胚胎培養(yǎng)液游離DNA檢測在人類輔助生殖技術(shù)中的臨床應(yīng)用挑戰(zhàn)

劉如月 欒宗檜 葉飛 熊東升 劉偉信

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(preimplantation genetic testing，PGT)技術(shù)是在胚胎移植前，取出早期胚胎細胞進行遺傳學(xué)檢測和分析，將染色體正常的胚胎移植入母體宮腔內(nèi)，能有效提高體外受精-胚胎移植( in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET )的臨床妊娠率和胚胎植入率，降低流產(chǎn)率[1]。其中，胚胎染色體非整倍體篩查(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)技術(shù)的臨床意義在于檢測胚胎染色體是否存在非整倍體現(xiàn)象，從而篩選出整倍體胚胎進行移植，這已在人類輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)中廣泛應(yīng)用。但PGT技術(shù)需對胚胎進行活檢操作，可能影響胚胎發(fā)育，其安全性有待進一步研究[2]。近年來，隨著對胚胎游離DNA(cell-free DNA)的研究，使無創(chuàng)胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(noninvasive preimplantation genetic testing，Ni-PGT)技術(shù)成為可能。2016年，無創(chuàng)胚胎染色體篩查(non-invasive chromosome screening，NICS)技術(shù)的應(yīng)用已有活產(chǎn)報道，此項技術(shù)通過提取胚胎培養(yǎng)液中的游離DNA，采用多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)技術(shù)結(jié)合二代測序(next generation sequencing，NGS)，以無創(chuàng)的方式對胚胎進行染色體篩查，并比較了胚胎培養(yǎng)液中游離DNA與對應(yīng)的整個胚胎的24條染色體整倍體情況，結(jié)果顯示NICS的敏感度和特異性達88.2%和84.0%[3]。此外，NICS技術(shù)的無創(chuàng)、安全、簡單有效等優(yōu)點，在篩選整倍體胚胎方面具有較高的臨床應(yīng)用價值，已成為ART中的研究熱點。但Ni-PGT技術(shù)仍存在樣本獲取困難、樣本污染、檢測準確性有待提高等問題，有待進一步深入探索。

一、胚胎游離DNA的臨床應(yīng)用

胚胎游離DNA是胚胎在體外發(fā)育過程中將胚胎游離DNA分子及片段釋放到囊胚腔液及胚胎培養(yǎng)液中的一種生物學(xué)標志物[4]。Stigliani等[5]在2013年發(fā)現(xiàn)，胚胎在發(fā)育早期即可釋放胚胎游離DNA到胚胎培養(yǎng)液中，包括基因組DNA與線粒體DNA，并且證明高線粒體DNA/基因組DNA比率與胚胎質(zhì)量差和高度碎片化相關(guān)。另有研究顯示胚胎培養(yǎng)的第3天胚胎培養(yǎng)液中高線粒體DNA/基因組DNA比率與優(yōu)質(zhì)胚胎的形成有關(guān)，這為應(yīng)用胚胎游離DNA進行胚胎植入前篩選奠定了基礎(chǔ)[6]。除了胚胎培養(yǎng)液，胚胎游離DNA還來源于囊胚腔液，在Palini等[7]的報道中提出，在收集到的囊胚腔液樣本中約90.0%存在基因組DNA，并采用實時PCR技術(shù)成功擴增到17 號染色體上的多拷貝基因(TBC1D3)和Y 染色體上的多拷貝基因(TSPY1)。另有研究發(fā)現(xiàn)胚胎游離DNA也可以對單基因遺傳病進行檢測，這在α、β地中海貧血中已有報道[8-9]。黃錦等[10]利用NICS方法對囊胚整倍性進行檢測時發(fā)現(xiàn)，當NICS的結(jié)果提示一些重要染色體(13、15、16、18、21、22號染色體)為整倍體時，對應(yīng)囊胚的該條染色體整倍性幾率高，但當NICS結(jié)果提示這些染色體為非整倍體時，對應(yīng)胚胎并不一定為非整倍體，可見，在利用胚胎培養(yǎng)液中游離DNA檢測技術(shù)還具有一定的挑戰(zhàn)。

二、胚胎游離DNA的產(chǎn)生機制還待明確

從胚胎培養(yǎng)液或囊胚腔液中獲得的胚胎游離DNA可用于Ni-PGT，但胚胎游離DNA是如何產(chǎn)生的呢？Huang等[11]證明胚胎游離DNA可能來自胚胎發(fā)育過程中滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm，TE)和內(nèi)細胞團(inner cell mass，ICM)的細胞凋亡，且ICM細胞發(fā)生凋亡的比例大于TE細胞，凋亡的整倍體細胞數(shù)量遠遠超過非整倍體細胞，這也為Ni-PGT的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。然而，Gleicher等[12]認為胚胎游離DNA主要來自TE細胞，且胚胎在發(fā)育過程中存在自我校正，非整倍體胚胎在后期可發(fā)育成整倍體，即無法明確胚胎的最終核型，從而導(dǎo)致假陽性率偏高。對此，Huang等[13]給出了相應(yīng)的解釋，人類的非整倍體胚胎主要來自胚胎早期錯誤的有絲分裂，很少來自減數(shù)分裂，且有絲分裂校正率通常低至0～17.2%，最多為40.0%；另一方面，Huang等在觀察嵌合體小鼠胚胎過程中發(fā)現(xiàn)，ICM中非整倍體細胞凋亡的頻率是TE非整倍體細胞的10倍，由此證明PGT-A的假陽性率高的最可能解釋是嵌合體，而非胚胎的自我糾正。Hammond等[14]發(fā)現(xiàn)，早期胚胎存在自我修復(fù)機制，在囊胚發(fā)育過程中，遺傳物質(zhì)可能通過細胞裂解，凋亡或碎片脫落從TE細胞和ICM細胞中釋放到囊胚腔液和胚胎培養(yǎng)液中。從目前研究來看，胚胎游離DNA主要來自胚胎細胞的正常凋亡，但尚無明確機制說明，還需進一步研究。

三、胚胎游離DNA樣本來源有限

胚胎游離DNA的獲取主要包括胚胎培養(yǎng)液或囊胚腔液。假設(shè)通過胚胎培養(yǎng)液及囊胚腔液相結(jié)合，可增加胚胎游離DNA含量，進而提高游離DNA擴增率，但有研究表明通過釋放囊胚腔液到培養(yǎng)液中并沒有增加胚胎游離DNA的含量，反而因侵入性操作，可能會影響胚胎發(fā)育[15]。Chen等[16]通過對胚胎游離DNA進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)其中可檢測到來自第二極體、精子、顆粒細胞DNA分子，同時，這些DNA分子可能成為樣本污染源，干擾檢測結(jié)果，只有胚胎源性的游離DNA分子才能更好的反應(yīng)胚胎情況。

四、胚胎游離DNA檢測的準確性還需提高

1.胚胎游離DNA樣本污染影響檢測準確性：Xu等[17]報道胚胎游離DNA的污染來源有母源性的顆粒細胞、精子、極體、周圍環(huán)境污染等，其中，顆粒細胞可能是胚胎游離DNA的主要污染源，在胚胎培養(yǎng)過程中通過多次沖洗顆粒細胞來減少母源性污染。有學(xué)者通過使用存在于Y染色體(TSPY1)和17號染色體(TBC1D3)的多拷貝基因驗證胚胎培養(yǎng)液中存在可檢測到的Y染色體并非所有都是代表雄性胚胎，有可能是來自培養(yǎng)液的污染[7]。對于精子來源的污染，可以通過卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)在最大程度上減少污染，ICSI可能更適合用于胚胎染色體篩查，目前，關(guān)于不同受精方式對檢測結(jié)果的影響研究數(shù)據(jù)尚少[18-19]。有研究報道培養(yǎng)液中添加的血清白蛋白，血清替代物有可能會影響胚胎發(fā)育[20]。

2.胚胎游離DNA樣本收集時間對檢測準確性的影響：有關(guān)胚胎游離DNA樣本的最佳收集時間尚未確定，Rubio等[21]報道胚胎游離DNA的量隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，且在第6天胚胎的信息性與一致性較高，胚胎在特定培養(yǎng)條件下的時間越長，特異性越高，對敏感性卻沒有顯著影響[22]。但有研究者認為隨著胚胎培養(yǎng)時間的延長可能不利于胚胎發(fā)育，因存在DNA降解可能，進而影響檢測結(jié)果[23]。未來有望進行大樣本量試驗對此進行驗證，明確最佳樣本收集時間。

3.胚胎培養(yǎng)液滴體積對檢測準確性的影響：研究認為胚胎在體外培養(yǎng)的第4天進行培養(yǎng)液更換處理，使用更小的10 uL培養(yǎng)液滴，而不是較常使用的30 uL，更小的液滴可以得到更大的樣品濃度，在一定程度上可以提高檢測準確性[21]。此外，培養(yǎng)液滴的大小亦會影響囊胚形成率，胚胎在體外培養(yǎng)時，為了促進自身發(fā)育而形成一個自分泌循環(huán)體，較大體積的培養(yǎng)液滴可能稀釋對胚胎發(fā)育有益的自分泌因子；然而在小的培養(yǎng)液滴中，胚胎更有可能暴露于胚胎產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物，并可能導(dǎo)致發(fā)育遲緩或停滯[24]。Minasi等[25]報道隨著培養(yǎng)液滴體積的減小，可以平衡自分泌因子的有益作用以及胚胎毒性物質(zhì)和蒸發(fā)的負面影響，改善了胚胎體外發(fā)育，囊胚形成率也會提高，但最佳培養(yǎng)液滴體積至今未有明確提出，值得進一步探索。

4.胚胎培養(yǎng)液收集方式對檢測準確性的影響：有研究通過對胚胎培養(yǎng)液收集方法進行優(yōu)化并提出，在卵裂期增加一次顆粒細胞的去除，且對胚胎不進行打孔操作，收集D4到D5或D6的胚胎培養(yǎng)液，檢測結(jié)果提示胚胎游離DNA與PGT檢測的胚胎整倍性符合率最高，且污染率最低[26]。由此可見，這不僅可以減少樣本污染，而且操作較簡單。

5.胚胎嵌合體對檢測準確性的影響：嵌合體在人類胚胎發(fā)育過程中很常見，可導(dǎo)致遺傳異常，流產(chǎn)，死產(chǎn)或活產(chǎn)，嵌合體是具有發(fā)育整倍體胚胎的可能性。嵌合體的嵌合閾值設(shè)置不適當，可能會導(dǎo)致假陽性、假陰性結(jié)果。在一項研究中，設(shè)置嵌合閾值為60.0%的情況下，Ni-PGT檢測結(jié)果得到了最低的假陽性率與假陰性率[11]。由于試驗條件及研究標準的不同，有待探討嵌合閾值的最佳范圍。

綜上所述，影響胚胎游離DNA檢測準確性的因素眾多，其中的關(guān)鍵因素在于胚胎游離DNA樣本量及樣本污染問題，為此，減少樣本污染、選用合適的胚胎游離DNA檢測技術(shù)，對提高檢測準確性有重要意義。

五、胚胎游離DNA的檢測技術(shù)仍需優(yōu)選

胚胎游離DNA樣本量制約著檢測技術(shù)的選擇，給擴增及測序技術(shù)帶來極大挑戰(zhàn)，全基因擴增技術(shù)(whole genome amplification,WGA)可有效擴增低分子量DNA，可對單個細胞的整個基因組DNA進行擴增，可明顯提高檢測準確性[27]，目前的WGA主要包括引物延伸預(yù)擴增法(primer extension preamplification，PEP)、簡并寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR)、連接介導(dǎo)PCR(ligation-mediated PCR，LM-PCR)、基于恒溫核酸擴增技術(shù)的多重置換擴增法(multiple displacement amplification，MDA)、基于引物酶的全基因組擴增(primer-based whole genome amplification，p-WGA)、MALBAC，Sure-Plex試劑盒等，目前，后三種技術(shù)應(yīng)用較多，且有各自的優(yōu)點。其中，MALBAC結(jié)合了MDA 法與 PCR方法的特點，應(yīng)用較廣，但假陽性率偏高[28]，目前尚未明確哪一種WGA 技術(shù)最適合NICS。NGS和微陣列比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization，a-CGH)是目前進行胚胎植入前遺傳學(xué)篩查的主要的兩種DNA檢測方法，與a-CGH相比，NGS對于低水平嵌合和三倍體的檢出會更為敏感，且NGS具有快速、成本低等優(yōu)點[29]。

六、小結(jié)

胚胎游離DNA主要來自胚胎發(fā)育過程中的胚胎細胞凋亡。通過檢測胚胎游離DNA進行無創(chuàng)PGT技術(shù)具有無創(chuàng)、簡單、便宜等優(yōu)點，在體外輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域中應(yīng)用前景巨大，但胚胎游離DNA檢測技術(shù)由于樣本量少、樣本獲取困難、樣本污染等問題影響檢測準確性和特異性，并制約其臨床應(yīng)用。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將在改進胚胎游離DNA收集方法、DNA擴增和篩選技術(shù)等方面進行深入研究，以提高胚胎游離DNA檢測準確性和特異性，使胚胎游離DNA可用于常規(guī)IVF患者的胚胎移植，將遺傳篩查窗口提前，可為提高IVF-ET 患者的胚胎種植率和臨床妊娠率提供新思路。