配合飼料對翹嘴鱖腸道組織結(jié)構(gòu)及其免疫功能的影響

黃小鵬，姚曉麗，鄭 佳，趙金良

(1.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

對肉食性魚類而言，隨人工配合飼料替代活餌魚或者冰鮮魚的進(jìn)程不斷推進(jìn)，配合飼料對肉食性魚類生長性能與營養(yǎng)價(jià)值等方面的影響受到關(guān)注[1]。由于配合飼料中含有某些肉食性魚類難以充分消化的原料，如淀粉和植物性蛋白等，且與活餌魚的營養(yǎng)成分組成差異較大，可能會(huì)引起魚體生長性能下降，甚至影響魚體機(jī)體健康[2]。有研究表明采食配合飼料影響了肉食性魚類腸道的結(jié)構(gòu)完整性，如人工配合飼料投喂下，龍膽石斑魚(Epinepheluslanceolatus)[3]和大口黑鱸(Micropterussalmoides)[4]生長性能均下降，腸道黏膜厚度、絨毛高度顯著降低；采食膨化飼料后，烏鱧(Ophiocephalusargus)腸道絨毛數(shù)量和長度減少，隱窩深度增加，且隨著碳水化合物含量的增加和飼養(yǎng)周期的延長，中腸的腸絨毛密度和高度逐漸變疏變短[5]。

魚類腸道上皮細(xì)胞分泌的補(bǔ)體和免疫細(xì)胞產(chǎn)生的非特異性免疫因子，如溶菌酶、免疫球蛋白等在機(jī)體防御中發(fā)揮了重要的保護(hù)作用。炎性基因IL-1β、TNF-α、IL-10和IL-4等參與介導(dǎo)和調(diào)控免疫和炎癥過程，引起先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道營養(yǎng)可保護(hù)腸道黏膜和免疫系統(tǒng)，有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性和細(xì)胞因子產(chǎn)生等作用，可減少感染和降低死亡率。食物中的營養(yǎng)成分組成，是影響魚類先天免疫反應(yīng)的主要因素[7，8]，因此，配合飼料替代活餌魚可能會(huì)對肉食性魚類腸道的免疫作用產(chǎn)生一定的影響。

翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)是典型的肉食性魚類，傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式是全程投喂活餌料魚。20世紀(jì)80年代后期以來，翹嘴鱖飼料馴化技術(shù)、飼料營養(yǎng)與配方、飼料養(yǎng)殖研究均取得了一定的進(jìn)展[9-11]。研究表明，配合飼料喂養(yǎng)條件下，雜交鱖(翹嘴鱖×斑鱖)、翹嘴鱖均表現(xiàn)有生長速度減慢[12]，胃黏膜下層和肌層厚度降低，腸絨毛分支減少[13]，腸道蛋白酶活性降低[14]等的現(xiàn)象。翹嘴鱖飼料組腸道消化、小肽吸收與活餌組有明顯差異[13]，腸道微生物多樣性明顯低于活餌組[15]，而SHEN等[16]通過對翹嘴鱖多個(gè)組織器官進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得出，翹嘴鱖通過調(diào)節(jié)自身結(jié)構(gòu)和多種基因表達(dá)水平來適應(yīng)食物的改變。相關(guān)研究表明，配合飼料對翹嘴鱖腸道結(jié)構(gòu)有一定的影響，但未以具體的腸道參數(shù)來描述配合飼料對腸道的影響程度，配合飼料對翹嘴鱖腸道免疫影響的研究也較少，因此，本實(shí)驗(yàn)研究配合飼料對翹嘴鱖腸道組織結(jié)構(gòu)及其免疫功能的影響，以為飼料翹嘴鱖健康養(yǎng)殖發(fā)展提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的翹嘴鱖購自浙江省湖州市南潯菱湖某家庭農(nóng)場，全長(5.16±0.44)cm，實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)于上海海洋大學(xué)濱海基地水泥池。適應(yīng)1周后，將實(shí)驗(yàn)魚分為活餌組(LB)和飼料組(CF)，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾。養(yǎng)殖在體積為0.084 m3的水缸中?；铕D組投喂適口鯪，飼料組按曾萌冬等[13]的方法進(jìn)行慢性馴化。翹嘴鱖專用飼料粉購自浙江益祥生物科技有限公司，投喂前按7∶3的比例取粉狀料和水使用制粒機(jī)混勻并擠壓成條狀。各處理組每天飽食投喂2次，時(shí)間分別為9：00和17：00。共進(jìn)行為期8周的投喂(LB投喂8周活餌魚，CF用飼料馴化2周，后保持投喂6周)?；铕D魚和配合飼料的主要營養(yǎng)組分見表1。

表1 配合飼料和活餌魚的主要營養(yǎng)組分Tab.1 Nutrient components of compound feed and live bait %

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)各個(gè)重復(fù)組的存活數(shù)量，計(jì)算其存活率。隨機(jī)挑取活餌組和飼料組各15尾，用MS-222麻醉液(400 mg/L)進(jìn)行麻醉，測定其全長、體長和體質(zhì)量。并取前腸、中腸和后腸。每組取6尾用Bouin′s固定液固定24 h，再用70%乙醇反復(fù)浸洗至無色，用于制作組織切片；每組取9尾用無酶水清洗腸內(nèi)容物后將腸道組織裝于凍存管，放入液氮速凍，-80 ℃冰箱保存，用于熒光定量PCR和ELISA檢測。

1.2.2 營養(yǎng)成分測定

粗蛋白含量測定采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5-2003)，粗脂肪含量測定采用索式抽提法(GB/T 5009.6-2003)，粗灰分測定采用550 ℃灼燒稱重法(GB/T 5009.4-2003)，水分含量測定采用105 ℃干燥法(GB/T 5009.3-2003)。

1.2.3 腸道組織切片制作

取固定好的前腸、中腸和后腸樣本，經(jīng)80%～100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟3 h，石蠟包埋。使用Leica RM 2016型切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，厚度約為7 μm，經(jīng)HE和AB-PAS染色，然后樹膠封片，置于尼康ECLIPES 80i光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。測量絨毛高度(腸絨毛基部至頂端的垂直距離)和隱窩深度(腸隱窩底部至腸壁固有層的垂直距離)，并計(jì)數(shù)杯狀細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4 免疫酶活性和含量測定

取凍存的前腸、中腸和后腸樣本，用PBS緩沖液(pH7.4)洗凈腸道內(nèi)容物，吸水紙吸干水分。稱量樣本重量，加入9倍量的PBS緩沖液，在冰浴中充分勻漿，勻漿液4 ℃下3 000 r/min離心15 min，取上清液用于測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、溶菌酶(LYS)活性和補(bǔ)體C3、免疫球蛋白IgM含量，酶活和蛋白含量均采用上海酶聯(lián)生物科技有公司的ELISA試劑盒進(jìn)行測定，操作步驟詳見試劑盒說明書。

1.2.5 炎性基因定量表達(dá)分析

參照組織RNA提取試劑盒(TaKaRa)說明提取總RNA，去除基因組DNA雜質(zhì)，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性?；贜CBI數(shù)據(jù)庫獲得的翹嘴鱖IL-1β、TNF-α、IL-10和IL-4基因開放閱讀框序列，以β-actin為管家基因，在NCBI數(shù)據(jù)庫的Primer-BLAST程序中完成引物設(shè)計(jì)，委托上海金唯智生物科技有限公司合成，引物序列見表2。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2x SYBR Green Prc Taq HS Premix，10 μL；cDNA，1 μL；Primer F，0.4 μL；Primer R，0.4 μL；RNase free water，8.2 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃，30 s；95 ℃，8 s，56 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法換算目的基因的相對表達(dá)量。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列Tab.2 Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR amplification

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，并通過t檢驗(yàn)比較配合飼料組與活餌魚組各指標(biāo)間的差異，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 配合飼料對翹嘴鱖生長性能的影響

投喂8周配合飼料后翹嘴鱖生長指標(biāo)如表3所示。翹嘴鱖活餌組的全長、體長、體質(zhì)量和存活率均顯著高于飼料組。

表3 配合飼料投喂8周后翹嘴鱖的生長指標(biāo)Tab.3 Growth indexes of S.chuatsi after being fed with compound feed for eight weeks

2.2 配合飼料對翹嘴鱖腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

翹嘴鱖活餌組和飼料組腸道組織結(jié)構(gòu)如圖1所示?；铕D組前腸結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛長而緊密，且分支較多，幾乎充滿整個(gè)腸腔(圖1-a)；中腸肌層較薄，但絨毛更加密集，且分支更多(圖1-b)；后腸肌層最厚，絨毛細(xì)長且分支較少，絨毛相對稀疏(圖1-c)?；铕D組前、中、后腸紋狀緣光滑平整，黏膜上皮細(xì)胞排列有序，杯狀細(xì)胞分布均勻(圖1-d、e、f)。

飼料組前、中腸腸絨毛均顯著變短，后腸皺襞結(jié)構(gòu)較為完整，絨毛相對較長(圖1-g、h、i)。腸道黏膜中紋狀緣出現(xiàn)缺口，且腸絨毛上皮細(xì)胞排列紊亂，杯狀細(xì)胞數(shù)量劇增(圖1-j、k、l)。

翹嘴鱖活餌組和飼料組腸道形態(tài)學(xué)指標(biāo)如表4所示。飼料組前、中、后腸的腸絨毛長度均顯著短于活餌組，分別降低了57.41%、47.95%和35.13%。飼料組前、中、后腸隱窩深度均顯著高于活餌組，分別上升了33.68%、57.19%、95.18%。飼料組前、中、后腸絨毛高度與隱窩深度比值均顯著低于活餌組，分別降低了68.35%、67.86%和64.67%。飼料組前、中、后腸杯狀細(xì)胞分布密度均顯著大于活餌組，分別增加了62.72%、100.05%和85.10%(圖2)。

表4 翹嘴鱖活餌組和飼料組腸道指標(biāo)比較Tab.4 Comparison of intestinal indexes of S.chuatsi between the live bait group and compound feed group

2.3 配合飼料對翹嘴鱖腸道免疫酶指標(biāo)的影響

翹嘴鱖活餌組和飼料組腸道的免疫指標(biāo)變化如圖3所示。飼料組和活餌組前腸、中腸和后腸的SOD活性均依次升高；CAT活性均在中腸中最低，后腸中最高；LYS活性后腸中最高，中腸中最低；補(bǔ)體C3含量中腸中最高，前腸中最低；lgM含量在飼料組前、中、后腸中接近，但活餌組前腸中最高，中、后腸較低。除前腸補(bǔ)體C3含量外，飼料組前、中、后腸5個(gè)免疫指標(biāo)均低于活餌組，但差異不顯著。

圖3 翹嘴鱖活餌組和飼料組前、中、后腸免疫指標(biāo)比較Fig.3 Comparison of immune indexes in the front，middle and hind gut of S.chuatsi between the live bait group and compound feed group

2.4 飼料對翹嘴鱖腸道炎性基因表達(dá)的影響

翹嘴鱖活餌組和飼料組腸道炎性基因相對表達(dá)量如圖4所示。飼料組中腸IL-1β基因的相對表達(dá)量顯著高于活餌組，前腸、后腸相對表達(dá)量顯著低于活餌組；飼料組前、中、后腸TNF-α基因的相對表達(dá)量均顯著低于活餌組，且前、中腸表現(xiàn)為差異極顯著。飼料組前、中腸IL-10基因的表達(dá)量顯著低于活餌組，后腸的表達(dá)量顯著高于活餌組；飼料組前、中、后腸IL-4基因的相對表達(dá)量顯著低于活餌組。

圖4 翹嘴鱖活餌組和飼料組腸道不同部位免疫相關(guān)基因的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of immune-related genes in different parts of intestine of S.chuatsi in the live bait group and compound feed group*：差異顯著(P<0.05)；**：差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

3.1 飼料對翹嘴鱖腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

腸絨毛是腸黏膜層和黏膜下層向腸腔內(nèi)形成的突起結(jié)構(gòu)，可增加腸道的內(nèi)表面積，提高消化吸收效率[17]；腸道隱窩是由腸黏膜上皮向內(nèi)凹陷到固有層形成的單管狀腺，可向絨毛頂端補(bǔ)充新的細(xì)胞，維持腸絨毛結(jié)構(gòu)和功能的完整性[18]。腸絨毛長度、隱窩深度、絨毛長度與隱窩深度比值均可直接反映出腸道的消化吸收能力[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，翹嘴鱖飼料組腸絨毛長度顯著降低，隱窩深度顯著升高，腸絨毛長度與隱窩深度的比值顯著降低，這表明攝食配合飼料后，翹嘴鱖腸道組織的完整性受到影響，可能引起腸道消化吸收功能下降。該結(jié)果與孫龍芳等[15]對鱖腸道的研究結(jié)果一致，在烏鱧[19]和大口黑鱸[4，20]研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。配合飼料會(huì)影響肉食性魚類的腸道組織結(jié)構(gòu)，這可能與配合飼料中含有植物蛋白質(zhì)或其它營養(yǎng)、非營養(yǎng)成分，以及抗?fàn)I養(yǎng)因子有關(guān)[21]。由于配合飼料與活餌間營養(yǎng)成分和性質(zhì)的差異復(fù)雜，具體影響機(jī)制尚不清楚。

杯狀細(xì)胞是一種黏液細(xì)胞，可分泌具有抵抗病原微生物入侵作用的黏蛋白，以保護(hù)上皮免受食物中有害生物或有害化合物的侵害[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，翹嘴鱖飼料組腸道各部位的杯狀細(xì)胞數(shù)目顯著增加。翹嘴鱖飼料組腸道杯狀細(xì)胞增生，可能是因?yàn)轱暳蠐p傷了腸絨毛結(jié)構(gòu)，腸道通過增加杯狀細(xì)胞的數(shù)量來增加黏蛋白的合成，從而保護(hù)腸道免受有害物質(zhì)的侵害[23]。投喂配合飼料也會(huì)使大口黑鱸腸道杯狀細(xì)胞數(shù)目增多[2]。

本研究結(jié)果顯示，投喂配合飼料后，翹嘴鱖前、中腸黏膜受到的影響相對較大，腸絨毛長度明顯縮短，內(nèi)部細(xì)胞排列紊亂，這可能是因?yàn)轱暳下氏冗M(jìn)入前、中腸，對其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響較為直接，而對后腸的影響則相對較輕。

3.2 飼料對翹嘴鱖腸道免疫酶指標(biāo)的影響

由腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生的補(bǔ)體、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的溶菌酶和漿細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白等共同組成機(jī)體腸道的免疫系統(tǒng)，與抗氧化系統(tǒng)共同抵御外界病原微生物的入侵[31]。本研究中，翹嘴鱖飼料組腸道LYS活性、C3、lgM含量均低于活餌組，但差異不顯著，這表明配合飼料對翹嘴鱖腸道免疫功能產(chǎn)生了一定的影響。在其它魚類研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，如配合飼料降低了珍珠龍膽石斑魚腸道中LYS和C3水平和血清C4和IgM水平[32]。配合飼料降低鱖腸道免疫因子的水平，可能是由于配合飼料損傷了腸道組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸絨毛變短，腸上皮細(xì)胞數(shù)量和黏膜層中淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，從而引起這些免疫指標(biāo)的下降。

3.3 飼料對翹嘴鱖腸道炎性基因表達(dá)的影響

IL-1β和TNF-α是機(jī)體在病原體入侵時(shí)，由激活的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及其它免疫細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，它們參與了調(diào)控免疫細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程[33，34]。IL-10是一種具有多種功能的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，能有效防止腸道黏膜屏障的破壞和腸道炎癥的發(fā)展[35]。IL-4與IL-10功能相互協(xié)同，平衡病原體的免疫反應(yīng)和抑制炎癥[36]。本研究結(jié)果顯示，除個(gè)別炎性基因外，翹嘴鱖飼料組前腸、中腸和后腸的4個(gè)炎性基因相對表達(dá)量均顯著低于活餌組，表明腸道免疫和抑制炎癥的能力下降。分析原因可能是，飼料組腸絨毛結(jié)構(gòu)受損，淋巴細(xì)胞的數(shù)量相對減少，從而引起腸道炎性基因的表達(dá)量顯著降低。飼料組中腸抗炎基因IL-10和IL-4相對表達(dá)量的降低，加上促炎基因IL-1β的過量表達(dá)，表明飼料組中腸可能存在輕微炎癥，這與LIU等[37]研究結(jié)果一致，低棉酚棉籽粕替代魚粉會(huì)提高IL-1β基因和降低IL-10、IL-4基因的相對表達(dá)量，引發(fā)腸道炎癥。同時(shí)，飼料組中腸杯狀細(xì)胞最多，固有層有炎癥細(xì)胞浸潤，也可作為飼料組中腸發(fā)生輕微炎癥的證據(jù)。IL-4可增強(qiáng)頭腎細(xì)胞的吞噬活性，同時(shí)增加ROS產(chǎn)生和溶菌酶活性水平[38]，因此，飼料組腸道IL-4基因相對表達(dá)量的降低，可能是引起抗氧化酶和溶菌酶活性下降的重要原因。

4 結(jié)論

翹嘴鱖攝食配合飼料會(huì)對其腸道組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，突出表現(xiàn)在腸絨毛長度縮短、隱窩深度增加、杯狀細(xì)胞分布密度增加。由此，引起了腸道組織抗氧化能力下降、非特異性免疫指標(biāo)下降和炎性基因表達(dá)水平的下調(diào)，對腸道健康產(chǎn)生了不利影響。