基于生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討麥門冬湯治療特發(fā)性肺纖維化的miRNA 預(yù)測及其作用機(jī)制*

盧夢月，劉 銳，周 瑩，田 智，劉付昌盛

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530200； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是最常見的間質(zhì)性肺疾病，預(yù)后差，病死率高。IPF中位生存期為2.5～3.5年，死亡年齡中位數(shù)為65 歲，并且發(fā)病率隨年齡增長而增加。現(xiàn)有治療方案中，IPF 患者經(jīng)酪氨酸激酶抑制劑尼達(dá)尼布和抗纖維化吡啶類藥物吡非尼酮治療雖然能減緩強(qiáng)迫肺活量的降低和疾病進(jìn)展速度［1-4］，但長期療效尚不確定，且不能完全有效降低死亡率、提高生存率，因此，需要尋找新的靶點(diǎn)和藥物干預(yù)措施，以便更有效地治療IPF，降低其死亡率。

麥門冬湯出自《金匱要略》，為肺痿專設(shè)湯劑。原方由麥門冬七升、半夏一升、人參三兩、甘草二兩、粳米三合、大棗十二枚組成，有滋養(yǎng)肺胃，降逆和中功效，原治呃逆上氣，咽喉不利證，后世醫(yī)家用于因肺胃陰虛，虛火上炎所致的肺痿胃陰虧虛證［5］。本研究主要通過生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討麥門冬湯治療肺纖維化的可能機(jī)制。

1 方法

1.1 麥門冬湯藥物活性成分和靶點(diǎn)篩選運(yùn)用中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具（A bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM）以得分≥30與P＜0.05為臨界值［6］，中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（druglikeness，DL）≥0.18［7］檢索麥門冬湯相關(guān)化合物及其靶點(diǎn)，將收集到的中藥活性成分剔除重復(fù)后與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)合分析。

1.2 lPF 相關(guān)疾病靶點(diǎn)檢索以“Idiopathic pulmonary fibrosis”作為關(guān)鍵詞檢索人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards）、比較毒物基因組數(shù)據(jù)庫（CTD）、基因疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫（DisGeNET）、藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫（DrugBank）和在線孟德爾人類遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）中已知的疾病靶點(diǎn)，數(shù)據(jù)清理原則為某一疾病靶點(diǎn)至少在3 個(gè)數(shù)據(jù)庫中都被收錄，保存刪除重復(fù)后所得靶點(diǎn)。

1.3 lPF相關(guān)靶點(diǎn)在美國國立生物中心基因表達(dá)集數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）以“Idiopathic pulmonary fibrosis”為關(guān)鍵詞檢索與IPF 相關(guān)的芯片數(shù)據(jù)，獲得編號(hào)為GSE53845 的芯片數(shù)據(jù)原始文件和GPL6480 芯片基因注釋文件，該芯片數(shù)據(jù)的原始文件檢測了包括40例IPF患者、8名健康對照者的肺活檢組織，并進(jìn)行了全基因組轉(zhuǎn)錄組分析。原始數(shù)據(jù)采用robust multiarray average（RMA）算法進(jìn)行背景校正和矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理，利用limma 包二次分析芯片數(shù)據(jù)，以P值（P＜0.05）且以1為底數(shù)的異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）logFC≥1或logFC≤-1 為條件篩選相關(guān)數(shù)值，將篩選出的差異基因與已知IPF疾病靶點(diǎn)取交集，即為IPF發(fā)病過程已知靶點(diǎn)。

1.4 麥門冬湯對lPF 作用靶點(diǎn)預(yù)測通過venny 2.1.0 軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對篩選的麥門冬湯預(yù)測靶點(diǎn)與IPF 相關(guān)發(fā)病機(jī)制基因靶點(diǎn)進(jìn)行對比分析，兩者交集基因即為麥門冬湯治療IPF 作用機(jī)制相關(guān)靶點(diǎn)。并將所得基因靶點(diǎn)導(dǎo)入SRTING 數(shù)據(jù)庫，將物種設(shè)置為人類，獲得相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，保存為TSV 格式，運(yùn)用Cytoscape 軟件對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.5 相關(guān)microRNA 在線預(yù)測將麥門冬湯治療IPF潛在作用靶點(diǎn)的Gene Symbol上傳到microRNA在線預(yù)測工具（http：//ophid.utoronto.ca/mir-DIP/index.jsp）預(yù)測相關(guān)miRNA，按Integrated Score選取前10個(gè)miRNAtargets，通過Cytoscape進(jìn)行可視化分析，探究麥門冬湯通過miRNA 治療IPF的相關(guān)機(jī)制。

1.6 靶點(diǎn)功能富集分析將麥門冬湯治療IPF潛在作用靶點(diǎn)的Gene Symbol 上傳到David 6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行功能富集分析，收集生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和KEGG 通路（KEGGPathway）的富集分析結(jié)果，并以P＜0.05 為顯著富集的生物功能和生物信號(hào)通路，根據(jù)富集分析結(jié)果與相關(guān)信號(hào)通路，探究麥門冬湯潛在靶點(diǎn)治療IPF的相關(guān)機(jī)制。

1.7 分子對接選取Cytoscape軟件拓?fù)浞治鼋Y(jié)果中關(guān)聯(lián)度（degree）值排名前5的化合物及12個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)，從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www1.rcsb.org/）及TCMSP 數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶點(diǎn)與相關(guān)化合物的三維結(jié)構(gòu)與化學(xué)結(jié)構(gòu)，將其上傳至iGEMDOCK 軟件，并對關(guān)鍵靶點(diǎn)與相關(guān)化合物進(jìn)行分子對接分析。

2 結(jié)果

2.1 麥門冬湯的活性成分與靶點(diǎn)篩選共獲得包括麥門冬22 個(gè)、半夏43 個(gè)、人參168 個(gè)、甘草205個(gè)、粳米23個(gè)、大棗74個(gè)在內(nèi)的502個(gè)化合物活性成分，剔除重復(fù)項(xiàng)后共獲得1039 個(gè)麥門冬湯藥物靶點(diǎn)。

2.2 特發(fā)性肺纖維化相關(guān)基因分析與檢索在GeneCards、CTD、DisGeNET、DrugBank 及OMIM 數(shù)據(jù)庫分別檢索到2792、32988、378、24、322 個(gè)靶點(diǎn)，收集至少在3 個(gè)數(shù)據(jù)庫中都被收錄的疾病基因，刪除重復(fù)出現(xiàn)的基因靶點(diǎn)后共獲得與IPF 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的作用靶點(diǎn)303個(gè)。

應(yīng)用GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE53845基因芯片數(shù)據(jù)，通過GEO2R在線工具分析IPF組與對照組數(shù)據(jù)，以P＜0.01 且以1 為底的差異倍數(shù)｜logFC｜≥1 為條件篩選到713個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括430個(gè)上調(diào)基因和283個(gè)下調(diào)基因，并與IPF已知靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共獲取43 個(gè)共同表達(dá)的疾病基因靶點(diǎn)。

2.3 “藥物-疾病”交集靶點(diǎn)預(yù)測麥門冬湯與IPF藥物-疾病交集靶點(diǎn)共12個(gè)。麥門冬湯與IPF交集靶基因包括：精氨酸酶1（ARG1）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、白細(xì)胞介素13（IL13）、血管細(xì)胞黏附蛋白1（VCAM1）、Ⅰ型血管緊張素Ⅱ受體（AGTR1）、缺氧誘導(dǎo)因子1-α（HIF1A）、尿激酶型纖溶酶原激活劑（PLAU）、間質(zhì)膠原酶（MMP1）、基質(zhì)溶素1（MMP3）、膠原α-1（Ⅰ）鏈（COL1A1）、膠原α-1（Ⅲ）鏈（COL3A1）、骨橋蛋白（SPP1），以上靶基因即為麥門冬湯治療IPF的直接或間接作用靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 麥門冬湯與特發(fā)性肺纖維化的藥物-疾病交集靶標(biāo)韋恩圖

將上述12個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲得相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，保存為TSV 格式，運(yùn)用Cytoscape 軟件對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，包括靶點(diǎn)和靶點(diǎn)、靶點(diǎn)和化合物間直接及間接作用關(guān)系。見圖2。

圖2 麥門冬湯治療IPF相關(guān)靶點(diǎn)和化合物網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 miRNA 靶向基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將12 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入mirDIP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行miRNA預(yù)測分析，Minimum Score 選擇very high，共搜索到與預(yù)測靶點(diǎn)相互關(guān)聯(lián)的278條miRNA，按Integrated Score 排序選取前15 個(gè)miRNA，分別是hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-29b-3p、hsamiR-98-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-let-7b-5p、hsalet-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p、hsalet-7f-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsamiR-26a-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-128-3p，將以上miRNA 及其相互關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化分析，見圖3。

圖3 miRNA靶向基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.5 靶點(diǎn)功能富集分析將12 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入David 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路分析，以P＜0.05 為閾值，篩選出麥門冬湯治療IPF 參與的生物學(xué)過程與相關(guān)信號(hào)通路。發(fā)現(xiàn)麥門冬湯治療IPF 潛在作用靶點(diǎn)參與了包括膠原分解過程、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外基質(zhì)分解、膠原蛋白生物合成過程、老化等29 個(gè)生物過程，細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、膠原三聚體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、細(xì)胞外基質(zhì)5 個(gè)細(xì)胞組分，血小板衍生生長因子結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、內(nèi)肽酶活性、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成4 個(gè)分子功能；導(dǎo)出DAVID 數(shù)據(jù)庫GO 功能富集結(jié)果，以P＜0.05 為閾值，篩選出顯著富集條目，將分子功能、細(xì)胞組分及前10 個(gè)條目生物過程相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism 8 軟件繪制成可視化條形圖，見圖4。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示麥門冬湯治療IPF 的信號(hào)通路包括NF-κB 信號(hào)通路、ECM-受體相互作用、TNF 信號(hào)通路等，其中NF-κB 信號(hào)通路差異最顯著，將KEGG 通路富集分析結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)入Omicshare 軟件進(jìn)行可視化分析，見圖5。

圖4 麥門冬湯治療IPF的生物學(xué)分析過程

2.6 交集靶點(diǎn)與相關(guān)化合物的分子對接分析在拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果中，化合物與對應(yīng)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)度（degree）越大，麥門冬湯通過該化合物及其相關(guān)靶點(diǎn)治療IPF 的可能性越大。將關(guān)聯(lián)度排名前5 的化合物槲皮素（quercetin，MOL000098）、山奈酚（kaempferol，MOL000422）、β-胡蘿卜素（betacarotene，MOL002773）、豆甾醇（Stigmasterol，MOL000449）、纈氨酸（Valine，MOL000067）與12 個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)通過iGEMDOCK 進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，得到60 個(gè)對接結(jié)果，見圖6。對接值越低，表示二者結(jié)合性能越好，對接結(jié)果顯示靶點(diǎn)MMP3與化合物β-胡蘿卜素結(jié)合度最高，結(jié)合性能最佳，對接值為-120.723。

3 討論

IPF 是一種進(jìn)行性間質(zhì)纖維化肺病，其病理特征主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞的激活與浸潤、成纖維細(xì)胞大量增殖、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積和肺組織結(jié)構(gòu)破外，目前尚無有效的治療方法。在IPF 的發(fā)生發(fā)展過程中，常涉及多種細(xì)胞因子及多條信號(hào)通路表達(dá)異常，現(xiàn)有的研究試圖從微小核糖核酸和信號(hào)通路層面探索新的治療方案及其相關(guān)機(jī)制。

微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一類非編碼小RNA，長度為19-22 個(gè)核苷酸，在翻譯后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)［8-9］，基于本研究miRNA-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)miR-29 家族、let-7 家族等通過調(diào)節(jié)基因靶點(diǎn)參與了纖維化、肌成纖維細(xì)胞增殖和過度細(xì)胞外基質(zhì)沉積等干預(yù)IPF的進(jìn)程，這與當(dāng)前IPF相關(guān)微小核糖核酸研究不謀而合。miR-29家族均與COL3A1、COL1A1相關(guān)聯(lián)，Let-7家族與IL-13相關(guān)聯(lián)。miR-29家族是第一批在肺、心臟和肝臟纖維化疾病中發(fā)現(xiàn)被下調(diào)的微小核糖核酸之一，被認(rèn)為是肺纖維化的主要調(diào)節(jié)者，COL1A1、COL3A1 是miR-29 的直接靶點(diǎn)，miR-29 通過抑制包括COL1A1、COL3A1 等膠原蛋白在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)與膠原蛋白合成、交聯(lián)和降解相關(guān)的酶而發(fā)揮作用［10］。miR-29在肺纖維化組織中表達(dá)下調(diào)，COL1A1、COL3A1 等膠原蛋白合成增多，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終誘發(fā)肺間質(zhì)纖維化［11-12］。COL1A1 和COL3A1 同為成纖維細(xì)胞纖維化的標(biāo)志物，上皮細(xì)胞損傷后機(jī)體內(nèi)成纖維細(xì)胞可活化為肌成纖維細(xì)胞［13］，肺肌成纖維細(xì)胞的大量聚集和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積被認(rèn)為是IPF 病理機(jī)制之一。Let-7 家族共有l(wèi)et-7a、-7b、-7c、-7d、-7e、-7f、-7g和-7i、miR-98等13個(gè)包含促纖維化過程的負(fù)調(diào)節(jié)因子成員。研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)let-7a 和let-7b 可抑制COL1A1 表達(dá)與肌成纖維細(xì)胞活化［14］，減緩IPF 發(fā)展進(jìn)程。Let-7d 則通過減緩成纖維細(xì)胞增殖，降低其遷移能力及抑制成纖維細(xì)胞因子，上調(diào)Let-7d 表達(dá)可使成纖維細(xì)胞失去部分間充質(zhì)特性而達(dá)到治療IPF 的目的［15］。Let-7c、-7e、-7f、-7g 和-7i 目前研究較少，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子IL-13 表達(dá)，抑制IPF早期炎癥反應(yīng)進(jìn)程，起到抑制IPF的作用。

本研究GO 富集與KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，麥門冬湯干預(yù)IPF 作用靶點(diǎn)主要參與了膠原分解過程、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外基質(zhì)分解、膠原蛋白的生物合成過程、老化等生物過程，參與調(diào)控的信號(hào)通路主要富集于NF-κB 信號(hào)通路、ECM-受體相互作用、TNF 信號(hào)通路等，還富集于癌癥、阿米巴病、黏著斑等疾病通路上。TNF 信號(hào)通路和NF-κB 信號(hào)通路是常見的炎癥相關(guān)信號(hào)通路，血管細(xì)胞黏附蛋白1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）共同富集于這兩條信號(hào)通路上。肺部炎癥反應(yīng)是肺纖維化早期病變，其介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血管生成過多是肺間質(zhì)纖維化的重要病理過程。VCAM-1 是一類膜表面糖蛋白，廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互黏附、結(jié)合的重要黏附因子。NF-κB信號(hào)通路參與機(jī)體免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生理病理過程，VCAM-1 被證實(shí)是其直接靶點(diǎn)，VCAM-1 序列中含有NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)并受其調(diào)控［16-17］。當(dāng)NF-κB 信號(hào)通路激活時(shí)，VCAM1表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，從而誘導(dǎo)肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。TNF信號(hào)通路被激活時(shí)，其關(guān)鍵因子TNF-α 通過刺激血管上皮細(xì)胞促進(jìn)VCAM-1 及其受體表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)纖維化［4］。

本研究發(fā)現(xiàn)麥門冬湯干預(yù)IPF主要與槲皮素，山奈酚，豆甾醇、β-胡蘿卜素等化合物及MMP3、VCAM-1、IL-13等12個(gè)靶點(diǎn)密切相關(guān)，通過對以上化合物及靶點(diǎn)的分子對接分析發(fā)現(xiàn)，靶點(diǎn)MMP3 與化合物β-胡蘿卜素結(jié)合性能最佳。MMP3 是一類主要在上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶，通過在細(xì)胞外基質(zhì)周轉(zhuǎn)過程中激活基質(zhì)金屬蛋白酶原，降解大量的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白不斷重塑，促進(jìn)膠原蛋白沉積［18］。研究發(fā)現(xiàn)MMP3在IPF患者移植肺內(nèi)高表達(dá)，而細(xì)胞和動(dòng)物模型相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MMP3可通過激活肺上皮細(xì)胞中的β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)，增加E-鈣黏蛋白裂解和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終發(fā)展為IPF［19］?；衔铴?胡蘿卜素可能通過與靶點(diǎn)MMP3 高度結(jié)合參與MMP3 誘導(dǎo)IPF 進(jìn)程。而山奈酚、豆甾醇被證實(shí)具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種作用［20-22］，由此推測麥門冬湯可在一定程度上干預(yù)IPF進(jìn)展。

綜上所述，本研究從生物信息學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度系統(tǒng)預(yù)測麥門冬湯治療IPF 的潛在分子機(jī)制，麥門冬湯治療IPF 涉及多個(gè)miRNA、多條通路、多個(gè)靶點(diǎn)，在治療IPF 時(shí)除了針對局部關(guān)鍵通路，還應(yīng)考慮疾病病因、所處機(jī)體環(huán)境差異，進(jìn)行多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)干預(yù)，綜合發(fā)揮中醫(yī)藥多靶點(diǎn)、多方面干預(yù)的可行性和優(yōu)勢。