具核梭桿菌感染對(duì)食管癌KYSE150細(xì)胞紫杉醇化療抵抗的影響

張哲源,劉怡文,付 臻,楊海軍,代寧濤,李軍擴(kuò),孫 蔚,郭藝博,孔金玉,周福有

1)安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院;河南科技大學(xué)附屬安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院;河南省食管癌精準(zhǔn)防治醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南安陽(yáng) 455000 2)河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院;河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院;河南省微生態(tài)與食管癌防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;河南省腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南洛陽(yáng) 471003 3)安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院影像科 河南安陽(yáng) 455000 4)安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院病理科 河南安陽(yáng) 455000 5)安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院胸外科 河南安陽(yáng) 455000

食管癌發(fā)病率與死亡率極高,早期臨床癥狀不明顯,確診時(shí)多發(fā)展至中晚期[1]。中晚期食管癌患者最主要的治療方式之一為化療,其中紫杉醇(pachitaxel,PTX)為最常用的化療藥物,但易產(chǎn)生耐藥[2]。因此,探明PTX的耐藥機(jī)制,對(duì)于改進(jìn)食管癌治療方案、改善食管癌患者預(yù)后至關(guān)重要。本團(tuán)隊(duì)前期研究[3-4]已證實(shí)具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)的長(zhǎng)期定植,不僅可重塑腫瘤微環(huán)境,削弱機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng),還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞葡萄糖代謝,為其惡性增殖提供能量。雖然Fn在食管癌中的致病機(jī)制有待進(jìn)一步探討,但本團(tuán)隊(duì)已證實(shí)Fn感染可導(dǎo)致食管癌患者預(yù)后不良[1,5]。研究[6]表明,固有免疫系統(tǒng)在機(jī)體抵抗病原微生物入侵時(shí)發(fā)揮重要作用,而炎癥復(fù)合體為機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分;其中,核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)是炎癥復(fù)合體中最具特征性的多聚體蛋白復(fù)合體[7]。多種病原微生物均可通過(guò)活化NLRP3,誘導(dǎo)促炎因子成熟并分泌到胞外,調(diào)控免疫應(yīng)答,引發(fā)炎癥反應(yīng),為自身長(zhǎng)期定植提供有利條件[8],且NLRP3的活化可使腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)干性增強(qiáng)[9]。有研究[10]顯示,CSCs為腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源,對(duì)各種治療均具有抗性;且乙醛脫氫酶1(acetaldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)已被證實(shí)可作為食管癌優(yōu)選的干細(xì)胞標(biāo)記物。本研究首先建立NLRP3敲降的食管癌細(xì)胞系,用Fn分別感染親本與敲降細(xì)胞系,探討Fn對(duì)食管癌細(xì)胞中NLRP3的調(diào)控機(jī)制;然后通過(guò)PTX干預(yù)裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn),研究Fn感染導(dǎo)致PTX化療抵抗的系統(tǒng)機(jī)制,為食管癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器人食管癌KYSE150細(xì)胞系(上海博谷生物科技有限公司),293T細(xì)胞系(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院),Fn標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 25586,美國(guó)路易斯維爾大學(xué)捐贈(zèng));腦心浸液培養(yǎng)基(法國(guó)梅里埃公司)、體積分?jǐn)?shù)5%無(wú)菌脫纖維綿羊血、體積分?jǐn)?shù)1%氯化血紅素和 1 g/L維生素K1(中國(guó)索萊寶科技有限公司),胎牛血清(美國(guó)Gibco公司),RPMI 1640與DMEM 培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司),NLRP3敲降質(zhì)粒及慢病毒包裝試劑盒(美國(guó)GeneCopeia公司),ALDEFLUORTM試劑盒(加拿大Stemcell technologies公司),SPF級(jí)BALB/C雄性裸鼠[中國(guó)常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2016-0010],熒光素酶檢測(cè)試劑盒(德國(guó)Berthold Technologies公司),CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所),PTX(美國(guó)Selleck Chemicals公司),NLRP3與ALDH1兔抗人單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司),GAPDH兔抗人單克隆抗體、山羊抗兔IgG、BCA蛋白定量試劑盒及ECL發(fā)光顯影液(中國(guó)康為世紀(jì)生物科技有限公司)。凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司),厭氧工作站(美國(guó)COY公司),流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼公司),酶標(biāo)儀及PE小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)(美國(guó)珀金埃爾默公司)。

1.2 NLRP3敲降食管癌細(xì)胞系的構(gòu)建于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)293T 細(xì)胞,待密度為70%時(shí),開(kāi)始轉(zhuǎn)染。采用慢病毒包裝試劑盒,將NLRP3敲降質(zhì)粒(NLRP3-DNA)配制為NLRP3-DNA-EndoFectin混合物,具體步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將混合物加入293T細(xì)胞中,48 h后收取病毒上清,0.45 μm濾器過(guò)濾,去除細(xì)胞碎片。待KYSE150細(xì)胞密度至70%時(shí),加入病毒上清進(jìn)行轉(zhuǎn)染,嘌呤霉素篩選2周。提取細(xì)胞蛋白質(zhì),通過(guò)Western blot檢測(cè)NLRP3敲降效率。將NLRP3敲降后的細(xì)胞命名為KYSE150-N。

1.3 食管癌細(xì)胞的Fn感染于厭氧工作站(37 ℃,體積分?jǐn)?shù)85% N2、10% H2和5% CO2)中常規(guī)培養(yǎng)Fn,培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)5%無(wú)菌脫纖維綿羊血、體積分?jǐn)?shù)1%氯化血紅素和1 g/L維生素K1的腦心浸液培養(yǎng)基。Fn具體培養(yǎng)方法及純度鑒定方法參照本課題組前期研究[5]。待KYSE150及KYSE150-N細(xì)胞密度為70%時(shí),將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Fn菌液加入細(xì)胞培養(yǎng)基(感染復(fù)數(shù)MOI=10),感染不同時(shí)間(12、24、48和72 h)。將Fn感染72 h后的兩種細(xì)胞命名為KYSE150+Fn及KYSE150-N+Fn。

1.4 各組細(xì)胞和瘤體組織中NLRP3及ALDH1蛋白表達(dá)的檢測(cè)提取Fn未感染組和Fn感染組(12、24、48與72 h)KYSE150細(xì)胞蛋白以及KYSE150、KYSE150-N、KYSE150+Fn和KYSE150-N+Fn組細(xì)胞及裸鼠瘤體組織蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。樣本(30 μg總蛋白/泳道)于100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。含50 g/L脫脂牛奶液的TBST室溫封閉1 h,NLRP3、ALDH1(按1∶1 000 TBST稀釋)和GAPDH(按1∶2 000 TBST稀釋)抗體4 ℃孵育過(guò)夜,山羊抗兔IgG(按1∶2 000 TBST稀釋)孵育2 h,用ECL發(fā)光顯影液于凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)目的蛋白條帶,Image Lab軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值為最終蛋白相對(duì)表達(dá)量[11]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 各組細(xì)胞PTXIC50的CCK-8檢測(cè)采用CCK-8試劑盒檢測(cè):①Fn未感染組及Fn感染組(12、24、48和72 h)KYSE150細(xì)胞的PTX 24 h藥物IC50。②KYSE150組、KYSE150-N組、KYSE150+Fn組及KYSE150-N+Fn組細(xì)胞的PTX 24 h藥物IC50。每組細(xì)胞均于96孔板中配制100 μL細(xì)胞懸液(每孔1 000個(gè)細(xì)胞),至培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2)。每組均設(shè)置1個(gè)對(duì)照孔及不同質(zhì)量濃度的實(shí)驗(yàn)孔(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5……30.0 mg/L),按質(zhì)量濃度分別加入PTX,培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL,1 h后更換為新鮮培養(yǎng)基。酶標(biāo)儀測(cè)定OD450 nm,計(jì)算IC50[12]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 各組細(xì)胞體外增殖能力的平板克隆檢測(cè)將KYSE150、KYSE150-N、KYSE150+Fn和KYSE150-N+Fn組細(xì)胞分別接種于6孔板,每孔1 000個(gè)細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)1周。當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)基。經(jīng)PBS沖洗、體積分?jǐn)?shù)4%甲醛固定、結(jié)晶紫染色后,拍照并計(jì)數(shù)克隆數(shù)[13]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 各組細(xì)胞克隆成球能力的成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)將KYSE150、KYSE150-N、KYSE150+Fn和KYSE150-N+Fn組細(xì)胞配制成單細(xì)胞懸液,每組取1×105個(gè)細(xì)胞,于低吸附皿中懸浮培養(yǎng)1周,當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆球時(shí)終止培養(yǎng),對(duì)直徑 40 μm的克隆球進(jìn)行拍照,計(jì)數(shù)[14]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 各組細(xì)胞中的CSCs百分比檢測(cè)將KYSE150、KYSE150-N、KYSE150+Fn和KYSE150-N+Fn組細(xì)胞用ALDEFLUORTM檢測(cè)緩沖液調(diào)整至1×106個(gè)/mL。每組抽取1 mL細(xì)胞懸液放入檢測(cè)管(DEAB-),并于對(duì)照管(DEAB+)加入5 μL二乙氨基苯甲醛(diethylaminobenzaldehyde,DEAB)。于檢測(cè)管的細(xì)胞懸液中加入5 μL ALDEFLUORTM試劑混勻,并抽取0.5 mL混合物加入對(duì)照管。37 ℃孵育30 min后離心棄上清,留取細(xì)胞沉淀。用0.5 mL ALDEFLUORTM檢測(cè)緩沖液重懸細(xì)胞沉淀,并于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。以檢測(cè)管與對(duì)照管中CSCs百分比的差值為最終CSCs百分比[14]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 各組細(xì)胞成瘤能力的裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)選擇24只4～6周齡健康SPF級(jí)雄性BALB/C裸鼠(約20 g)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。于溫度為 (25±2) ℃且濕度為 40%～60%的SPF級(jí)鼠籠飼養(yǎng)。自然晝夜照明。裸鼠自由進(jìn)食、飲水(飼料、飲水均為SPF級(jí))。適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后,隨機(jī)分為4組,每組6只。用熒光素酶標(biāo)記KYSE150、KYSE150-N、KYSE150+Fn和KYSE150-N+Fn細(xì)胞,然后按分組于每只裸鼠右側(cè)腋下接種標(biāo)記后的細(xì)胞(5×106個(gè))。接種2周后,待各組裸鼠腫瘤長(zhǎng)至直徑約5～10 mm,按10 mg/kg的劑量尾靜脈注射PTX,3 d 1次,共給藥6次[12]。末次給藥3 d后,由PE小動(dòng)物活體成像儀拍攝并檢測(cè)腫瘤大小,然后采用深麻醉下頸椎脫臼法處死小鼠,并將瘤體剝離稱重。稱重后將瘤體研磨,一部分提取新鮮組織蛋白,檢測(cè)各組裸鼠瘤體內(nèi)NLRP3及ALDH1蛋白的表達(dá)情況;另一部分配制成單細(xì)胞懸液,檢測(cè)各組裸鼠瘤體內(nèi)CSCs百分比,方法同前。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較KYSE150組細(xì)胞與KYSE150-N組細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)量的差異。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較①Fn未感染組及Fn感染組(12、24、48與72 h)KYSE150細(xì)胞的PTX藥物IC50及NLRP3蛋白表達(dá)量的差異;②KYSE150組、KYSE150-N組、KYSE150+Fn組及KYSE150-N+Fn組細(xì)胞中NLRP3及ALDH1蛋白表達(dá)量、CSCs百分比、體外增殖能力、克隆成球能力、PTX 24 h藥物IC50及裸鼠成瘤能力的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NLRP3敲降的KYSE150細(xì)胞系的建立見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示,與KYSE150細(xì)胞(0.39±0.07)相比,KYSE150-N細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)量(0.14±0.03)降低(t=5.568,P=0.005),提示成功建立NLRP3敲降的KYSE150-N細(xì)胞系。

2.2 Fn感染對(duì)KYSE150細(xì)胞的PTX應(yīng)答效力及NLRP3蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖2、表1。由圖2、表1可知,各Fn感染組細(xì)胞的PTXIC50及NLRP3蛋白表達(dá)量均高于Fn未感染組,且兩指標(biāo)隨Fn感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高(P均<0.05)。

表1 各組細(xì)胞的PTX 24 h IC50及NLRP3蛋白表達(dá)的比較(n=3)

1:Fn未感染組;2:Fn感染12 h 組;3:Fn感染24 h組;4:Fn感染48 h組;5:Fn感染72 h組

2.3 Fn感染及NLRP3敲降對(duì)KYSE150細(xì)胞中NLRP3、ALDH1蛋白表達(dá)及CSCs百分比的影響見(jiàn)圖3和表2。與KYSE150組相比,KYSE150+Fn組細(xì)胞的NLRP3、ALDH1蛋白表達(dá)量及CSCs百分比均增高(P均<0.05);而KYSE150-N組細(xì)胞上述指標(biāo)均降低(P均<0.05)。與KYSE150+Fn組細(xì)胞相比,KYSE150-N+Fn組細(xì)胞上述指標(biāo)均降低(P均<0.05)。

表2 各組細(xì)胞中NLRP3、ALDH1蛋白和CSCs百分比比較(n=3)

1:KYSE150組;2:KYSE150-N組;3:KYSE150+Fn組;4:KYSE150-N+Fn組

2.4 Fn感染及NLRP3敲降對(duì)KYSE150細(xì)胞體外增殖能力、克隆成球能力和PTX應(yīng)答效力的影響見(jiàn)圖4、圖5和表3。與KYSE150組相比,KYSE150+Fn組細(xì)胞的體外增殖能力、克隆成球能力及PTXIC50均增高(P均<0.05);而KYSE150-N組細(xì)胞上述指標(biāo)均降低(P均<0.05)。與KYSE150+Fn組細(xì)胞相比,KYSE150-N+Fn組細(xì)胞上述指標(biāo)均降低(P均<0.05)。

表3 各組細(xì)胞體外增殖能力、克隆成球能力和PTX IC50的比較 (n=3)

A:KYSE150組;B:KYSE150-N組;C:KYSE150+Fn組;D:KYSE150-N+Fn組

A:KYSE150組;B:KYSE150-N組;C:KYSE150+Fn組;D:KYSE150-N+Fn組

2.5 Fn感染及NLRP3敲降對(duì)裸鼠PTX化療敏感性的影響見(jiàn)表4。由表4可知,與KYSE150組相比,KYSE150+Fn組裸鼠成瘤能力增強(qiáng)(P<0.05),而KYSE150-N組裸鼠成瘤能力減弱(P<0.05),提示此組裸鼠瘤體對(duì)PTX化療敏感性增強(qiáng)。與KYSE150+Fn組相比,KYSE150-N+Fn組裸鼠成瘤能力減弱(P<0.05),提示Fn感染并不能增強(qiáng)KYSE150-N+Fn組裸鼠對(duì)PTX化療的抗性。

表4 各組裸鼠腫瘤熒光強(qiáng)度和腫瘤質(zhì)量比較(n=6)

2.6 各組裸鼠瘤體內(nèi)NLRP3、ALDH1蛋白表達(dá)及CSCs百分比的比較結(jié)果見(jiàn)圖6、表5。與KYSE150組相比,KYSE150+Fn組裸鼠瘤體中NLRP3、ALDH1蛋白及CSCs百分比均增加(P均<0.05),而KYSE150-N組裸鼠瘤體中NLRP3、ALDH1蛋白及CSCs百分比減少(P均<0.05);與KYSE150+Fn組相比,KYSE150-N+Fn組裸鼠瘤體中NLRP3、ALDH1蛋白及CSCs百分比減少(P均<0.05)。

表5 各組裸鼠瘤體內(nèi)NLRP3、ALDH1蛋白表達(dá)及CSCs百分比的比較(n=6)

1:KYSE150組;2:KYSE150-N組;3:KYSE150+Fn組;4:KYSE150-N+Fn組

3 討論

化療為中晚期食管癌患者最主要的治療方式之一,其中PTX為最常用的一線化療藥物。PTX可促進(jìn)微管蛋白聚合,使癌細(xì)胞生長(zhǎng)停滯于有絲分裂期,從而有效抑制其惡性增殖;但多數(shù)患者治療后,均會(huì)產(chǎn)生不同程度耐藥,導(dǎo)致后續(xù)治療效果不理想[15]。因此,探明食管癌PTX 耐藥的分子機(jī)制對(duì)改進(jìn)食管癌治療方案、提高臨床療效具有極其重要的意義。

研究表明,口腔條件致病菌Fn可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞化療抵抗,并促進(jìn)其惡性增殖:Fn可通過(guò)激活結(jié)腸癌細(xì)胞中ANO1,導(dǎo)致結(jié)腸癌奧沙利鉑及5-氟尿嘧啶化療抵抗[16];Fn可通過(guò)上調(diào)Wnt5a介導(dǎo)的NFATc3促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞順鉑耐藥[17];Fn還可通過(guò)引發(fā)ESCC細(xì)胞自噬潮降低其對(duì)5-氟尿嘧啶、順鉑及紫杉醇的敏感性[18]。本團(tuán)隊(duì)前期研究[1]已證實(shí),Fn感染陽(yáng)性的食管癌患者術(shù)后生存時(shí)間顯著縮短,且Fn感染可降低食管癌細(xì)胞對(duì)PTX的應(yīng)答效力。本研究發(fā)現(xiàn),隨Fn感染時(shí)間的延長(zhǎng),PTXIC50升高,食管癌細(xì)胞KYSE150對(duì)PTX的應(yīng)答效力逐漸減弱,提示Fn可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞PTX耐藥,但耐藥的具體分子機(jī)制尚不完全明確。

宿主抵抗病原微生物入侵的第一道保護(hù)屏障為機(jī)體的固有免疫系統(tǒng),其主要成分為炎癥復(fù)合體。NLRP3炎癥小體是炎癥復(fù)合體中最具特征性的多聚體蛋白復(fù)合體,可識(shí)別多種病原微生物,活化Caspase-1以介導(dǎo)IL-1β和IL-18等促炎因子釋放到胞外,從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答并引起炎癥反應(yīng)[19]。病原微生物的持續(xù)感染可激活NLRP3炎癥小體,參與多種腫瘤的惡性演進(jìn):牙齦卟啉單胞菌可通過(guò)活化造血NLRP3炎癥小體,招募骨髓細(xì)胞,重塑促炎性腫瘤微環(huán)境,誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[20];EB病毒可介導(dǎo)宿主細(xì)胞中NLRP3蛋白與高遷移率族蛋白B1結(jié)合,維持自身裂解信號(hào),促進(jìn)伯基特淋巴瘤的惡性進(jìn)展[21]。本研究發(fā)現(xiàn),隨Fn感染時(shí)間的延長(zhǎng),食管癌細(xì)胞KYSE150中NLRP3蛋白表達(dá)量逐漸增高,提示Fn可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞中NLRP3高表達(dá),且具有時(shí)間依賴性。

資料顯示,抑制NLRP3炎癥小體的過(guò)度激活可增強(qiáng)多種惡性腫瘤對(duì)化療藥物的應(yīng)答效力:抑制非小細(xì)胞肺癌中NLRP3活性,可重新激活順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[22];阻斷口腔鱗癌中NLRP3信號(hào)通路,可減弱5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的干性富集,增強(qiáng)其治療效果[23]。由于CSCs可無(wú)限增殖、多向分化,且可抵抗常規(guī)放化療,因此被認(rèn)為是腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[24]。CSCs的分選已成為腫瘤治療的關(guān)鍵。研究[10]已證實(shí),ALDH1是食管癌優(yōu)選的CSCs標(biāo)志物,參與基因表達(dá)、組織分化和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等功能。本研究發(fā)現(xiàn),Fn感染可引起KYSE150+Fn組細(xì)胞中ALDH1蛋白及CSCs百分比均顯著增高,提示Fn可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞中ALDH1蛋白高表達(dá),引起CSCs大量富集。為探索NLRP3在Fn致病機(jī)制中發(fā)揮的作用,本研究建立NLRP3敲降的KYSE150-N細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)NLRP3敲降時(shí),KYSE150-N組細(xì)胞中ALDH1蛋白及CSCs百分比均隨之減少。而Fn感染NLRP3敲降的KYSE150-N+Fn組細(xì)胞時(shí),并不能引起ALDH1蛋白及CSCs百分比增高,提示NLRP3為食管癌細(xì)胞中Fn誘導(dǎo)CSCs富集過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。本研究還發(fā)現(xiàn),Fn感染時(shí),KYSE150+Fn組細(xì)胞的體外增殖能力、克隆成球能力及PTXIC50均顯著增高,提示Fn可增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性,并降低其對(duì)PTX的敏感性。NLRP3敲降后,KYSE150-N組上述指標(biāo)均隨之降低,提示食管癌細(xì)胞中NLRP3的激活與干細(xì)胞樣特性的維持密切相關(guān)。而Fn感染NLRP3敲降的KYSE150-N+Fn組細(xì)胞時(shí),并不能引起其上述指標(biāo)增高,提示NLRP3在Fn誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞干細(xì)胞樣特性增強(qiáng)及PTX化療抵抗過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本研究的裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與KYSE150組相比,KYSE150+Fn組裸鼠成瘤能力及瘤體內(nèi)NLRP3、ALDH1蛋白與CSCs百分比均增高,提示Fn可通過(guò)激活NLRP3誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞ALDH1高表達(dá),引起CSCs大量富集,導(dǎo)致PTX治療抵抗;而KYSE150-N組裸鼠上述指標(biāo)均降低,提示NLRP3的敲降可抑制食管癌細(xì)胞ALDH1表達(dá),導(dǎo)致CSCs減少,對(duì)PTX治療的敏感性增強(qiáng)。與KYSE150+Fn組相比,KYSE150-N+Fn組裸鼠成瘤能力及瘤體內(nèi)NLRP3、ALDH1蛋白與CSCs百分比均減少,提示NLRP3的敲降阻斷了Fn引起的PTX化療抵抗,表明NLRP3為食管癌細(xì)胞中Fn感染引起的PTX化療抵抗中的關(guān)鍵調(diào)控因子。

綜上所述,Fn可通過(guò)激活NLRP3誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞ALDH1高表達(dá),引起CSCs大量富集,導(dǎo)致PTX化療抵抗,最終促進(jìn)食管癌細(xì)胞惡性增殖。有效清除Fn并抑制NLRP3的活性可能為食管癌治療提供新策略和治療手段。