雷帕霉素改善Aβ31-35所致小鼠晝夜節(jié)律紊亂*

王昌圖， 張 蕊， 原 媛， 趙 今， 任亞楠， 王 麗△， 王曉暉△

(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1病理教研室, 2形態(tài)學(xué)實驗室， 太原 山西 030001)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種常見的與老化密切相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病[1]。近年來，AD發(fā)病率逐漸升高，給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟和心理負擔。據(jù)研究報道，80%的65歲以上AD患者在發(fā)病早期階段就已出現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂，而晝夜節(jié)律紊亂又加重AD的其它臨床表現(xiàn)，如學(xué)習(xí)記憶功能障礙和認知缺陷等[2-3]。大量研究表明作為AD主要的病理變化之一，神經(jīng)元間隙沉積的β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)是導(dǎo)致AD患者出現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂的重要因素[4]。本課題組前期研究同樣發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠海馬內(nèi)注射Aβ31-35后，其跑輪行為出現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律紊亂，同時Per2的mRNA和蛋白表達明顯異常[5]。然而目前針對AD患者早期出現(xiàn)的晝夜節(jié)律紊亂，尚缺乏有效治療手段。

雷帕霉素(rapamycin，Rapa)是一種大環(huán)內(nèi)酯內(nèi)抗生素，早期主要作為腎移植免疫抑制藥物應(yīng)用于臨床。近年研究發(fā)現(xiàn)，Rapa除了免疫抑制作用外，在抗衰老和腦保護方面的作用更為顯著[6]。已有研究顯示,Rapa可以用于治療AD，減輕AD小鼠的認知功能損害，抑制Aβ的產(chǎn)生和聚集，降低tau蛋白的過度磷酸化，從而延緩AD的病理過程[7]。然而，Rapa是否能改善Aβ誘導(dǎo)的小鼠晝夜節(jié)律紊亂目前尚未見報道。因此，本研究擬探討Rapa對Aβ31-35誘導(dǎo)的小鼠晝夜節(jié)律紊亂的作用，為臨床治療AD患者晝夜節(jié)律紊亂提供新的治療措施。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級雄性C57BL/6小鼠6～8周齡，體重18～22 g；由山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，許可證號為SCXK(晉)2015-001；隨機分為溶劑對照(control)組、Aβ31-35(Aβ)組、Rapa預(yù)處理(Rapa+Aβ)組和Rapa組，每組各9只。將小鼠置于室溫20～24 ℃、濕度35%～55%、自由飲食的較恒定環(huán)境中。

2 主要試劑和儀器

Rapa(碧云天，SBJ-I1028)；Aβ31-35(Abcam，ab120974)；胎牛血清(Sciencell，0500)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Thermo SH，30022.01B)；Cell Counting Kit-8試劑盒(Dojindo，CK04)；RNAiso Plus(DRR036A)、Prime Script RT Master Mix(DRR036A)和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(DRR820A)均購自TaKaRa；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(索萊寶，P1200)；抗Per2抗體(Santa Cruz，sc-25363)；小鼠抗β-actin單克隆抗體(TA-09)、辣根過氧化酶標記山羊抗小鼠IgG(ZB-2305)和辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG(ZB-2301)均購自中杉金橋。VitalView實時數(shù)據(jù)監(jiān)測儀和ActiView生物節(jié)律分析系統(tǒng)(Mini-Mitter)；HERAcell 150i CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(Thermo)；IX51顯微鏡(Olympus)；SMP500-071 47-HLXU酶聯(lián)免疫檢測儀(SoftMax)，LR56495低溫高速離心機(Thermo Fisher)；MX3005P PCR擴增儀(Stratagene)；MX3005P熱循環(huán)儀(MJ Research); BioSpectrum 810凝膠成像系統(tǒng)(UVP)。

3 主要方法

3.1海馬內(nèi)給藥 高壓滅菌三蒸水將Aβ31-35溶解稀釋至1 g/L，37 ℃恒溫水浴鍋中孵育36 h，使其充分老化。二甲基亞砜(DMSO)將Rapa充分溶解后再用PBS稀釋至 2.5 g/L。10%水合氯醛腹腔注射對C57BL/6小鼠進行麻醉，剪去小鼠頭頂毛發(fā)，將小鼠頭部固定在三維腦立體定位儀上，剪開頭皮暴露顱骨，以前囟為基點，向后移動2 mm，然后分別向左和右移動1.8 mm，做好標記，對應(yīng)標記處緩慢進針1.8 mm即為小鼠海馬CA1區(qū)的解剖位點，緩慢注射藥物，速度約為0.2 μL/min。Control組給予等量的高壓三蒸水; Aβ組給予 Aβ31-35(每只15 nmol，單側(cè)海馬每只注射4.1 μL，雙側(cè)海馬共注射8.2 μL，給藥時間約每只41 min); Rapa組給予 Rapa(每只20 nmol，單側(cè)海馬每只注射3.7 μL，雙側(cè)海馬共注射7.4 μL，給藥時間約每只37 min); Rapa+Aβ組先給予20 nmol Rapa處理，15 min之后給予15 nmol Aβ31-35。給藥完畢后緩慢退針，縫合傷口，給予抗生素預(yù)防感染。

3.2跑輪行為學(xué)實驗 為評估各組小鼠跑輪節(jié)律狀態(tài)，將各組小鼠置于明暗(light-dark，LD)環(huán)境2周，之后改為持續(xù)黑暗(constant darkness/dark-dark，DD)環(huán)境2 周。采用VitalView生物節(jié)律檢測系統(tǒng)對小鼠跑輪活動進行實時監(jiān)測，系統(tǒng)每隔5 min記錄一次跑輪數(shù)據(jù)，跑輪實驗結(jié)束后，利用ActiView生物節(jié)律分析系統(tǒng)對跑輪運動原始圖及小鼠自由運轉(zhuǎn)周期進行分析。

3.3細胞培養(yǎng)及處理 小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT22購自廣州吉尼歐生物科技有限公司，配置含有10% 胎牛血清和1%的雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，用于HT22細胞培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶置于含5% CO2、 37 ℃恒溫及飽和濕度的CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中，待細胞融合度達到80%～90%后開始進行處理，先用含有1%胎牛血清的培養(yǎng)基對各組細胞進行1 h的饑餓處理，使各組細胞內(nèi)部節(jié)律達到同步化，此時記為circadian time 0 (CT0)，換液為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)并進行相應(yīng)處理：對照組繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；Aβ組加入5 μmol/L的Aβ31-35；Rapa+Aβ組先加入100 μmol/L Rapa作用1 h后加入5 μmol/L的Aβ31-35; Rapa組加入100 μmol/L的Rapa。

3.5Real-time PCR實驗 采用real-time PCR實驗檢測Per2的mRNA表達水平。在各個時點收集處理后的HT22細胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，選用SYBR Green試劑盒加入相應(yīng)引物進行擴增。Per2(GenBank ID: NM_011066.3)的上游引物序列為5’-TGGTCTGGACTGCACATCTGG-3’，下游引物序列為5’-AGGTCACTTGACGTGGAGATGG-3’；GAPDH(GenBank ID: NM_008084.2)的上游引物序列為5’-AAATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3’，下游引物序列為5’-CAACAATCTCCACTTTGCCACTG-3’。擴增完畢后用所得的結(jié)果與CT4時點的GAPDH的表達標化，采用2-ΔΔCt法進行相對定量。

3.6Western blot實驗對Per2蛋白的表達量進行定量分析 在Per2 mRNA表達差異最大的時點CT16收集處理后的HT22細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解1.5 h，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后提取上清，BCA法測蛋白濃度并進行蛋白定量，金屬浴100 ℃加熱10 min使蛋白變性，配制SDS-PAGE凝膠進行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入抗Per2抗體4 ℃過夜，TBST洗膜3次后加入相應(yīng) II 抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。使用凝膠成像系統(tǒng)進行曝光并采集圖像。利用ImageJ軟件對圖像灰度值進行分析，計算各組Per2蛋白的相對表達量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Rapa明顯緩解Aβ31-35所致C57BL/6小鼠跑輪晝夜節(jié)律紊亂

選擇6～8周齡雄性C57BL/6小鼠進行跑輪行為學(xué)實驗，在全黑暗(DD)環(huán)境中，對照組C57BL/6小鼠存在較為規(guī)律的跑輪活動，即運動相-休息相分界清晰，活動相主要集中在主觀黑夜，休息相主要集中在主觀白天，小鼠的自由運轉(zhuǎn)周期為(23.55±0.05) h；而海馬內(nèi)注射Aβ31-35后，小鼠跑輪行為的晝夜節(jié)律出現(xiàn)明顯紊亂，跑輪活動起始時間的變異性增大，運動相-休息相分界不清，并且小鼠自由運轉(zhuǎn)周期延長，為(23.75±0.03) h (P<0.05);給予Rapa預(yù)處理后，小鼠的跑輪晝夜節(jié)律在一定程度上得到改善，表現(xiàn)為運動相-休息相分界較為清楚，自由運轉(zhuǎn)周期明顯恢復(fù)，為(23.52±0.07) h (P<0.05);此外，Rapa單獨處理組小鼠自由運轉(zhuǎn)周期為(23.49±0.06) h，運動相-休息相分界明顯，且活動主要集中在小鼠主觀夜間，與對照組小鼠均無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖1。

2 Rapa改善Aβ31-35誘導(dǎo)的HT22細胞活力降低

分別用濃度為0、2.5、5和10 μmol/L的Aβ31-35處理HT22細胞，24 h后行CCK-8實驗，結(jié)果顯示Aβ31-35對HT22細胞具有一定的細胞毒性作用，表現(xiàn)為與對照組相比，在Aβ31-35濃度為5和10 μmol/L時，HT22細胞活力明顯降低(P<0.05),見圖2A。本研究選擇5 μmol/L 作為Aβ31-35的給藥濃度,進一步采用Rapa預(yù)處理，結(jié)果表明100 μmol/L Rapa預(yù)處理1 h后HT22細胞的相對活力為(98.76±3.60)%，與Aβ31-35處理組相比有顯著提高(P<0.05)，而Rapa單獨處理組細胞相對活力為(98.28±3.30)%，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2B。以上結(jié)果表明Rapa能顯著提高Aβ31-35引起的HT22細胞活力下降，具有神經(jīng)保護作用。

3 Rapa有效逆轉(zhuǎn)Aβ31-35所致HT22細胞Per2的mRNA和蛋白表達異常

采用real-time PCR檢測小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞Per2的mRNA表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組細胞的Per2 mRNA表達水平呈現(xiàn)一定的節(jié)律性，表現(xiàn)為CT8、CT16和CT24處表達水平相對較高，而在CT4、CT12和CT20處表達水平相對較低，且在CT16處表達水平最高;而經(jīng)5 μmol/L Aβ31-35處理后，我們發(fā)現(xiàn)Per2的mRNA表達水平與對照組相比出現(xiàn)明顯異常，具體表現(xiàn)為在CT16、CT20和CT24處Per2的mRNA表達水平較對照組降低(P<0.05)，且在CT16處降低幅度最大，提示Aβ31-35能誘導(dǎo)HT22細胞Per2的mRNA表達水平出現(xiàn)明顯異常;給予Rapa預(yù)處理1 h,HT22細胞Per2的表達節(jié)律在一定程度上得到了改善，與Aβ31-35單獨組相比，HT22細胞Per2的mRNA表達水平在CT16、CT20和CT24處均顯著提高；Rapa單獨處理組Per2的表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3A。

Figure 1.Rapa attenuated the circadian rhythm disorder induced by Aβ31-35 in C57BL/6 mice. A: representative actograms displayed running wheel activity of the individual mouse from 4 groups under constant DD conditions after 1 week of LD environment; B: free-running period of individual mouse from 4 groups. Mean±SEM.n=9.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAβ31-35 group.

圖1雷帕霉素改善Aβ31-35所致小鼠跑輪節(jié)律紊亂

Figure 2.The viability of the HT22 cells was decreased by the treatment of Aβ31-35, and Rapa reduced the toxicity of Aβ31-35. A: Aβ31-35 decreased the viability of the HT22 cells; B: Aβ31-35 (5 μmol/L) reduced the cell viability and pretreatment with Rapa increased the viability of HT22 cells after 24 h. Mean±SEM.n=12.△P<0.05vs0 μmol/L;*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAβ group.

圖2Rapa改善Aβ31-35誘導(dǎo)的HT22細胞活力降低

為了進一步驗證這一結(jié)果，我們選取mRNA表達差異最大的CT16時點(圖3B)對各組細胞的Per2蛋白表達進行檢測，結(jié)果顯示經(jīng) Aβ31-35處理后Per2蛋白的相對表達量與對照組相比顯著降低(P<0.05);而經(jīng)Rapa預(yù)處理1 h后Per2蛋白的相對表達量為較Aβ31-35處理后顯著升高(P<0.05);Rapa單獨處理后Per2蛋白的相對表達量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3C。以上結(jié)果均表明Rapa能有效改善Aβ31-35誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞Per2的mRNA和蛋白表達異常。

Figure 3.Rapa improved the abnormal expression of Per2 induced by Aβ31-35 in HT22 cells. A: the amount of Per2 mRNA at diffe-rent CT was quantified by real-time PCR; B: there were significant differences of mRNA expression levels between subgroups at CT16 (n=12); C: the results of Western blot for determining the protein levels of Per2 at CT16 in the HT22 cells (n=6). Mean±SEM.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAβ group.

圖3Rapa有效逆轉(zhuǎn)Aβ31-35所致HT22細胞Per2表達異常

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，海馬內(nèi)單獨注射Aβ31-35后可導(dǎo)致C57BL/6雄性小鼠跑輪晝夜節(jié)律出現(xiàn)明顯紊亂，而給予Rapa聯(lián)合注射明顯緩解了Aβ31-35所致C57BL/6雄性小鼠晝夜節(jié)律紊亂。進一步采用HT22神經(jīng)元細胞研究發(fā)現(xiàn)，Rapa可以明顯緩解Aβ31-35誘導(dǎo)的Per2異常表達。這提示Rapa可以有效改善Aβ31-35誘導(dǎo)的晝夜節(jié)律紊亂。

AD是一種漸進性的神經(jīng)退行性疾病[1]，以老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和海馬區(qū)神經(jīng)元丟失為主要病理特征[8]。研究證實，作為老年斑主要成分的Aβ在腦內(nèi)沉積可觸發(fā)級聯(lián)病理反應(yīng)加重神經(jīng)元纖維纏繞和神經(jīng)元丟失，進而加速AD病情進展[9]。Aβ在腦內(nèi)的異常形成并堆積而產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用已被公認是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素[10]。有報道顯示，Aβ的核心片段之一Aβ31-35可對大鼠原代皮層神經(jīng)元產(chǎn)生明顯的毒性作用[11]。本研究采用CCK-8細胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)5 μmol/L的Aβ31-35可導(dǎo)致小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞的存活率明顯降低。

近年來越來越多的證據(jù)表明，大部分AD患者早期即出現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂，而晝夜節(jié)律紊亂又可加重AD的其它癥狀如學(xué)習(xí)記憶功能障礙和認知功能缺陷等，從而加速AD病情進展[12-13]。此外，相關(guān)文獻報道稱，AD患者的晝夜節(jié)律紊亂與腦內(nèi)Aβ異常沉積密切相關(guān)，這一觀點在AD模型鼠上亦得到證實，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)存在大量的Aβ沉積，表現(xiàn)出睡眠-覺醒周期紊亂[10]。本課題組通過跑輪行為學(xué)實驗也表明C57BL/6小鼠跑輪節(jié)律可被Aβ的核心毒性片段Aβ31-35明顯擾亂[5]。在本研究中，小鼠跑輪行為學(xué)實驗的結(jié)果也證實Aβ31-35可誘導(dǎo)6～8周齡雄性C57BL/6小鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂，自由運轉(zhuǎn)周期延長。

晝夜節(jié)律俗稱生物鐘，是指在生物體內(nèi)存在的以近似24 h為周期的生物節(jié)律，其主要目的是使機體內(nèi)部各器官相互協(xié)調(diào)以更好地適應(yīng)外界環(huán)境變化。晝夜節(jié)律的維持依賴于由一系列的節(jié)律基因/蛋白構(gòu)成的正負轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)路(transcription translation feedback loop，TTFL)，即由Bmal1和Clock組成的正反饋環(huán)路和由Per和Cry組成的負反饋環(huán)路[14-15]，其中Per2作為晝夜系統(tǒng)的重要組成部分，在多種伴有晝夜節(jié)律紊亂的疾病中均受到破壞[16]。相關(guān)研究表明，per2-/-小鼠的跑輪行為可出現(xiàn)明顯的節(jié)律紊亂[17]。而per2基因突變的人群，會出現(xiàn)家族性睡眠時相提前綜合征[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞經(jīng)5 μmol/L Aβ31-35處理后per2基因的表達水平同對照組相比在CT16、CT20和CT24均降低，其中以CT16降低最為顯著，提示Aβ31-35可使per2基因表達發(fā)生異常。在per2基因表達差異最大的時點CT16檢測Per2蛋白表達水平，我們也得到了類似的結(jié)果。由此可見，Aβ31-35可以誘導(dǎo)C57BL/6小鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂，導(dǎo)致HT22神經(jīng)細胞Per2基因/蛋白出現(xiàn)明顯異常。然而，針對Aβ31-35誘導(dǎo)的晝夜節(jié)律紊亂，目前仍缺乏有效的治療手段。

Rapa是一種大環(huán)內(nèi)酯內(nèi)抗生素，主要通過與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)結(jié)合發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)。mTOR是一種絲-蘇氨酸蛋白激酶，在多條信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。目前諸多文獻報道稱，Rapa可通過mTOR信號通路，抑制免疫、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)及減少一氧化氮量來減輕局部損傷反應(yīng)，同時增加細胞自噬能力，清除異常堆積的物質(zhì)，發(fā)揮其神經(jīng)保護作用[19]。已有大量證據(jù)表明，在AD模型小鼠中，Rapa可以通過抑制mTOR，提高自噬水平及Aβ載體α7型煙堿樣乙酰膽堿受體(α7nAChR)的表達量以清除細胞胞外沉積的Aβ和異常磷酸化的tau蛋白，起到神經(jīng)保護和改善認知功能缺陷的作用[20-21];除此之外，Cao等[22]發(fā)現(xiàn)，在光照條件下，在不同時點給予小鼠側(cè)腦室注射Rapa可影響小鼠視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)中Per2蛋白表達水平。然而Rapa是否能拮抗Aβ所致晝夜節(jié)律紊亂，目前尚未見研究報道。在本次研究中，我們應(yīng)用小鼠跑輪行為學(xué)實驗，發(fā)現(xiàn)與Aβ31-35單獨組相比，Rapa+Aβ31-35聯(lián)合處理組小鼠的晝夜自發(fā)運動較為規(guī)律，運動相/休息相分界清晰，自由運轉(zhuǎn)周期降低，證實了Rapa對Aβ31-35誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠晝夜節(jié)律紊亂具有改善作用；進一步采用HT22神經(jīng)元細胞進行研究，結(jié)果顯示Rapa可逆轉(zhuǎn)Aβ31-35所致HT22細胞Per2的異常節(jié)律性表達。以上結(jié)果表明，Rapa可能通過調(diào)節(jié)Aβ31-35誘導(dǎo)的Per2異常節(jié)律性表達，從而改善晝夜節(jié)律紊亂。然而，本研究證實的Rapa拮抗 Aβ 神經(jīng)毒性作用是否也與保護自噬溶酶體功能有關(guān)，仍需進一步證實。

綜上所述，本研究首次明確雷帕霉素可以改善Aβ31-35導(dǎo)致的C57BL/6小鼠跑輪晝夜節(jié)律紊亂，并在細胞水平進一步證實，雷帕霉素可以改善Aβ31-35導(dǎo)致的HT22細胞中Per2表達水平異常。這在一定程度上為AD患者晝夜節(jié)律紊亂的防治提供了新思路。