不同干燥時(shí)長(zhǎng)對(duì)小麥成熟胚愈傷組織再生進(jìn)程的影響

沈躍鵬 趙國(guó)建 趙鵬飛 金建猛 趙國(guó)軒

（開封市農(nóng)林科學(xué)研究院 河南開封 475004）

小麥作為我國(guó)主要的糧食作物，它的組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)促進(jìn)小麥生產(chǎn)科學(xué)發(fā)展和產(chǎn)量提高有著重要作用。 尤其是在突變體的篩選和移植方面，愈傷組織和細(xì)胞根再生能力對(duì)能否建立一個(gè)高效、成功的植株培養(yǎng)體系至關(guān)重要。 由于基因型和不適宜環(huán)境條件等的影響，不是所有的品種都容易再生，有關(guān)小麥成熟胚組織培養(yǎng)的報(bào)道很多，不同的小麥品種在愈傷組織形成、體細(xì)胞形成和根再生效率方面有明顯的不同。 如何克服基因型的限制，擴(kuò)大材料范圍，建立良好的培養(yǎng)體系是開展小麥組織培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)[1]。 愈傷組織干燥處理曾用于大豆[2]、水稻[3]，以促進(jìn)其體細(xì)胞胚的發(fā)育，之后這一方法又用于秈稻，使其再生頻率有了很大的提高[4]，但在小麥成熟胚中相關(guān)應(yīng)用研究較少。 為了建立小麥穩(wěn)定高效的再生體系，筆者針對(duì)小麥成熟胚愈傷組織設(shè)計(jì)了不同干燥時(shí)長(zhǎng)處理，對(duì)愈傷組織的干燥率、吸脹率和再生率進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)將開麥18、 開麥20、 開麥22 和開麥1502等4 個(gè)小麥品種的成熟胚愈傷組織經(jīng)過15 周繼代培養(yǎng)后，進(jìn)行植株再生。

1.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2 mg/L 2,4-D+500 mg/L 脯氨酸+500 mg/L 水解酪蛋白+30 g/L 蔗糖。

分化培養(yǎng)基：MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L KT+500 mg/L 脯氨酸+500 mg/L 水解酪蛋白+30 g/L 蔗糖。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 接種 2022 年6 月15 日開始接種。取收獲后的開麥18、開麥20、開麥22 和開麥1502 等4 個(gè)品種大小一致的種子用75%乙醇浸泡3～5 min 后，用無菌水沖洗3～4 次，0.1%的HgCl2滅菌10～15 min，再用無菌水沖洗3～4 次， 然后放入30℃左右的無菌水中浸泡3～5 h。 浸泡后用滅菌過的解剖刀從籽粒中上部剝出胚，盾片向上置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿接種20 個(gè)胚。

1.3.2 繼代培養(yǎng) 接種后， 愈傷組織每3 周繼代一次，連續(xù)繼代15 周。 繼代培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分相同。 將繼代的愈傷組織放在26℃的培養(yǎng)箱進(jìn)行暗培養(yǎng)。

1.3.3 干燥率和吸脹率的計(jì)算 繼代培養(yǎng)15 周后，參照Amstrong[5]的標(biāo)準(zhǔn)挑選出Ⅰ型愈傷組織,在無菌條件下轉(zhuǎn)移到鋪有4 層中性濾紙的空培養(yǎng)皿中,在26℃的培養(yǎng)箱中分別干燥6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，并記為D6、D12、D24、D48、D72， 每個(gè)品種設(shè)置3 次重復(fù)。計(jì)算愈傷組織干燥率。

將干燥處理的愈傷組織及未干燥處理的愈傷組織（D0）分別轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為26℃， 光周期為16 h 光照、8 h 黑暗，光照度為3 500 lx[6]。 在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h 后稱量愈傷組織的質(zhì)量，并計(jì)算愈傷組織吸脹率。

1.3.4 植株再生率的計(jì)算 將干燥處理的愈傷組織和未干燥的愈傷組織（D0）轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26℃，光周期為16 h 光照、8 h 黑暗，光照度為3 500 lx。 培養(yǎng)1 周、2 周、3 周、4 周、5 周后,分別記載2 cm 長(zhǎng)健壯根的質(zhì)量、數(shù)量,計(jì)算植株再生率。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析與圖表繪制 數(shù)據(jù)分析和圖表繪制利用Excel 2010 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥時(shí)長(zhǎng)對(duì)小麥成熟胚愈傷組織干燥率的影響

由圖1、表1、表2、表3 可以看出，隨著干燥時(shí)間的延長(zhǎng)，4 個(gè)品種的干燥率呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)，其中從D0～D6干燥率呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)， 均增長(zhǎng)了13.57%，D6～D12干燥率的增長(zhǎng)相對(duì)比較緩慢，只增加了0.71%，當(dāng)干燥時(shí)間超過12 h 以后，干燥率的增長(zhǎng)又呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)， 并且隨著干燥時(shí)間的延長(zhǎng)增長(zhǎng)加快，其平均干燥率為20.7%，干燥時(shí)長(zhǎng)和品種間的互作達(dá)極顯著水平；4 個(gè)品種間的干燥程度也有明顯的不同，以開麥1502 干燥率最高，其平均干燥率為22.32%，品種間干燥率差異達(dá)顯著水平。

表1 不同品種和干燥時(shí)長(zhǎng)干燥率比較

表2 各干燥處理干燥率方差分析

表3 各干燥處理的吸脹率和干燥率比較

圖1 不同干燥時(shí)長(zhǎng)對(duì)愈傷組織干燥率的影響

2.2 不同干燥時(shí)長(zhǎng)對(duì)小麥成熟胚愈傷組織吸脹率的影響

由圖2、表3、表4 可知，品種和干燥處理時(shí)間的互作達(dá)極顯著水平，品種間吸脹率的差異不顯著。 干燥時(shí)間越長(zhǎng)，在繼代培養(yǎng)基中的吸脹率就越高。 干燥6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 處理， 吸脹率分別是未干燥處理的1.10 倍、1.25 倍、1.48 倍、1.60 倍、2.44 倍，與未干燥處理（D0）相比，其吸脹率增加比較顯著。 4 個(gè)品種在繼代培養(yǎng)基中吸脹率均隨著干燥時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，以開麥1502 愈傷組織吸脹率最高。 愈傷組織未加干燥的處理即D0～D6的吸脹率表現(xiàn)出顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)； 干燥時(shí)間為6～12 h 的各處理吸脹率增加較緩慢；而干燥時(shí)間為48～72 h 的各處理品種吸脹率又呈迅速增長(zhǎng)趨勢(shì)。

表4 各干燥處理吸脹率方差分析

圖2 不同干燥時(shí)長(zhǎng)對(duì)愈傷組織吸脹率的影響

2.3 不同干燥時(shí)長(zhǎng)對(duì)小麥成熟胚愈傷組織再生率的影響

對(duì)4 個(gè)品種小麥成熟胚愈傷組織進(jìn)行不同程度的吸濕干燥處理， 并對(duì)前5 周的再生頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表5）。 結(jié)果表明，愈傷組織再生率隨著干燥時(shí)間的增加而提高， 但是干燥處理72 h 時(shí)再生率下降，而4 個(gè)品種最高的再生率均是在干燥48 h 時(shí)， 以開麥1502 再生率最高，達(dá)21.63%。

表5 干燥處理對(duì)再生頻率的影響（單位：%）

對(duì)于同一品種的干燥處理， 從第1 周到第4 周再生率逐漸增加， 在第4 周再生率達(dá)到最高， 在第5 周再生率下降。 對(duì)于不同時(shí)長(zhǎng)的干燥處理，培養(yǎng)周數(shù)相同時(shí)，除72 h 以外，各品種都隨著干燥時(shí)長(zhǎng)的增加再生率逐漸增加，在干燥處理48 h 時(shí)再生率最高，而在第5 周時(shí)隨著干燥時(shí)間的增加再生率下降。 由此可見，干燥處理48 h 時(shí)再生率最高。

3 討論與結(jié)論

本文作者將4 個(gè)小麥品種的成熟胚愈傷組織在吸濕干燥處理后進(jìn)行植株再生和直接進(jìn)行植株再生，試驗(yàn)表明，在分化前對(duì)小麥愈傷組織進(jìn)行吸濕干燥處理，可以普遍提高愈傷組織的再生率，加快再生進(jìn)程，這與田文忠[7]在水稻上的試驗(yàn)結(jié)果一致。 這是因?yàn)樘幚斫档土擞鷤M織的2,4-D 質(zhì)量濃度和含水量，造成愈傷組織饑餓，愈傷組織一旦轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基就能更快地吸收養(yǎng)分和6-BA、KT，促進(jìn)生芽。 這一方法對(duì)提高植株再生率， 克服一些植物離體培養(yǎng)再生植株困難有實(shí)用價(jià)值， 并對(duì)離體篩選有益突變體和轉(zhuǎn)基因研究具有特別意義。

加快愈傷組織植株再生速度，縮短植株分化時(shí)間，對(duì)獲取健壯的試管幼苗極其重要。 本試驗(yàn)表明， 愈傷組織經(jīng)過吸濕干燥處理可以普遍增加分化前期再生植株的比例，加快再生進(jìn)程。 吸濕干燥處理優(yōu)于直接分化處理， 這與吸濕干燥處理能更好地降低愈傷組織2,4-D 含量有關(guān)， 而且處理造成的滲透壓變化，加快了激素6-BA、KT 滲入愈傷組織細(xì)胞，促進(jìn)了芽分化。 不同品種的愈傷組織吸濕干燥處理后在苗分化率和分化速度上存在一定差異， 這可能與不同品種愈傷組織的狀態(tài)和含水量不同有關(guān)。