急性缺血性腦卒中大鼠腦組織中Th17/Treg的變化*

程建華， 黃一睿， 肖美娟， 韓 釗

(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 2溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科， 3溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 浙江 溫州 325000)

腦卒中是嚴重危害人類健康的常見疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率等特點。急性缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，占全部腦卒中的 60%～80%。缺血性腦卒中確切的病理生理機制仍不非常清楚。Louveau等[1]發(fā)現(xiàn)了硬腦膜竇內(nèi)的功能性淋巴管，這些淋巴管與深部頸淋巴結(jié)相連，能表達淋巴管內(nèi)皮細胞的所有分子標(biāo)志物，并且能夠從腦脊液中攜帶免疫細胞，這為我們研究缺血性腦卒中的免疫炎癥機制提供了更豐富的解剖學(xué)基礎(chǔ)。最近的研究表明免疫炎癥反應(yīng)在急性缺血性卒中的病理生理過程中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。輔助性T細胞17 (T helper 17 cells,Th17)及調(diào)節(jié)性T細胞(re-gulatory T cells, Treg)是2類來源于CD4+T細胞的重要的免疫細胞。Th17細胞主要參與早期炎癥反應(yīng)，分泌促炎因子白細胞介素17(interleukir-17,IL-17)等；Treg 則分泌抗炎因子IL-10等，減輕外周和腦組織的促炎因子，發(fā)揮抑制炎癥的作用[4]。Th17/Treg平衡在炎癥反應(yīng)中起著重要的作用[4]，Th17/Treg失衡可能引起免疫應(yīng)答異常，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。雖然較多文獻報道了缺血性卒中患者的外周血液存在Th17/Treg功能失衡的表現(xiàn)，然而目前尚未檢索到關(guān)于急性缺血性腦卒中后腦組織Th17/Treg變化的文獻，本研究擬探討急性缺血性腦卒中大鼠腦組織中Th17/Treg的變化及意義。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

16只雄性SD大鼠，體重250～300 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號為SCXK(滬)2012-0002。16只大鼠隨機分為實驗組及對照組，每組8只， SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。

2 主要儀器與試劑

線栓(北京沙東生物技術(shù)有限公司，貨號：2636-50)；NovoCyte流式細胞儀(ACEABIO)；全波長酶標(biāo)儀(1681130-4B)和CFX Connect Real-Time PCR Detectiont System(Bio-Rad,配套使用的分析軟件為Bio-Rad CFX Manager 3.1)。水合氯醛(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；TTC染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；白細胞介素10(interleukin-10， IL-10) ELISA 試劑盒(貨號：70-EK3172/2)和IL-17A ELISA 試劑盒(貨號：70-EK3102/2，MultiSciences)；抗FOXP3、CD4、IL-17A和IL-10抗體(eBioscience)；高純總RNA快速提取試劑盒(Generay)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)；SsoAdvance Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)。RT-qPCR引物由自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

3 方法

3.1大鼠急性缺血性腦卒中模型制作 參照Zea Longa 線栓法再加以改進制作SD大鼠急性缺血性大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型，以左側(cè)大腦栓塞為例 。大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水。實驗前腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈和迷走神經(jīng)。頸總動脈打一活結(jié)，在頸外動脈離心端1 cm處結(jié)扎頸外動脈，同時夾閉頸內(nèi)動脈，然后在頸外動脈上做一小切口，將線栓插入后剪斷頸外動脈，之后將線栓沿著頸內(nèi)動脈入顱的方向插人，當(dāng)插入約距頸總動脈分叉處18～20 mm左右時感到一輕微阻力時便立即停止插入，即表明已經(jīng)阻塞大腦中動脈。阻斷120 min后，線栓拔出，解除頸總動脈活結(jié)，貫通頸總動脈與頸內(nèi)動脈通路。假手術(shù)(sham)組除將線栓插入深度不阻塞大腦中動脈外，其余均與上述手術(shù)步驟相同。假手術(shù)組作為對照。采用Longa評分法觀察缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能缺損情況。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺損(提尾時不能完全伸展右側(cè)前肢)；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損(行走時向右側(cè)旋轉(zhuǎn))；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損(自主運動時間向右側(cè)傾斜)；4分：不能自發(fā)行走，意識障礙。MCAO組需剔除MCAO術(shù)后神經(jīng)癥狀評分0分及4分的動物。

3.2TTC染色 取上述2組大鼠大腦，每組4只,在MCAO術(shù)后3 d通過TTC染色觀察各組大鼠腦梗死體積。在術(shù)后3 d對各組大鼠進行腹腔麻醉，取腦，每隔2 mm連續(xù)切6個冠狀切片。立即將腦組織切片浸入盛有2%TTC溶液的玻璃皿中，腦組織表面覆蓋蓋玻片，避光、37℃恒溫孵育15 min，使腦片著色。正常組織染為紅色，梗死灶染成白色，取出腦切片，蒸餾水沖洗，置于4%多聚甲醛中固定24 h后，將所有腦切片按同側(cè)順序排列，拍照，采用IPP6.0進行圖像處理分析，并校正每個腦片中的梗死面積及腦水腫引起的差異。計算梗死灶(蒼白區(qū))范圍，將每一腦片的梗死面積乘以2 mm厚度，再將各腦片數(shù)值相加后得到梗死體積的近似值[8]。

3.3ELISA檢測腦組織中IL-17A和IL-10的含量 大鼠MCAO術(shù)后3 d，腹腔麻醉，取腦，去除小腦及腦干，立即置于液氮中研磨，提取蛋白。運用ELISA法檢測IL-10和IL-17A的含量。首先加入300 μL 1×洗液靜置浸泡30 s，棄掉洗液。復(fù)孔加入100 μL 2倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品?？瞻卓讖?fù)孔加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。樣本孔加入80 μL 1×檢測緩沖液和20 μL樣本。每孔加入50 μL稀釋的檢測抗體。使用封板膜封板。300 r/min轉(zhuǎn)振蕩，室溫孵育2 h。棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌6次。每次洗板，在吸水紙上拍干。每孔加入100 μL稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。使用新的封板膜封板。300 r/min振蕩，室溫孵育45 min。每孔加入100 μL TMB底物顯色液，避光，室溫孵育5～30 min。每孔加入100 μL終止液。顏色由藍色變?yōu)辄S色。使用酶標(biāo)儀進行雙波長檢測，測定450 nm最大吸收波長和570 nm或630 nm參考波長下的吸光度(A)值。

3.4RT-qPCR檢測腦組織中IL-17、IL-10、Foxp3和RORrt的mRNA水平 麻醉大鼠后直接斷頭取腦，立即置于液氮中，再轉(zhuǎn)移到-80℃保存。采用TRIzol-離心柱法提取細胞總RNA，取2 μL RNA溶液于BioDrop檢測RNA純度和濃度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，-70 ℃保存cDNA。利用SsoAdvance Universal SYBR Green Supermix在實時定量PCR儀上進行熒光定量PCR擴增實驗。反應(yīng)條件為:95.0 ℃ 3 min； 95.0 ℃ 15 s、 59.0 ℃ 30 s、 72.0 ℃ 30 s，運行40個循環(huán)。利用Bio-Rad CFX Manager 3.1分析軟件進行分析。

3.5流式細胞術(shù)檢測組織中Th17/Treg的變化 用生理鹽水沖洗大鼠腦組織，迅速放入含PBS液的培養(yǎng)皿中；將腦組織剪碎轉(zhuǎn)移到2 mL PE管，加0.25%的胰酶1 mL，37 ℃水浴消化10 min；加血清終止消化后300目尼龍網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心5 min；加PBS液漂洗稀釋細胞，制備成單細胞細胞懸液，用PBS定容細胞，計數(shù)后調(diào)整濃度為5×109/L。每管取100 μL單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min, 后用4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%Triton X-100室溫處理15 min，PBS漂洗，10%BSA-PBS重懸(100 μL)。細胞用anti-rat CD4-APC、anti-rat Foxp3-FITC和anti-rat IL-17A-FITC標(biāo)記表面抗原及核內(nèi)抗原。4 ℃孵育過夜，PBS漂洗2次，500 μL PBS重懸，上機做流式檢測。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析， 2組大鼠的組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 急性腦缺血模型的制備

應(yīng)用線栓法制作腦缺血模型，采用Longa評分法觀察模型大鼠的神經(jīng)功能缺損情況。實驗過程中無大鼠死亡。大鼠腦缺血再灌注后0 h和72 h，假手術(shù)組大鼠評分都是0分，說明沒有神經(jīng)功能缺損癥狀；而模型組造模0 h和72 h后評分分別為1.67±0.21和1.50±0.22分，說明模型組大鼠有輕度至中度局灶性神經(jīng)功能缺。TTC染色結(jié)果顯示， 假手術(shù)組大鼠腦部均為紅色，為正常部位；而MCAO組大鼠左側(cè)腦缺血部位則呈現(xiàn)蒼白色，為腦部梗死區(qū)，見圖1A。對2組大鼠的腦梗死體積占同側(cè)全部腦組織體積的百分比進行統(tǒng)計分析，與假手術(shù)組相比，MCAO組腦梗死體積顯著增大(P<0.01)，占整個同側(cè)大腦的(20.48±5.02)%，見圖1B。以上結(jié)果表明造模成功。

2 ELISA測定腦組織IL-17A和IL-10含量的變化

為了研究急性腦缺血后腦組織中Th17/Treg的功能變化，我們對腦組中的Th17的分化和效應(yīng)相關(guān)細胞因子IL-17A(由Th17細胞分泌)的含量及Treg的分化和效應(yīng)相關(guān)細胞因子IL-10(由Treg細胞分泌)的含量進行了測定。根據(jù)ELISA檢測結(jié)果，MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織中IL-17A的濃度為(12.72±3.45) ng/L，假手術(shù)組大鼠腦組織的IL-17A的濃度為(6.56±1.21) ng/L；MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織中IL-10的濃度為(27.22±6.41)ng/L，假手術(shù)組大鼠腦組織的IL-10的濃度為(86.11±19.25)ng/L。和假手術(shù)組相比，MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織中IL-17A的含量升高，IL-10的含量降低(P<0.05),見圖2。

Figure 1.TTC staining was used to assess the cerebral infarct volume. A: TTC staining was performed on the brains of MCAO and sham-operated rats; B: the percentage of cerebral infarct volume in different treatment groups. Mean±SD.n=4.**P<0.01vssham group.

圖1TTC染色評估腦梗死體積

Figure 2.The levels of IL-17A and IL-10 in the brain tissues of rats were detected by ELISA. Mean±SD.n=4.*P<0.05vssham group.

圖2ELISA檢測腦組織中IL-17A和IL-10的含量

3 RT-qPCR檢測腦組織中IL-17、IL-10及Foxp3和RORγt mRNA表達的變化

轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子RORγt 在Th17 的分化中發(fā)揮重要作用，而Treg的分化與其特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Foxp3有關(guān)。我們檢測了2組大鼠腦組織中Foxp3、RORγt、IL-17和IL-10的mRNA表達水平。由結(jié)果可知，與假手術(shù)組相比，MCAO組大鼠腦組織中IL-17的mRNA表達明顯升高(P<0.01)，RORγt 的mRNA表達水平也明顯升高(P<0.05)；與假手術(shù)組相比，MCAO組大鼠腦組織中Foxp3和IL-10 mRNA的表達都顯著降低(P<0.05)，見圖3。

4 流式細胞術(shù)分析腦組織Th17 (CD4+IL-17+) 和Treg(CD4+Foxp3+)的比例

為了進一步確認腦缺血模型中Th17/Treg的變化，我們又利用流式細胞術(shù)對模型組和假手術(shù)組大鼠腦組織的Th17及Treg進行了測定。結(jié)果顯示， MCAO組的Th17 (CD4+IL-17+T) 占CD4+T細胞的比例為(51.44±10.30)%；而假手術(shù)組腦中Th17(CD4+IL-17+) 所占CD4+T細胞的比例僅為(18.42 ± 3.69)%(P<0.05)。而檢測Treg(CD4+Foxp3+)占CD4+T細胞的比例，MCAO組為(5.11±0.90)%，假手術(shù)組為(29.92±6.31)%(P<0.05)。所以，MCAO組腦組織Th17/Treg比例為(24.44±5.68),假手術(shù)組為(0.76±0.17), 與假手術(shù)組相比， MCAO組腦組織Th17/Treg比例顯著升高(P<0.05)，見圖4。

討 論

腦卒中的病理生理機制已經(jīng)成為全球卒中領(lǐng)域關(guān)注的焦點。而免疫炎癥是缺血性腦卒中病理過程中的一個主要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦卒中大鼠模型中，Th17的分化和效應(yīng)相關(guān)細胞因子IL-17A的含量顯著增加；Treg的分化和效應(yīng)相關(guān)細胞因子IL-10的含量顯著減少。IL-17和轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達水平也比假手術(shù)組顯著提高，IL-10和Foxp3的表達水平顯著降低。流式結(jié)果顯示模型組大鼠腦組織Th17增多；Treg明顯減少。這些結(jié)果提示Th17/Treg的平衡可能在腦卒中的生理病理過程發(fā)揮了重要的作用，與臨床研究的文獻報道結(jié)果一致。

Figure 3.RT-qPCR was performed to determine the mRNA expression of Foxp3, RORγt, IL-17A and IL-10 in the rat brains. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vssham group.

圖3RT-qPCR檢測大鼠腦組織中Foxp3、RORγt、IL-17和IL-10的mRNA表達

Figure 4.The ratio of Th17 (CD4+IL-17+) and Treg (CD4+Foxp3+) in the brain tissue was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=4.*P<0.05vssham group.

圖4流式細胞術(shù)檢測腦組織Th17(CD4+IL-17+)和Treg(CD4+Foxp3+)的比例

Th17和Treg是2類不同于Th1和Th2的CD4+T淋巴細胞。Th17能夠表達促炎細胞因子IL-17A、IL-17F和IL-22，主要存在于腸道黏膜等宿主屏障表面，抵抗入侵上皮細胞的微生物，起到保護宿主的作用[9]。維A酸相關(guān)孤獨受體亞家族中RORα和RORγt是Th17形成的特異性轉(zhuǎn)錄因子。Treg細胞也主要存在于腸道黏膜中，對于可能損害宿主組織過度的效應(yīng)T細胞應(yīng)答起到抑制作用。Treg的典型特征是能夠表達轉(zhuǎn)錄因子Foxp3。Treg對于維持宿主的自身免疫耐受性和體內(nèi)平衡至關(guān)重要。Treg細胞數(shù)量的增加阻礙了對腫瘤的免疫反應(yīng)，而Treg細胞的喪失則與自身免疫疾病有關(guān)[10]。Th17及Treg不僅在分化方向上有聯(lián)系, 而且能互相轉(zhuǎn)化，兩者始終處于動態(tài)平衡, Th17/Treg的失衡促進了炎癥和腫瘤等疾病的發(fā)展，目前Th17/Treg的平衡已經(jīng)成為免疫炎癥研究的一個靶點[5-7,11]。

多項針對缺血性腦卒中患者的臨床研究都發(fā)現(xiàn)外周血液有Th17/Treg功能失衡的表現(xiàn)，包括分泌的細胞因子IL-17A 和IL-10水平的變化，以及轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3的mRNA表達的變化。有報道顯示缺血性腦卒中患者血漿中IL-17A水平和外周血單核細胞中RORγt mRNA的表達都顯著增加，而外周血單核細胞中Foxp3 mRNA表達水平則顯著降低[12-13]。針對急性腦梗塞患者的研究結(jié)果顯示, 與短暫性腦缺血發(fā)作患者和健康對照相比，急性腦梗塞患者的外周血中細胞因子IL-17和IL-6的水平顯著升高，轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達也明顯增加；而調(diào)節(jié)細胞因子IL-10和TGF-β1的水平及Foxp3 mRNA表達則下降[14]。在缺血/再灌注的腦梗死模型的動物實驗發(fā)現(xiàn)，在腦梗死后1 d可以觀察到IL-17 mRNA及其蛋白表達明顯升高，且IL-17 mRNA的高峰在腦梗死后3 d出現(xiàn)，而蛋白的高水平則維持到第6天[15]。我們在缺血性腦卒中大鼠模型中也證明了細胞因子IL-17A的含量在腦部顯著增加；IL-10的含量顯著減少。轉(zhuǎn)錄因子RORγt的mRNA表達水平也比假手術(shù)組顯著提高，F(xiàn)oxp3的mRNA表達水平顯著降低。我們的結(jié)果也為Th17/Treg平衡參與腦卒中的病理生理過程提供了新的證據(jù)。

多項研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者的外周血液有Th17/Treg細胞比例變化的表現(xiàn)。Li等[14]針對急性腦梗塞患者的研究結(jié)果顯示, 與短暫性腦缺血發(fā)作患者和健康對照者相比，急性腦梗塞患者外周血的CD4+IL-17A+細胞(Th17)增加，CD4+CD25+Foxp3+細胞(Treg)減少。一項針對老年急性腦梗死患者的研究表明，在缺血性卒中患者中發(fā)現(xiàn)腦梗死后第1天及第5天外周血液中CD4+IL-17A+細胞 (Th17)明顯高于正常對照組，而CD4+Foxp3+細胞(Treg)則明顯低于對照組，提示Th17細胞與Treg細胞參與了缺血性卒中的病理生理過程[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)缺血性卒中大鼠腦組織的Th17細胞比對照組顯著增多；Treg細胞明顯減少(P<0.05)，表明Th17/Treg的平衡可能是腦卒中的發(fā)病機制之一。上述研究提示體內(nèi)Th17/Treg的平衡有望成為缺血性卒中免疫治療的一個新的靶點，但針對Th17/Treg的平衡開發(fā)的藥物及干預(yù)措施來治療缺血性卒中還需要更多的研究。

研究表明Th17分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγt和促炎因子IL-17A 的表達水平可以通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α、STAT1，STAT3和STAT5等轉(zhuǎn)錄因子進一步調(diào)節(jié)[16]。腦缺血狀態(tài)下，活化的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞/巨噬細胞中STAT3和 STAT1表達量急劇上升[17]。另外發(fā)現(xiàn)磷酸化JAK2和磷酸化STAT3蛋白在缺血再灌注損傷后表達明顯增強，并參與促進神經(jīng)細胞的死亡，表明JAK/STAT通路在腦卒中免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[18]。結(jié)合本研究的結(jié)果，我們下一步計劃針對腦缺血后JAK/STAT通路在調(diào)控Th17/Treg細胞平衡影響免疫炎癥反應(yīng)的機制方面開展深入的研究。

綜上所述，本研究利用缺血性腦卒中大鼠模型，檢測腦組織Th17/Treg變化，結(jié)果表明在缺血性腦卒中過程中免疫炎癥反應(yīng)被激活。這些結(jié)果為Th17/Treg的平衡參與腦卒中的生理病理過程提供了新的證據(jù)，并為腦卒中的免疫治療提供了新的方向。