獸用疫苗生產(chǎn)中支原體污染檢測(cè)及預(yù)防

文│康一嵐 徐慧琳 楊代蓉 魏嘉 劉玉靜 申茂欣 趙同淵 夏娜*（青島易邦生物工程有限公司）

在獸用疫苗生產(chǎn)的過(guò)程中，特別是對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，極易被支原體污染，嚴(yán)重地影響了疫苗的質(zhì)量及安全，對(duì)于普通疫苗和細(xì)胞生產(chǎn)活毒疫苗的污染，會(huì)給疫苗生產(chǎn)商或使用不合格疫苗的養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也不利于畜禽疾病防控工作的順利開(kāi)展。其中支原體是疫苗生產(chǎn)過(guò)程中比較常見(jiàn)的微生物，而造成支原體污染的原因也較多，工作環(huán)境、培養(yǎng)基、被污染的細(xì)胞、試驗(yàn)器材等都可能造成支原體的污染，從而使疫苗質(zhì)量下降，安全性及免疫效果難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立快速有效的支原體檢測(cè)方法，可以有效地檢測(cè)出支原體污染，避免給后續(xù)過(guò)程帶來(lái)更嚴(yán)重的損失，如今檢測(cè)支原體污染的方法很多，培養(yǎng)法、DNA熒光染色法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（EILSA）方法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法，都被廣泛運(yùn)用于檢測(cè)支原體污染或進(jìn)行初步篩選，保證后續(xù)疫苗的生產(chǎn)過(guò)程。同時(shí)要結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，針對(duì)獸用疫苗支原體污染的主要來(lái)源制定出科學(xué)有效的預(yù)防措施，確保獸用疫苗無(wú)支原體污染，從源頭杜絕支原體污染給獸用疫苗生產(chǎn)帶來(lái)的嚴(yán)重影響，保證獸用疫苗的質(zhì)量、安全及效果。

一、支原體的特點(diǎn)

支原體屬于原核微生物，是能夠進(jìn)行自我復(fù)制的最小原核生物，沒(méi)有細(xì)胞壁，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，大小在細(xì)菌和病毒之間，可以通過(guò)細(xì)菌過(guò)濾器。對(duì)熱十分敏感，在偏堿環(huán)境中生存且對(duì)酸性環(huán)境抵抗力差，一般抗生素不敏感。若動(dòng)物感染后，其毒株通過(guò)特殊結(jié)構(gòu)黏附在細(xì)胞膜上，引起結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)異常，會(huì)引起疾病的發(fā)生。

二、支原體污染來(lái)源

1.生產(chǎn)用原材料污染源。在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中所用原材料污染源要十分注意，盡可能減少疫苗污染支原體的風(fēng)險(xiǎn)，在獸用疫苗生產(chǎn)中，若是用到動(dòng)物或雞胚時(shí)，不能因節(jié)省成本隨意購(gòu)買(mǎi)動(dòng)物或雞胚，這樣難以保證疫苗的質(zhì)量及安全，其次在使用動(dòng)物的臟器或組織制備原代細(xì)胞或是組織時(shí)，也要對(duì)來(lái)源進(jìn)行規(guī)范及嚴(yán)格要求，否則支原體污染則難以控制。

2 .細(xì)胞和種毒支原體污染。細(xì)胞及種毒在獸用疫苗生產(chǎn)中十分關(guān)鍵，是疫苗質(zhì)量及效果的決定因素。其中細(xì)胞的支原體污染非常嚴(yán)重，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中被支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)50%～60%，也是細(xì)胞培養(yǎng)中的一大難題，常見(jiàn)的污染細(xì)胞的支原體主要有口腔支原體、唾液支原體、萊氏無(wú)膽甾支原體等人源、豬源和牛源三類(lèi)，而且已有的細(xì)胞系也有30%～50%已被支原體污染，雖然在細(xì)胞培養(yǎng)中難以發(fā)現(xiàn)，但因支原體傳染性高，易發(fā)生交叉污染，若是細(xì)胞株來(lái)源不純或運(yùn)輸保存過(guò)程中被污染極易將支原體引入，而引入支原體污染源后，會(huì)造成細(xì)胞株被感染的現(xiàn)象，對(duì)疫苗的生產(chǎn)產(chǎn)生極大影響；其次若是在種毒過(guò)程中感染了支原體，則會(huì)出現(xiàn)逐級(jí)放大的效果，會(huì)嚴(yán)重影響疫苗的質(zhì)量。

3.培養(yǎng)血清及胰酶支原體污染。使用疫苗的生產(chǎn)中，血清和胰酶作為其中不可缺少的培養(yǎng)細(xì)胞的主要材料，而在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中常用的是動(dòng)物血清，也是細(xì)胞培養(yǎng)中不可或缺的天然培養(yǎng)基，動(dòng)物血清也是潛在支原體污染的來(lái)源，而且極易被支原體污染，被污染后不能用除菌過(guò)濾膜過(guò)濾支原體。而且如今血清的規(guī)范及要求還沒(méi)有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，不同廠(chǎng)家的血清來(lái)源不同，工藝及質(zhì)量也就有差別，特別是血清中的有效成分及支原體狀況存在較大差距，因此培養(yǎng)血清也是支原體污染的重要來(lái)源；其次胰酶也是用于疫苗生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)傳代、消化所需，一般從羊、牛等動(dòng)物胰腺取得，也非常容易污染支原體，而后會(huì)污染細(xì)胞，對(duì)疫苗的質(zhì)量及安全也存在較大支原體污染風(fēng)險(xiǎn)。

4.培養(yǎng)基支原體污染。培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中重要的原材料，培養(yǎng)基的很多成分其來(lái)源都是動(dòng)物性產(chǎn)品，對(duì)此培養(yǎng)基中成分的優(yōu)劣影響著培養(yǎng)基的好壞，進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生影響，而培養(yǎng)基也極易被支原體污染或是在培養(yǎng)過(guò)程中被污染或是在生產(chǎn)過(guò)程中被污染，對(duì)此在購(gòu)買(mǎi)培養(yǎng)基時(shí)就不能因節(jié)約成本購(gòu)買(mǎi)來(lái)源不清、說(shuō)明不清的培養(yǎng)基，要杜絕培養(yǎng)基產(chǎn)品的支原體污染風(fēng)險(xiǎn)，減少疫苗生產(chǎn)過(guò)程中支原體感染的風(fēng)險(xiǎn)。

5.器材及人員支原體污染。在獸用疫苗生產(chǎn)過(guò)程中用到的器材及生產(chǎn)人員支原體污染在疫苗生產(chǎn)中要尤為重視，特別是在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中用到培養(yǎng)器皿及培養(yǎng)箱的會(huì)對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)產(chǎn)生影響，特別是氣體、溫濕度、pH值和生長(zhǎng)密度等都會(huì)給支原體生長(zhǎng)繁殖的空間，進(jìn)而更容易污染細(xì)胞。器材生產(chǎn)人員在培養(yǎng)細(xì)胞或在進(jìn)行疫苗生產(chǎn)的其他步驟中沒(méi)有注意環(huán)境及試驗(yàn)操作，導(dǎo)致細(xì)胞被污染，造成疫苗的質(zhì)量及安全不達(dá)標(biāo)。

6.環(huán)境支原體污染。在疫苗生產(chǎn)的過(guò)程中對(duì)環(huán)境的要求尤為重要，需要在無(wú)菌的環(huán)境中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，而超凈工作臺(tái)就是培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)試驗(yàn)的區(qū)域，對(duì)于沒(méi)有滅菌完全的超凈工作臺(tái)，支原體可以在其表面存活4～6天，在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)操作過(guò)程中進(jìn)行感染。被感染后的細(xì)胞難以通過(guò)傳代或過(guò)濾去除支原體，對(duì)此在環(huán)境中要在試驗(yàn)前后進(jìn)行消毒滅菌，保證環(huán)境的無(wú)菌。

三、支原體檢測(cè)的方法

在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中受到較多因素影響，易導(dǎo)致支原體污染，對(duì)此就要對(duì)其進(jìn)行支原體檢測(cè)，排除被污染的可能，就需要借助相關(guān)的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行支原體檢測(cè)，常用的方法是直接培養(yǎng)法、DNA熒光染色法，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，PCR檢測(cè)法等方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.直接培養(yǎng)法。直接培養(yǎng)法是檢測(cè)支原體的標(biāo)準(zhǔn)方法。是把樣品接種到支原體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，并通過(guò)觀(guān)察液體培養(yǎng)基的顏色變化或是固體培養(yǎng)基上是否生長(zhǎng)支原體菌落進(jìn)行判斷，但培養(yǎng)法所需培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，要3～4周左右的時(shí)間，其次用培養(yǎng)法不能在同一培養(yǎng)基中檢測(cè)出所有的支原體類(lèi)型，該方法常用于對(duì)種毒或疫苗成品的支原體檢測(cè)。

2.DNA熒光染色法。DNA熒光染色法，是把要檢測(cè)的樣品接種在指示細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，然后用特異性熒光染料進(jìn)行染色，再用熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察，通過(guò)附著在細(xì)胞表面的支原體DNA的著色情況判斷該樣品是否被支原體污染。該方法用時(shí)短，可進(jìn)行多個(gè)樣品檢測(cè)，還能檢測(cè)出使用直接培養(yǎng)法難以檢測(cè)出的支原體類(lèi)型，對(duì)此可以用該方法在配苗前初步篩選，去除污染樣品，進(jìn)一步減少疫苗生產(chǎn)中產(chǎn)生的損失，保證疫苗的質(zhì)量及安全。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)DNA熒光染色法比直接培養(yǎng)法更為敏感、方便，耗時(shí)短、準(zhǔn)確穩(wěn)定。但使用DNA熒光染色法要注意對(duì)細(xì)胞源疫苗或細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的檢測(cè)，因細(xì)胞核酸碎片會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生影響。

3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)即ELISA檢測(cè)法，對(duì)診斷支原體是較方便和準(zhǔn)確的方法之一，常見(jiàn)的ELISA檢測(cè)法有間接法和抗原競(jìng)爭(zhēng)法等，檢測(cè)支原體都有較好的特異性及敏感性，并且可以一次性進(jìn)行多樣品檢測(cè)，目前ELISA檢測(cè)法已經(jīng)被廣泛用在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并且成為檢測(cè)支原體的常規(guī)方法之一，一般是通過(guò)比色法得出相應(yīng)的結(jié)果進(jìn)一步來(lái)判定是否有支原體污染的情況。

4.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)法。PCR方法是一種DNA復(fù)制的體外擴(kuò)增方法，由于支原體生長(zhǎng)緩慢對(duì)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境要求較高，對(duì)支原體直接培養(yǎng)法檢測(cè)還有一定局限性，而PCR檢測(cè)法相對(duì)于直接培養(yǎng)法更為快速、敏感，并且在獸用疫苗的生產(chǎn)過(guò)程中推廣及應(yīng)用。其中的巢式PCR檢測(cè)法是在普通PCR檢測(cè)方法上進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)的，通過(guò)巢式PCR引物擴(kuò)增后存在的目的片段情況進(jìn)行合理判斷，并可以對(duì)支原體類(lèi)型進(jìn)行準(zhǔn)確的分析及判斷，進(jìn)一步對(duì)污染源進(jìn)行判斷。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域進(jìn)行運(yùn)用，通過(guò)熒光信號(hào)變化對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量分析，該方法靈敏、重復(fù)性高，但標(biāo)準(zhǔn)品難以獲得、檢測(cè)成本較高等因素影響，限制了該方法的應(yīng)用。

四、支原體污染預(yù)防

在獸用疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)都有被支原體污染的可能，對(duì)此就需要在疫苗生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)把好質(zhì)量，并進(jìn)行檢測(cè)，排除支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)。

1.把好材料關(guān)。在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中所運(yùn)用到的材料，有雞胚、動(dòng)物、細(xì)胞及培養(yǎng)細(xì)胞所用的血清、胰酶、培養(yǎng)基等都有存在支原體污染的可能，對(duì)此在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中就需要保證材料的純凈，同時(shí)要對(duì)動(dòng)物、雞胚、細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，排除支原體污染的可能，如果條件允許可以使用無(wú)支原體污染的SPF動(dòng)物及雞胚，保證試驗(yàn)用動(dòng)物及雞胚無(wú)污染；其次在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)及培養(yǎng)細(xì)胞所用的試劑儀器要進(jìn)行無(wú)菌配制或高壓蒸汽滅菌，減少支原體污染的可能，同時(shí)也要保證血清和培養(yǎng)液等試劑的成分及來(lái)源，從源頭減少支原體污染風(fēng)險(xiǎn)。

2.優(yōu)化環(huán)境關(guān)。在疫苗生產(chǎn)過(guò)程，生產(chǎn)環(huán)境尤為重要，要對(duì)生產(chǎn)環(huán)境定期消毒滅菌，并對(duì)生產(chǎn)環(huán)節(jié)中可能帶來(lái)污染來(lái)源的路徑進(jìn)行嚴(yán)格把控，避免交叉感染。其次要對(duì)使用的儀器進(jìn)行高壓蒸汽滅菌或紫外消毒滅菌，確保生產(chǎn)環(huán)境得到充分徹底的消毒滅菌，并保證進(jìn)入生產(chǎn)空間的所有物品進(jìn)行消毒或紫外照射，保證生產(chǎn)環(huán)境不會(huì)被支原體污染。

3.嚴(yán)格把控生產(chǎn)關(guān)。獸醫(yī)疫苗的生產(chǎn)中，嚴(yán)把生產(chǎn)關(guān)對(duì)支原體污染的防控非常重要。首先在生產(chǎn)中要加強(qiáng)對(duì)人員的管理，嚴(yán)格要求所有人員按照規(guī)范進(jìn)行操作，減少支原體污染的可能；其次要強(qiáng)化在生產(chǎn)中的消毒滅菌，并進(jìn)行檢測(cè)，防止支原體通過(guò)器具、物品進(jìn)行污染；同時(shí)要合理地使用抗生素，選擇對(duì)支原體有抑制作用的抗生素，可添加在細(xì)胞培養(yǎng)基或胰酶中，減少支原體污染細(xì)胞，給疫苗生產(chǎn)帶來(lái)更大的風(fēng)險(xiǎn)。

五、結(jié)語(yǔ)