基于AMPK/SREBP-1c通路探討降糖三黃片防治2 型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的作用機(jī)制

黃尹瀅， 迪娜·塔吾列， 盧偉熾 （指導(dǎo)：朱章志）

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）與2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）密切相關(guān)，兩者患病率呈同步上升趨勢。臨床和流行病學(xué)調(diào)查研究表明，28% ～70%的T2DM 患者患有NAFLD[1]，與此同時(shí)發(fā)現(xiàn)大約有45%的NAFLD 患者罹患糖尿病[2]。胰島素抵抗不僅是T2DM 發(fā)病的病理基礎(chǔ)及關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]，還是“多重打擊理論”中參與NAFLD 形成的重要一環(huán)。脂肪組織對(duì)胰島素的抗脂解作用產(chǎn)生抵抗，導(dǎo)致外周脂解、游離脂肪酸向肝臟的輸送增加，并推動(dòng)脂肪再生[4-5]，引起肝臟脂肪的積累，最終導(dǎo)致NAFLD 的形成。臨床上暫無針對(duì)T2DM 合并NAFLD 的特效藥，因此，基于分子機(jī)制研究治療T2DM 合并NAFLD 的方法，對(duì)臨床上探尋其治療的更多可能性具有重要意義。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是在真核細(xì)胞生物中廣泛表達(dá)的異源三聚體蛋白，對(duì)糖代謝具有廣泛的影響。甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP-1c）是由2 個(gè)基因編碼的SREBP 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，在肝臟中能夠激活糖酵解基因和參與脂肪生成的基因。作為AMPK的下游，SREBP-1c可以被AMPK 直接磷酸化，從而抑制其分裂和核易位[6]，進(jìn)而減少肝細(xì)胞中脂質(zhì)的積累。本課題組所研究的降糖三黃片，經(jīng)多批次基礎(chǔ)研究證實(shí)其具有減輕糖尿病鼠胰島素抵抗、降糖調(diào)脂、抗氧化應(yīng)激、改善肝功能等多種功效[7-9]。本研究通過觀察降糖三黃片對(duì)AMPK/SREBP-1c 通路的影響，在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入探討該藥改善T2DM合并NAFLD的作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF 級(jí)雄性SD 大鼠30 只，6 ～8 周齡，體質(zhì)量180～210g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0008。實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審定（批準(zhǔn)編號(hào)：20221119001）。飼養(yǎng)條件：標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境[溫度（21±2）℃、濕度（45±10）%]，12 h/12 h光照黑暗循環(huán)，自由攝食飲水，每天換水、墊料。

1.2 藥物降糖三黃片，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，粵藥制字：Z20071185，批號(hào)：20220301，規(guī)格：0.25 g/片，成人用量：8 ～10 片/次，一日3次；鹽酸二甲雙胍片（商品名：格華止），中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20023370，規(guī)格：0.5 g/片，成人用量：1片/次，一日3次。

1.3 試劑與儀器鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；蘇木精-伊紅染液、油紅O 染液（中山市奧博生物科技有限公司）；大鼠空腹胰島素（FINS）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、甘油三酯（TG）定量檢測試劑盒、總膽固醇（TC）定量試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性檢測試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性檢測試劑盒、血漿游離脂肪酸（FFA）定量檢測試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）/低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）定量試劑盒（美國Sigma 公司）；大鼠白細(xì)胞介素（IL）-6 、腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA 檢測試劑盒（美國ThermoFisher 公司）；大鼠IL-1β ELISA 檢測試劑盒（深圳子科生物科技有限公司）；AMPK 兔多抗、磷酸化AMPK（p-AMPK）兔單抗、SREBP-1c 兔多抗、β-actin 兔單抗（英國Abcam 公司）；辣根過氧化物酶（HRP）-山羊抗兔IgG 二抗（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；低背景化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（日本TaKaRa 公司）。酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Nikon 公司）；WB 成像儀（美國ThermoFisher 公司）；電轉(zhuǎn)儀、垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 T2DM合并NAFLD大鼠模型的建立及分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)抽樣的方法選出6只作為空白對(duì)照組，用普通飼料喂養(yǎng)；余下大鼠作為造模組改用高糖高脂飼料喂養(yǎng)8 周。禁食不禁水12 h，高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠按30 mg/kg劑量給予一次性腹腔注射STZ，空白對(duì)照組大鼠給予腹腔注射相同體積的檸檬酸緩沖液。注射STZ 72 h后從大鼠尾靜脈采集血液，測定隨機(jī)血糖水平，血糖＞16.7 mmol/L 者，提示造模成功[10-11]。將T2DM合并NAFLD 模型構(gòu)建成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、降糖三黃片低劑量組、降糖三黃片高劑量組，每組6只。

1.5 給藥方法從實(shí)驗(yàn)第9 周開始，對(duì)各組大鼠進(jìn)行灌胃。降糖三黃片低劑量組按成人臨床等效劑量換算為大鼠量0.675 g·kg-1·d-1給藥，降糖三黃片高劑量組按成人臨床等效劑量4 倍換算為大鼠量2.7 g·kg-1·d-1給藥，二甲雙胍組按成人臨床等效劑量換算為大鼠量0.2 g·kg-1·d-1給藥[8]，空白對(duì)照組及模型組給予等體積生理鹽水灌胃。每日1 次，持續(xù)4周。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 大鼠一般情況觀察 每周觀察各組大鼠的精神、體質(zhì)量、營養(yǎng)、活動(dòng)、飲食等情況。每周測定一次大鼠的空腹血糖。

1.6.2 取材 藥物干預(yù)4 周（實(shí)驗(yàn)第12 周）后取材，取材前禁食12 h。麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，離心得上清液，冷凍保存于-80 ℃冰箱。采血完成后，留取肝臟組織，經(jīng)生理鹽水反復(fù)沖洗后一部分行蘇木素-伊紅染色、油紅O 染色，一部分留作Western Blot檢測。

1.6.3 生化指標(biāo)與炎癥因子檢測 檢測血清FINS、TG、TC、LDL-C、HDL-C，AST、ALT、FFA，血清炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β 水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。

1.6.4 肝組織形態(tài)學(xué)觀察 取肝組織塊修剪，脫水，透明，石蠟包埋，切片（厚5 μm），展片，烤片。再進(jìn)行脫蠟和水化。油紅O染色：油紅O乙醇染液染色8 min，50%乙醇分化，自來水終止分化。蘇木素-伊紅染色：蘇木素染液染細(xì)胞核10 min，蒸餾水漂洗至不掉色，1%鹽酸酒精分色液分色，自來水藍(lán)化20 min，蒸餾水漂洗1 min；伊紅染液中染色5 min，顯微鏡下觀察染色情況。甘油明膠封片。光鏡下觀察肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞形態(tài)等病理學(xué)變化。

1.6.5 Western Blot法檢測肝組織AMPK、p-AMPK、SREBP-1c 蛋白表達(dá) 裂解提取肝組織蛋白，用BCA 蛋白定量后，加熱變性。按照蛋白定量的結(jié)果計(jì)算每個(gè)樣品的上樣體積，以保證上樣量一致。將樣品、PageRuler 預(yù)染蛋白Marker 依次加入不同的泳道，85 V 恒壓電泳約30 min，轉(zhuǎn)至125 V恒壓電泳約1.5 h。按轉(zhuǎn)印用濾紙、PVDF 膜、凝膠、濾紙的順序從陽極到陰極擺放正確，按照0.8mA/cm2通電轉(zhuǎn)印1 h。用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，TBST 漂洗。加入稀釋一抗包括AMPK 兔多抗（1∶2 000）、p-AMPK 兔單抗（1∶1 000）、SREBP-1c兔多抗（1∶2 000）、β-actin 兔單抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，TBST 漂洗。加入HRP-山羊抗兔IgG（1∶2 000），30 ℃孵育1 h，TBST 漂洗。按照化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒步驟將PVDF膜置于暗處顯色30 s，用TBST終止反應(yīng)，用WB成像儀掃描結(jié)果并記錄。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，連續(xù)型變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)分布變量如HOMA-IR 取自然對(duì)數(shù)正態(tài)化后分析，血糖等重復(fù)觀察指標(biāo)的比較采用重復(fù)測量資料的方差分析，單次觀察指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，多組間數(shù)據(jù)比較用方差檢驗(yàn)。繪圖軟件使用Graphpad 軟件。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較實(shí)驗(yàn)第12 周可見：正常組大鼠精神狀況良好，性格活躍兇猛，毛發(fā)柔順光亮，脂肪少，墊料干燥；模型組大鼠精神差，反應(yīng)緩慢，性格溫和，體型肥胖，皮下脂肪厚，毛發(fā)粗糙干枯，墊料潮濕，伴有多飲多食多尿等現(xiàn)象。與模型組比較，二甲雙胍組、降糖三黃片低劑量組、降糖三黃片高劑量組大鼠均有相似表現(xiàn)，但多飲多食多尿程度降低，毛發(fā)較模型組光滑。

2.2 各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較

2.2.1 空腹血糖 表1 結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)干預(yù)前，造模組大鼠在8 周高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合STZ 一次性腹腔注射72 h 后測得空腹血糖均＞16.7 mmol/L，且明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），判斷T2DM 大鼠造模成功。實(shí)驗(yàn)干預(yù)3 周后，與模型組比較，二甲雙胍組及降糖三黃片低、高劑量組的空腹血糖明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），且二甲雙胍組的空腹血糖下降幅度更明顯；實(shí)驗(yàn)干預(yù)4周后，二甲雙胍組和降糖三黃片高劑量組的空腹血糖進(jìn)一步下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而降糖三黃片高劑量組在調(diào)節(jié)空腹血糖方面，治療效果與二甲雙胍相當(dāng)。

表1 各組大鼠空腹血糖比較Table 1 Comparison of fasting blood glucose among each group of rats（±s，mmol·L-1）

表1 各組大鼠空腹血糖比較Table 1 Comparison of fasting blood glucose among each group of rats（±s，mmol·L-1）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，與空白對(duì)照組比較；④P＜0.05，⑤P＜0.01，⑥P＜0.001，與模型組比較；⑦P＜0.05，與二甲雙胍組比較

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2.2.2 糖耐量試驗(yàn)結(jié)果 圖1、圖2結(jié)果顯示：糖耐量試驗(yàn)開始30 min 過后，各實(shí)驗(yàn)組的血糖水平均顯著高于空白對(duì)照組。與空白對(duì)照組比較，其余實(shí)驗(yàn)組的AUC 均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組及降糖三黃片低、高劑量組的AUC 均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與二甲雙胍組比較，降糖三黃片高劑量組的AUC 值稍升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明降糖三黃片能有效控制T2DM 合并NAFLD 大鼠的餐后血糖，改善糖耐量，且高劑量組的效果優(yōu)于低劑量組。

圖1 各組大鼠糖耐量試驗(yàn)（OGTT）結(jié)果比較Figure 1 Comparison of oral glucose tolerance test results among each group of rats

圖2 各組大鼠口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）曲線下面積（AUC）比較（±s）Figure 2 Comparison of area under curve（AUC）of oral glucose tolerance test among each group of rats（±s）

2.2.3 血清空腹胰島素（FINS）與胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR） 表2 結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，其余實(shí)驗(yàn)組的血清FINS 均有所升高；與模型組比較，二甲雙胍組及降糖三黃片低、高劑量組的血清FINS 均有所下降，其中二甲雙胍組和降糖三黃片高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。對(duì)于HOMA-IR，與模型組比較，二甲雙胍組及降糖三黃片低、高劑量組均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；且相較于降糖三黃片低劑量組，降糖三黃片高劑量組的HOMA-IR 下降幅度更大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。二甲雙胍組在改善HOMA-IR 方面更明顯，但與降糖三黃片高劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明降糖三黃片可以明顯改善T2DM 合并NAFLD 大鼠胰島素抵抗，減輕由于胰島素抵抗導(dǎo)致的血清FINS升高。

表2 各組大鼠空腹胰島素（FINS）及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）比較Table 2 Comparison of fasting insulin and insulin resistance indix among each group of rats（±s）

表2 各組大鼠空腹胰島素（FINS）及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）比較Table 2 Comparison of fasting insulin and insulin resistance indix among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，與空白對(duì)照組比較；④P＜0.05，⑤P＜0.01，⑥P＜0.001，與模型組比較；⑦P＜0.05，⑧P＜0.01，與二甲雙胍組比較；⑨P＜0.01，與降糖三黃片低劑量組比較

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2.2.4 血脂代謝及游離脂肪酸（FFA） 表3 結(jié)果顯示，與模型組比較，其余實(shí)驗(yàn)組的TC、TG、LDL-C、FFA 含量均明顯下降，HDL-C 有所升高，其中：二甲雙胍組的TC、TG、LDL-C、HDL-C 含量與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.001）；降糖三黃片高劑量組的TG、LDL-C、HDL-C 與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.001）。在TG、LDL-C 的改善方面，降糖三黃片高劑量組下降幅度更大，但與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示：二甲雙胍和降糖三黃片均可改善T2DM 合并NAFLD大鼠的血脂代謝，降低體內(nèi)的FFA，兩者對(duì)不同的指標(biāo)各有優(yōu)點(diǎn)，但差異不大；隨著降糖三黃片劑量的提高，降脂效果更好。

表3 各組大鼠血脂、游離脂肪酸（FFA）水平比較Table 3 Comparison of serum lipids and free fatty acids among each group of rats（±s，mmol·L-1）

表3 各組大鼠血脂、游離脂肪酸（FFA）水平比較Table 3 Comparison of serum lipids and free fatty acids among each group of rats（±s，mmol·L-1）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，與空白對(duì)照組比較；④P＜0.01，⑤P＜0.001，與模型組比較；⑥P＜0.05，⑦P＜0.001，與二甲雙胍組比較；⑧P＜0.05，⑨P＜0.01，⑩P＜0.001，與降糖三黃片低劑量組比較

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2.2.5 肝功能指標(biāo) 表4 結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，其余實(shí)驗(yàn)組的ALT、AST水平均有明顯升高；與模型組比較，二甲雙胍組及降糖三黃片低、高劑量組的ALT、AST水平均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），二甲雙胍組的下降幅度更大；但與二甲雙胍組比較，降糖三黃片高劑量組ALT、AST水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？梢?，T2DM 合并NAFLD大鼠與正常大鼠相比，肝功能會(huì)受到明顯影響，但二甲雙胍和降糖三黃片均可在一定程度上改善T2DM 合并NAFLD 大鼠肝功能，減輕肝細(xì)胞的損害，且高劑量降糖三黃片在改善肝代謝方面與二甲雙胍效果相當(dāng)。

表4 各組大鼠肝功能比較Table 4 Comparison of liver function among each group of rats（±s，U·L-1）

表4 各組大鼠肝功能比較Table 4 Comparison of liver function among each group of rats（±s，U·L-1）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，與空白對(duì)照組比較；④P＜0.05，⑤P＜0.01，⑥P＜0.001，與模型組比較；⑦P＜0.05，與二甲雙胍組比較

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2.2.6 炎癥因子指標(biāo) 表5 結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，其余實(shí)驗(yàn)組的IL-6、TNF-α、IL-1β水平均有所升高；與模型組比較，二甲雙胍組及降糖三黃片低、高劑量組的IL-6、TNF-α、IL-1β水平均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），其中二甲雙胍組的下降幅度更大；但與二甲雙胍組比較，降糖三黃片高劑量組IL-6、TNF-α、IL-1β 的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？梢?，T2DM 合并NAFLD 大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)明顯，IL-6、TNF-α、IL-1β 均處于較高水平，使用二甲雙胍和降糖三黃片后均可減輕大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

表5 各組大鼠炎癥因子水平比較Table 5 Comparison of inflammatory factors among each group of rats（±s，pg·mL-1）

表5 各組大鼠炎癥因子水平比較Table 5 Comparison of inflammatory factors among each group of rats（±s，pg·mL-1）

注：①P＜0.05，②P＜0.001，與空白對(duì)照組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，⑤P＜0.001，與模型組比較；⑥P＜0.01，與二甲雙胍組比較

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2.3 各組大鼠肝組織通路蛋白指標(biāo)比較圖3、表6 結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型組的AMPK、SREBP-1c表達(dá)水平均有所升高，p-AMPK表達(dá)水平有所下降（P＜0.01 或P＜0.001）。與模型組比較，二甲雙胍組及降糖三黃片低、高劑量組的p-AMPK 表達(dá)水平均顯著上升（P＜0.001），SREBP-1c 表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.001）；與二甲雙胍組比較，降糖三黃片高劑量組的SREBP-1c表達(dá)水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？梢姡琓2DM合并NAFLD大鼠體內(nèi)AMPK蛋白表達(dá)水平明顯升高，磷酸化水平明顯減弱，促進(jìn)了SREBP-1c 的表達(dá)，導(dǎo)致脂質(zhì)合成，而降糖三黃片及二甲雙胍可以改善此情況。

圖3 各組大鼠AMPK、p-AMPK、SREBP-1c蛋白電泳條帶（Western Blot法）Figure 3 Protein electrophoretic bands of AMPK，p-AMPK，SREBP-1c（Western Blot）

表6 各組大鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SREBP-1c蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 6 Comparison of the relative protein expressions of AMPK，p-AMPK and SREBP-1c in liver tissue among each group of rats（±s）

表6 各組大鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SREBP-1c蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 6 Comparison of the relative protein expressions of AMPK，p-AMPK and SREBP-1c in liver tissue among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，與空白對(duì)照組比較；④P＜0.05，⑤P＜0.001，與模型組比較；⑥P＜0.05，與二甲雙胍組比較；⑦P＜0.01，⑧P＜0.001，與降糖三黃片低劑量組比較

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2.4 各組大鼠病理學(xué)分析結(jié)果比較

2.4.1 HE 染色 圖4結(jié)果顯示：空白對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞未見腫脹，形態(tài)大小均勻一致；模型組大鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)明顯紊亂，可見肝細(xì)胞索模糊，肝竇消失，肝細(xì)胞高度氣球樣變，肝細(xì)胞內(nèi)可見大量大泡性脂滴空泡，為重度脂肪肝改變。經(jīng)過用藥治療，二甲雙胍組及降糖三黃片低、高劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞腫脹程度和脂肪變性都較模型組明顯好轉(zhuǎn)，其中二甲雙胍組的肝細(xì)胞變性程度最輕。

圖4 各組大鼠肝臟HE染色結(jié)果比較Figure 4 Comparison of liver HE staining results among each group of rats

2.4.2 油紅O 染色 圖5 結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠大量肝臟細(xì)胞漿內(nèi)可見脂滴存在，細(xì)胞間也可見明顯脂質(zhì)染色；二甲雙胍組及降糖三黃片低、高劑量組的胞漿內(nèi)脂滴分布較模型組減少，細(xì)胞間脂質(zhì)染色也明顯減輕；二甲雙胍組細(xì)胞間脂質(zhì)沉積改善最明顯，但胞漿可見散在小脂滴存在，降糖三黃片低、高劑量組胞漿內(nèi)脂滴分布較二甲雙胍組更少，但細(xì)胞間脂質(zhì)蓄積的改善效果不如二甲雙胍組。

圖5 各組肝臟油紅O染色結(jié)果比較Figure 5 Comparison of liver oil red O staining results among each group of rats

3 討論

2 型糖尿?。═2DM）合并非酒精性脂肪肝（NAFLD）已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題，作為代謝性疾病，近幾年其患者數(shù)呈現(xiàn)出明顯的增長趨勢，不少針對(duì)其發(fā)病的病理生理機(jī)制研究已獲得較大的進(jìn)展。但是，臨床上對(duì)NAFLD 的治療仍然是以改變生活方式和調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)為主，在快節(jié)奏的社會(huì)生活中有一部分人很難長期堅(jiān)持這種方法，通過藥物進(jìn)行輔助治療正成為越來越多人的選擇，因此，研究出更多能有效地治療T2DM 合并NAFLD 的藥物已成為當(dāng)前一項(xiàng)擁有廣大前景的工作。本研究對(duì)比觀察了降糖三黃片與二甲雙胍對(duì)T2DM 合并NAFLD 的SD 大鼠中血糖、胰島素抵抗、脂代謝、炎癥指標(biāo)、肝臟病理的影響。本研究以高脂高熱量飼料誘導(dǎo)加STZ 注射所復(fù)制的T2DM 合并NAFLD 大鼠模型，具有明顯的胰島素抵抗和糖脂紊亂表現(xiàn)，病理檢查顯示與正常組比較有顯著性差異，提示成功構(gòu)建了符合T2DM 合并NAFLD的大鼠模型。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）由α、β 和γ 三個(gè)亞基所組成，其中α亞基決定了蛋白激酶復(fù)合物的活性，AMPK 通過α 亞基影響蛋白質(zhì)和基因水平[12]的代謝途徑。β 和γ 亞基是調(diào)控亞基，它們也參與了蛋白激酶復(fù)合物活性的調(diào)節(jié)[13]。每個(gè)亞單位在生物體中都有多種亞型，這些亞型的結(jié)合產(chǎn)生了12 種不同的AMPK 全酶變體，多樣的異構(gòu)體組成表明AMPK 具有多種細(xì)胞功能、組織特異性和亞細(xì)胞定位。AMPK的一個(gè)主要功能是監(jiān)測ATP水平的變化，并將其與下游底物的磷酸化相結(jié)合，從而導(dǎo)致ATP 產(chǎn)生途徑的速率增加或ATP 利用途徑的速率降低。能量平衡失調(diào)被認(rèn)為是導(dǎo)致一系列人類疾病變化的重要因素，如T2DM、肥胖和癌癥。AMPK 在維持能量平衡方面的核心作用使其成為預(yù)防和治療代謝性疾?。òò┌Y）的藥物的一個(gè)有吸引力的靶點(diǎn)[14-16]。

AMPK 對(duì)糖代謝具有廣泛的影響，在促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、加強(qiáng)糖酵解以及抑制糖異生等生化反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用。研究[17]發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠表現(xiàn)出脂質(zhì)積累和胰島素抵抗，而通過利古司汀增強(qiáng)AMPK 磷酸化，可介導(dǎo)糖尿病大鼠胰島素敏感性。因此，AMPK 信號(hào)激活可被認(rèn)為是糖尿病治療中的一種保護(hù)機(jī)制[18]。NAFLD 是無法氧化或清除的沉積在肝臟中的脂質(zhì)過量生產(chǎn)的累積結(jié)果，通過多種機(jī)制激活，AMPK 可抵消這些影響。有研究[19]表明，紅景天苷通過誘導(dǎo)AMPK 信號(hào)通路顯著降低TXNIP 及其下游NLRP3 炎癥小體的表達(dá)水平，對(duì)高脂誘導(dǎo)的NAFLD 起保護(hù)作用，亦可減少肥胖，改變血糖水平和脂質(zhì)積累，增強(qiáng)胰島素敏感性，有利于減輕糖尿病的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。AMPK誘導(dǎo)的自噬在NAFLD 治療機(jī)制中也很有研究意義，研究[20]發(fā)現(xiàn)，犬尿喹啉酸能夠通過上調(diào)AMPK刺激自噬減輕NAFLD。

甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP-1c）在肝臟、脂肪組織、腎上腺和大腦中呈高表達(dá)。在肝臟中，SREBP-1c 激活糖酵解基因、葡萄糖激酶（GK）和參與脂肪酸合成（脂肪生成）的基因，調(diào)節(jié)參與大量肝細(xì)胞過程的基因，如細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥、細(xì)胞內(nèi)膜靶向、細(xì)胞呼吸或RNA 處理[21-23]。SREBP-1c 參與肝臟甘油三酯合成[24]。研究[6]表明，AMPK 是SREBP-1c 的上游，可以通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c，阻止其蛋白水解加工，抑制其轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，下調(diào)脂肪生成基因的轉(zhuǎn)錄，包括編碼ACC 和脂肪酸合酶的基因。Kohjima 等[25]發(fā)現(xiàn)，在T2DM 的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，胰島素仍然可以激活SREBP-1c，SREBP-1c的過度表達(dá)，可以直接通過抑制胰島素受體底物2基因轉(zhuǎn)錄加重胰島素抵抗。Chu 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，通過小干擾RNA 下調(diào)SREBP-1c 的表達(dá)，可以減少肝臟中硬脂酸合成和血清硬脂酸水平，進(jìn)而改善糖尿病小鼠的胰島素抵抗。

本研究團(tuán)隊(duì)已對(duì)降糖三黃片在糖脂代謝紊亂方面的作用進(jìn)行了大量前期研究，發(fā)現(xiàn)降糖三黃片在臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均能有效降低血脂水平[8，27-30]。本研究結(jié)果顯示，T2DM 合并NAFLD 大鼠存在明顯的多飲多食多尿等現(xiàn)象，血糖升高，胰島素抵抗明顯，血脂水平明顯升高，肝酶升高，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，病理上可見肝細(xì)胞有明顯的脂質(zhì)蓄積及細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常。通過與西藥二甲雙胍作對(duì)照，結(jié)果表明，降糖三黃片可以有效降低T2DM 合并NAFLD 大鼠的血糖、血脂水平，減輕胰島素抵抗，還能減輕炎癥反應(yīng)，減輕對(duì)肝功能的損害，減少肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變性及脂質(zhì)蓄積。而高劑量的降糖三黃片對(duì)T2DM 合并NAFLD 的SD 大鼠的糖脂代謝、胰島素抵抗、肝功能、炎癥因子、肝臟病理等方面的改善作用均較低劑量明顯，且與西藥二甲雙胍相仿。通過Western Blot 法檢測肝臟AMPK、p-AMPK、SREBP-1c 蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)降糖三黃片降低了T2DM 合并NAFLD 大鼠AMPK 蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)了AMPK 的磷酸化，減少了SREBP-1c 的過表達(dá)，且高劑量作用效果明顯優(yōu)于低劑量，但未顯示出明顯的量效關(guān)系，高劑量療效與西藥二甲雙胍無顯著性差別。由此我們推測，降糖三黃片通過AMPK-SREBP-1c途徑減少了過度營養(yǎng)誘導(dǎo)的肝臟TG 蓄積。降糖三黃片促進(jìn)AMPK 的磷酸化，AMPK 磷酸化的增加促進(jìn)了SREBP-1c 的磷酸化，從而抑制了SREBP-1c的切割和核轉(zhuǎn)位，從而導(dǎo)致脂肪生成和脂質(zhì)積聚減少，進(jìn)而提高胰島素敏感性，改善肝臟代謝，對(duì)T2DM 合并NAFLD起到防治作用。

對(duì)于T2DM 合并NAFLD 這一疾病，古代醫(yī)家存在從肝論治消渴的理論，如《難經(jīng)·五十六難》中認(rèn)為肥氣者多嗜肥甘厚膩，可轉(zhuǎn)為消渴，亦可見右脅肋部不適等肝積之癥?，F(xiàn)代醫(yī)家對(duì)于T2DM合并NAFLD 患者的病因病機(jī)有不少的研究，如范譯丹等[31]認(rèn)為該病會(huì)導(dǎo)致氣機(jī)運(yùn)行不暢，郁熱、津傷進(jìn)一步加重，進(jìn)而相互影響形成惡性循環(huán)。史麗偉等[32]則認(rèn)為當(dāng)機(jī)體內(nèi)存在肝郁脾虛，濕熱內(nèi)阻或痰瘀互結(jié)時(shí)，往往就會(huì)促成T2DM 合并NAFLD的發(fā)生?？梢婐?、熱之邪是T2DM 合并NAFLD 病程中的重要病理因素。降糖三黃片是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的純中藥院內(nèi)制劑，由桃核承氣湯化裁而來，該藥由桃仁、大黃、芒硝、桂枝等中藥組成，方中：桃仁苦甘平，活血破瘀，大黃苦寒，下瘀瀉熱，二者合用，瘀熱并治；芒硝咸苦寒，瀉熱軟堅(jiān)，助大黃下瘀瀉熱；桂枝辛甘溫，通行血脈，既助桃仁活血祛瘀，又防硝、黃寒涼凝血之弊[9]。應(yīng)用降糖三黃片治療T2DM 合并NAFLD，切合其病機(jī)。

綜上所述，降糖三黃片可有效治療T2DM 合并NAFLD大鼠，其作用機(jī)制可能與通過調(diào)節(jié)AMPKSREBP-1c 途徑減少肝臟脂質(zhì)蓄積，進(jìn)而提高胰島素敏感性，改善肝臟代謝有關(guān)。