粒細胞浸潤和角質(zhì)形成細胞相互作用產(chǎn)生［10］，中性粒細胞可誘導肥大細胞、γδT 細胞、胞漿細胞、受損皮膚和滑膜液中的固有淋巴樣細胞分泌IL-17A［11］，IL-17A 上調(diào)角質(zhì)形成細胞表達CCL20 水平，CCL20 可與趨化因子受體CCR6 結(jié)合；浸潤的中性粒細胞的外泌體誘導角質(zhì)形成細胞表達HSP70，TLR4與其受體HSP70結(jié)合后產(chǎn)生IL-23，IL-23 促進Th17 細胞的活化并分泌IL-17A、IL-17F 和IL-22，IL-17A 和IL-22 誘導角質(zhì)形成細胞增殖［12］；活化的角質(zhì)形成細胞可釋放外泌體，負反饋促進中性粒細胞活化［13］；同時，在CCR6 影響下，天然Th17 細胞被招募到銀屑病表皮，并在IL-23和IL-1β輔助下浸潤于表皮下，創(chuàng)建IL-23/Th17軸框架，加重銀屑病皮損。在關(guān)節(jié)中，IL-17A 可作用于成纖維細胞、破骨細胞、軟骨細胞和成骨細胞等，上調(diào)抗菌肽、趨化因子、促炎和增殖細胞因子水平，促進組織炎癥和骨重塑，引發(fā)銀屑病關(guān)節(jié)炎［11］。SHAO 等［14］認為，中性粒細胞外泌體誘導角質(zhì)形成細胞中炎癥基因表達，通過上調(diào)NF-κB 和MAPK 信號通路，上調(diào)IL-1β、IL-36G、IL-18、TNF-α和趨化因子（C-X-C基序）配體等表達水平，并募集于皮膚中，且活化的IL-36可抑制彈性酶、組織蛋白酶G和絲氨酸蛋白酶抑制劑A1 和A3［15］，最終引發(fā)膿皮病型銀屑病。另外，活化的NF-κB 信號誘導角質(zhì)細胞角蛋白6 和16 表達，減少細胞代謝周期［12］，進而促進角化不全。IL-17A和IL-22可上調(diào)TNF-α 表達，銀屑病皮損中過表達抗菌肽LL-37，均可激活樹突狀細胞，加速中性粒細胞等炎性細胞從外周血向皮膚浸潤［12］。因此，有效干預銀屑病中性粒細胞活化及浸潤可減輕銀屑病皮損，中性粒細胞成為干預銀屑病的有效靶點之一。

槲皮素是一種黃酮類物質(zhì)，廣泛存在于中藥材及食物中，具有抗炎、抗氧化、保護血管及免疫調(diào)節(jié)等多種生物特性，可被用于干預中性粒細胞介導的炎癥性疾?。?6］。槲皮素通過下調(diào)Th17 細胞活性［17-18］，進而下調(diào)IL-1β、IL-6、IL-17、IL-36G、TNF-α和趨化因子配體等表達，抑制中性粒細胞從外周血浸潤于皮膚；同時，下調(diào)IL-17A、IL-17F和IL-22 表達，抑制角質(zhì)形成細胞增殖，從而減輕銀屑病皮損。槲皮素減少脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對角化細胞的刺激，進而釋放趨化因子［19］。槲皮素通過炎癥相關(guān)信號通路抑制中性粒細胞活性［20］，同時，抑制中性粒細胞自噬及NETs 形成，并抑制中性粒細胞浸潤，降低外周血炎癥細胞因子水平，最終促進活化的中性粒細胞凋亡［21］。此外，ZHU 等［22］研究發(fā)現(xiàn)槲皮素抑制UVB照射誘導毒性引起角質(zhì)形成細胞釋放ROS 短暫性升高，并促進細胞膜流動性和抑制線粒體膜去極化，進而減輕ROS對細胞膜和線粒體的損害。

綜上所述，槲皮素干預銀屑病外周血NE 主要與6 個核心靶點基因有關(guān)，分別是下調(diào)MPO、ARG1和上調(diào)CCL2、IL1B、JUN、SPP1靶標基因，而JUN、SSP1處于核心地位，說明槲皮素主要通過下調(diào)IL-17信號通路、TNF信號通路，以及調(diào)節(jié)銀屑病1L-23/Th17軸，達到干預銀屑病外周血NE 水平，抑制中性粒細胞在銀屑病皮損區(qū)的浸潤，減輕銀屑病皮損。此外，槲皮素可減輕UVB 對皮膚照射的損傷，因此，將含槲皮素的中藥作為干預銀屑病的單體或一種防曬劑值得進一步研究。