泡桐葉化學(xué)成分、藥理作用研究進(jìn)展及其質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

陸玉婷，李濟(jì)順，卓 燊，李 娟，楊 濤，韓湘云，李順祥*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)部，柳州市桂中特色藥用資源開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545005；3.湘西宏成制藥有限公司，湖南 吉首 416000）

泡桐葉為玄參科泡桐屬植物白花泡桐Paulowniafortunei（Seem.） Hemsl.和毛泡桐P．tomentosa（Thunb.） Steud.的葉［1］。泡桐作為一種生長(zhǎng)快速的木本植物，其樹(shù)皮、根、葉、花、果均可入藥，可用于治療咳嗽，痰癰，上呼吸道感染，支氣管肺炎，細(xì)菌性痢疾，腸炎等多種病證［2］，其以“清熱解毒，止血消腫” 之功在民間被廣泛使用［3］，但在臨床報(bào)道最多的是以白花泡桐葉為君藥的復(fù)方桐葉燒傷油。該藥原為湘西土家族姚氏研制的秘方藥“清潤(rùn)燒傷油”，后被開(kāi)發(fā)為國(guó)家中藥三類新藥 （國(guó)藥準(zhǔn)字Z20063825），對(duì)于潰瘍創(chuàng)面修復(fù)、燒燙傷效果較好［4-5］。目前，泡桐葉大多被用作廉價(jià)飼料［6］，造成高附加值資源的浪費(fèi)，嚴(yán)重阻礙了其在醫(yī)療行業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。隨著泡桐作為觀賞性植物資源需求量增加，栽培品和雜交品的種類也日益豐富［7］，在一定程度上加大了藥品市場(chǎng)的質(zhì)控難度。

泡桐葉作為土家族特色藥，收載于2009 年版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，其質(zhì)量控制僅以熊果酸這一單一成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)［3］，不具有專一性［8-9］，中藥質(zhì)量標(biāo)志物 （Qmarker）［10］可部分解決這一問(wèn)題。本文對(duì)泡桐葉植物親緣歸屬、化學(xué)成分、藥物功效進(jìn)行全面的綜述分析，結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)泡桐葉的質(zhì)量標(biāo)志物（Q-maker） 進(jìn)行預(yù)測(cè)，旨在建立更合理的泡桐葉質(zhì)量控制方法，為進(jìn)一步明確泡桐葉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，促進(jìn)中藥行業(yè)泡桐葉資源的應(yīng)用提供理論參考。

1 親緣關(guān)系及化學(xué)成分

1.1 泡桐屬植物的親緣歸屬

1.1.1 泡桐屬植物分布情況 泡桐在我國(guó)分布廣泛，部分品種也因具有觀賞和用材價(jià)值在如日本、韓國(guó)、東南亞、歐洲、澳洲等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)引種栽培［11］。《中國(guó)植物志》［12］收錄了Ⅰ～Ⅶ號(hào)公認(rèn)的7 個(gè)原始種和2 個(gè)毛泡桐變種。其中，部分文獻(xiàn)中提到了一種未經(jīng)承認(rèn)的泡桐PaulowniacoreanaUyeki［13］，該物種于1925 年載入韓國(guó)的植物書(shū)籍中［14］，但是后經(jīng)證實(shí)發(fā)現(xiàn)該物種應(yīng)歸屬于毛泡桐P．tormentosa（Thunb.） Steud［15］。泡桐屬植物的具體歸屬和分布情況見(jiàn)表1。

表1 泡桐屬植物的具體歸屬和分布情況

1.1.2 泡桐屬葉綠體基因組聚類分析樹(shù) 從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／） 下載7 個(gè)泡桐屬原始種的完整葉綠體基因組序列，以同名異物的外類群油桐Verniciafordii序列作比對(duì)，通過(guò)鄰接法（NJ） 進(jìn)行序列分析，以Bootstrap （500 次重復(fù)） 檢驗(yàn)各分支的自展支持率，采用Mega 11.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并可視化，結(jié)果見(jiàn)圖1。Bootstrap 支持率均在98%以上，且泡桐屬聚為一個(gè)單系群，與外類群油桐有明顯區(qū)分，分析結(jié)果較理想。泡桐屬內(nèi)主要分成了A、B 兩個(gè)主要分支，白花泡桐、毛泡桐、臺(tái)灣泡桐、楸木泡桐為A 支獨(dú)立進(jìn)化；川泡桐、蘭考泡桐和南方泡桐為B 支獨(dú)立進(jìn)化，說(shuō)明這2 個(gè)分支表現(xiàn)出良好的單系性。其中，白花泡桐與毛泡桐聚為A 分支下的1 個(gè)小分支，表明兩者遺傳距離較近，與文獻(xiàn)［1］ 報(bào)道相符，可作為泡桐葉的來(lái)源。

圖1 泡桐屬聚類分析樹(shù)

1.2 化學(xué)成分 目前從泡桐葉中分離得到65 種成分，其中三萜類13 種、黃酮類6 種、苯丙素類5 種、甾醇類2 種、萜類2 種、脂肪酸6 種、甘油酯類31 種。

1.2.1 三萜類 目前，三萜類化合物熊果酸（1）、齊墩果酸（2） 作為泡桐葉的重要成分，在多種泡桐葉中均有報(bào)道［8，16-19］。張德莉等［16］從白花泡桐葉中分離得到10 個(gè)三萜類化合物（3～12），同時(shí)從毛泡桐葉［17］的乙酸乙酯部位葉也分離得到了4 個(gè)化合物（3～5、11）。楊軍仁等［18］在光泡桐葉中也發(fā)現(xiàn)了山楂酸（11）。郭洪偉等［20］對(duì)復(fù)方桐葉燒傷油的脂溶性成分分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)白花泡桐葉中還含有1 個(gè)開(kāi)鏈型三萜類化合物——角鯊烯（13）。詳見(jiàn)表2、圖2。

圖2 泡桐葉中三萜類化合物結(jié)構(gòu)

表2 泡桐葉中三萜類化合物

1.2.2 黃酮類 木犀草素（14）、芹菜素（15） 作為泡桐葉中重要的黃酮類成分，在白花泡桐和毛泡桐中均有報(bào)道［17-18，21］。李曉強(qiáng)等［21］從白花泡桐葉的乙酸乙酯部位分離得到1 個(gè)香葉基黃酮化合物——mimulone （16）。梁峰濤［22］從白花泡桐葉的石油醚部位分離得2 個(gè)香葉基黃酮化合物——diplacone （17）、3'-O-methyldiplacone （18）。張德莉等［17］在毛泡桐葉的乙酸乙酯部位分離得到1 個(gè)二氫黃酮化合物——高圣草酚（19）。詳見(jiàn)表3、圖3。

圖3 泡桐葉中黃酮類化合物結(jié)構(gòu)

表3 泡桐葉中黃酮類化合物

1.2.3 苯丙素類 Kim 等［23］從毛泡桐葉水溶性成分中分離得到了4 個(gè)苯乙醇苷類化合物（20～23）。Móricz 等［24］通過(guò)研究毛泡桐葉中的酚類物質(zhì)活性，發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)苯丙酸類化合物（24）。詳見(jiàn)表4、圖4。

圖4 泡桐葉中苯丙素類、甾醇類化合物結(jié)構(gòu)

表4 泡桐葉中苯丙素類化合物

1.2.4 其他類 甾醇類化合物β-谷甾醇（25）、胡蘿卜苷（26） 普遍存在于泡桐葉中［17-18，22］。Jung 等［25］從毛泡桐中分離出1 個(gè)倍半萜內(nèi)酯類化合物——isoatriplicolide tiglate（27）。Rodríguez-López 等［26］從毛泡桐中發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)具有強(qiáng)抗氧化性的環(huán)烯醚萜苷類化合物——桃葉珊瑚苷（28）。Adriani 等［27］從毛泡桐中分離得到1 個(gè)泡桐屬特征成分——泡桐苷（29）。黃洛華等［28］從白花泡桐葉中分離得到了6個(gè)脂肪酸類化合物（30～35）。梁峰濤［22］在白花泡桐葉的石油醚部位發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)新的甘油酯類化合物（36）。Asai等［29］在毛泡桐葉的腺毛分泌物中分離得到30 個(gè)甘油酯類化合物（40～69）。近年研究發(fā)現(xiàn)，植物中的甘油酯類有促進(jìn)細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)的作用［30］，這類成分應(yīng)獲得更多的關(guān)注。詳見(jiàn)表5、圖5。此外，泡桐葉還具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不僅富含多種人體所需的氨基酸［31］，還包含Ca、K、P、Mn、Fe 等多種微量元素［32］，其中白花泡桐葉的Ca 含量高達(dá)19 518.01 mg／kg。

圖5 泡桐葉中其他化合物結(jié)構(gòu)

表5 泡桐葉中其他化合物

2 藥理作用

2.1 傳統(tǒng)功效 據(jù)典籍記載，泡桐葉“主惡蝕瘡著陰”，可“消腫毒，生發(fā)”［33］。追溯和調(diào)研泡桐葉的民間藥用歷史和傳統(tǒng)功效以“抗?jié)儭?“消腫毒” 為主，多為外用，見(jiàn)表6。

表6 泡桐葉的傳統(tǒng)藥用

2.2 現(xiàn)代藥理活性 現(xiàn)代藥理研究表明，泡桐葉具有抗?jié)?、抗菌、抗炎、抗氧化、?xì)胞保護(hù)、抗病毒、抗腫瘤等作用。經(jīng)過(guò)多年的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，已明確泡桐葉中所含的熊果酸［45］、齊墩果酸［46］、木犀草素［47］、芹菜素［48］這4 種成分確實(shí)具有上述功效。此外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，泡桐葉中的香葉基黃酮和倍半萜類成分也表現(xiàn)出良好的療效。

2.2.1 抗?jié)?泡桐葉在修復(fù)潰瘍創(chuàng)面具有良好的效果。復(fù)方桐葉燒傷油［49］不僅能抑制皮膚潰瘍大鼠的肉芽增生，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，還能降低各項(xiàng)炎癥因子水平。Zahran 等［50］發(fā)現(xiàn)不同劑量熊果酸在吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠潰瘍中在組織病理學(xué)評(píng)價(jià)上展現(xiàn)出劑量依賴性地保護(hù)作用。Kang 等［51］研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸能通過(guò)恢復(fù)Th17／Treg 細(xì)胞的平衡并抑制NF-κB 信號(hào)通路來(lái)改善DSS 誘發(fā)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎。Li等［52-53］研究證實(shí)，木犀草素可通過(guò)調(diào)節(jié)SHP-1／STAT3 通路和腸道菌群，緩解大鼠潰瘍性結(jié)腸炎，同時(shí)降低炎癥因子水平。Chen 等［54］在使用木犀草素口服治療糖尿病大鼠皮膚損傷時(shí)，發(fā)現(xiàn)其不僅能夠降低血糖，還能加快受損皮膚愈合。Molina 等［55］發(fā)現(xiàn)，芹菜素能促進(jìn)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的敘利亞雄性倉(cāng)鼠口腔潰瘍愈合。

2.2.2 抗菌 泡桐葉中黃酮類、酚類化合物具有良好的抗菌效果。Móricz 等［24］發(fā)現(xiàn)，脫脂毛泡桐鮮葉中的酚類組分芹菜素、對(duì)羥基肉桂酸能夠抑制費(fèi)氏弧菌和枯草芽孢桿菌的活性。Dugan 等［56］發(fā)現(xiàn)，泡桐葉提取物的抗菌活性與其酚類物質(zhì)含量也呈正相關(guān)，其抗菌機(jī)制可能與其調(diào)控膜依賴性細(xì)胞過(guò)程的能力有關(guān)。Navrátilová 等［57］發(fā)現(xiàn)，毛泡桐中的diplacone、mimulone 具有良好的抗菌活性，3'-Omethyldiplacone 具有良好的抗利什曼原蟲(chóng)作用，且mimulone還能與苯唑西林協(xié)同抗菌［58］。臧愛(ài)梅［59］對(duì)毛泡桐葉提取物抑菌活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其醇提物和丙酮提取物對(duì)白菜軟腐病菌、獼猴桃潰瘍病菌、水稻白葉枯病菌、金葡萄球菌等具有抑制效果。

2.2.3 抗炎 泡桐葉中所含的黃酮類化合物在體內(nèi)、外均有良好的抗炎效果。Ryu 等［60］研究表明，毛泡桐中的diplacone、3'-O-methyldiplacone 具有較強(qiáng)的抗炎活性和抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶作用，可被開(kāi)發(fā)為一些炎癥相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病的先導(dǎo)化合物。毛泡桐中的diplacone［61］能通過(guò)阻斷IκB 的降解來(lái)減少促炎因子TNF-α、MCP-1 水平，并對(duì)COX／LOX 產(chǎn)生雙重抑制作用，具有抗COX-2 活性［62］。Jin等［63］也發(fā)現(xiàn)，泡桐中的diplacone 對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生NO 有抑制作用，其IC50值為5.02 μmol／L。

2.2.4 抗氧化 泡桐葉提取物的抗氧化活性與葉片中黃酮類及酚類化合物的含量呈高度正相關(guān)［56］。Moon 等［64］發(fā)現(xiàn)，diplacone 不僅能有效清除自由基和抑制輻射誘導(dǎo)的DNA 鏈斷裂，還能降低2Gy-照射的AHH-1 細(xì)胞的活性氧水平和細(xì)胞DNA 損傷。Hawry? 等［65］采用DPPH-TLC 法分析泡桐葉的甲醇提取物抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，澳大利亞的一種白花泡桐與毛泡桐的雜交葉中酚類化合物含量和抗氧化活性較高。Zima 等［66］發(fā)現(xiàn)，在多種毛泡桐的黃酮類化合物中，diplacone 表現(xiàn)出最強(qiáng)的自由基清除能力和酪氨酸硝化反應(yīng)抑制作用。李傳厚［67］考察了毛泡桐中的5 種黃酮類化合物的清除DPPH 自由基能力，依次為結(jié)果木犀草素、diplacone、芹菜素。高天陽(yáng)［68］發(fā)現(xiàn)，木犀草素、diplacone清除DPPH 自由基能力強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸，芹菜素、高圣草酚的DPPH 自由基清除能力相對(duì)較弱。

2.2.5 細(xì)胞保護(hù) 泡桐葉中的倍半萜類、香葉基黃酮類化合物表現(xiàn)出良好的細(xì)胞保護(hù)作用。Wang 等［69］研究表明，泡桐中的diplacone 在低濃度下對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有增殖活性，但在高濃度下卻存在抑制作用，推測(cè)可能與未修飾的香葉基側(cè)鏈有關(guān)。Zima 等［66］發(fā)現(xiàn)，毛泡桐中的diplacone、mimulone 對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的小鼠糖尿病細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用。

2.2.6 抗病毒 泡桐葉中所含的幾種黃酮類化合物可以在病毒感染的不同階段發(fā)揮作用，特別是在分子水平上抑制病毒生長(zhǎng)。Cho 等［70］研究證實(shí)，毛泡桐中的 3'-Omethyldiplacone、diplacone、mimulone 這3 種黃酮對(duì)SARSCOV 木瓜蛋白酶樣蛋白酶具有抑制作用，IC50值在10.4～14.4 μmol／L 之間，而這類蛋白酶在SARS 病毒復(fù)制中起關(guān)鍵作用。

2.2.7 抗腫瘤 泡桐葉中所含的倍半萜類和黃酮類化合物均有良好的抑制腫瘤細(xì)胞作用。Jung 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，毛泡桐中的isoatriplicolide tiglate 低濃度可誘導(dǎo)S／G2期細(xì)胞周期阻滯，高濃度可誘導(dǎo)caspase 依賴性地凋亡，對(duì)乳腺癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞具有時(shí)間和劑量依賴性的抗增殖作用。Molanová等［71］考察了毛泡桐中的香葉基黃酮對(duì)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1 的抗增殖作用和細(xì)胞毒性活性，發(fā)現(xiàn)diplacone 具有最強(qiáng)的抗增殖和細(xì)胞毒作用，同時(shí)伴隨引起代謝活性的濃度依賴性降低。高天陽(yáng)［68］對(duì)毛泡桐中的黃酮類化合物進(jìn)行細(xì)胞毒活性篩選，發(fā)現(xiàn)diplacone 對(duì)人肺癌細(xì)胞A549 的抑制作用最強(qiáng)。

2.2.8 其他 劉麗沙等［72］在研究外用涂抹類制劑鎮(zhèn)痛作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)復(fù)方桐葉燒傷油能明顯抑制小鼠扭體反應(yīng)，提高小鼠的熱板痛閾值。Cho 等［73］研究發(fā)現(xiàn)，毛泡桐中的3'-O-methyldiplacone、diplacone、mimulone 能同時(shí)抑制AChE和BChE，從而達(dá)到改善阿爾茨海默氏癥的效果。Song等［74］發(fā)現(xiàn)，毛泡桐中的3'-O-methyldiplacone、mimulone 對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP1B） 和α-葡萄糖苷酶均有較強(qiáng)的抑制活性，這2 種酶是治療肥胖和糖尿病的重要靶點(diǎn)。Al-Sagheer 等［31］用毛泡桐葉制成飼料喂養(yǎng)家兔，可達(dá)到調(diào)節(jié)血脂和降低腸道致病菌群的種類和總數(shù)的效果。

3 基于化學(xué)成分和功效的Q-marker 預(yù)測(cè)分析

3.1 基于親緣結(jié)合化學(xué)成分的可測(cè)性的Q-marker 篩選 質(zhì)量控制的根本目的是控制中藥的有效性，因此質(zhì)量標(biāo)志物的確定必須與有效性和可測(cè)性密切相關(guān)。首先，根據(jù)泡桐屬的親緣分析可知，白花泡桐葉、毛泡桐葉遺傳距離較近，兩者共同含有的成分更適合作為Q-marker 的篩選來(lái)源。其次，根據(jù)質(zhì)量標(biāo)志物的定義和要求，Q-maker 預(yù)測(cè)應(yīng)考慮化學(xué)成分的可測(cè)性和有效性。泡桐苷和香葉基黃酮雖然是泡桐的特征性成分，但是目前泡桐苷的活性未被證實(shí)，而香葉基黃酮?jiǎng)t存在著分布不均、檢測(cè)方法不確定性等問(wèn)題，所以暫不適合作為Q-Marker 的篩選對(duì)象。從泡桐葉中含有三萜類、黃酮類、苯丙素類等成分中，已報(bào)道的可測(cè)性成分有熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、木犀草素、芹菜素等。邢雅麗等［75］運(yùn)用HPLC 法分別對(duì)泡桐葉中的齊墩果酸、熊果酸含量進(jìn)行考察，測(cè)得白花泡桐葉的齊墩果酸、熊果酸含量3.50、12.51 mg／g，毛泡桐的齊墩果酸、熊果酸含量2.29、7.93 mg／g。另外，李科等［76］通過(guò)HPLC 法考察不同產(chǎn)地的木犀草素含量可達(dá)25.5 μg／g。故將三萜類和黃酮類化合物作為泡桐葉質(zhì)量標(biāo)志物的篩選對(duì)象較合理。

3.2 基于藥性和藥效的Q-marker 篩選 “四氣五味” 是中藥的基本屬性，也是中藥的藥性理論核心。泡桐葉苦、寒，歸心、肝經(jīng)［1］?？辔吨兴幹饕獊?lái)源于黃酮類、生物堿類、萜類及三萜類化合物［77］，而寒性中藥里出現(xiàn)頻率最高的為黃酮類化合物［78］，其次是萜類和揮發(fā)油類、甾類、脂肪酸類等化合物。推測(cè)黃酮類、三萜類和萜類成分可能為泡桐葉“苦寒” 的來(lái)源。

根據(jù)傳統(tǒng)功效和現(xiàn)代藥理學(xué)活性研究發(fā)現(xiàn)，泡桐葉中的三萜類、黃酮類成分不僅能表現(xiàn)出良好的抗?jié)児π?，還具有抗菌、抗炎、抗氧化、細(xì)胞保護(hù)、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理活性，推測(cè)這些成分可能是泡桐葉在體內(nèi)發(fā)揮藥效主要的物質(zhì)基礎(chǔ)，即提示三萜類及黃酮類成分可作為Q-marker 的篩選來(lái)源。

4 基于生物信息學(xué)的Q-marker 預(yù)測(cè)分析

4.1 泡桐葉的潛在活性靶點(diǎn)篩選 基于泡桐葉的化學(xué)成分和藥效分析，將其成分輸入TCMSP 平臺(tái) （http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php），以平臺(tái)建議的藥物篩選條件（OB ≥20%、DL ≥0.1） 進(jìn)行篩選；再以ETCM 平臺(tái)（http：／／www.tcmip.cn／ETCM／） 作為補(bǔ)充，條件為類藥性≥0.05，然后將2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出來(lái)的化合物取并集得到候選靶標(biāo)的活性成分。再結(jié)合文獻(xiàn)分析，熊果酸為泡桐葉地方標(biāo)準(zhǔn)［3］的質(zhì)控指標(biāo)，在泡桐葉中含量較高［75］，且具有良好的生物活性［45］，故亦將熊果酸納入活性成分候選庫(kù)。最終篩選得到2 個(gè)三萜類、2 個(gè)黃酮類、1 個(gè)苯丙素類，1 個(gè)甾醇類、4 個(gè)脂肪酸類化合物，詳見(jiàn)表7。將上述化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)輸入U(xiǎn)niprot （http：／／www.uniprot.org／），以“Human Reviewed” 為限制條件獲取靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因Symbol，最終得到174 個(gè)靶點(diǎn)蛋白。

表7 泡桐葉候選靶標(biāo)的活性成分

4.2 基于生物信息學(xué)與傳統(tǒng)功效的Q-marker 預(yù)測(cè)

4.2.1 泡桐葉活性成分與潰瘍性疾病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)泡桐葉的傳統(tǒng)藥效研究，以 “ulcer” 為關(guān)鍵詞檢索GeneCards、OMIM、TTD、PharmGkb、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取潰瘍性疾病的相關(guān)基因，將所查到的所有相關(guān)基因合并去除重復(fù)值后獲得相關(guān)靶點(diǎn)2 084 個(gè)，見(jiàn)圖6，篩選出藥物成分與潰瘍性疾病的交集靶點(diǎn)105 個(gè)，見(jiàn)圖7。通過(guò)Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建藥物成分與潰瘍性疾病的網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖8。以成分、靶點(diǎn)、疾病的連接情況為參考，熊果酸、木犀草素和芹菜素的交聯(lián)度最高，油酸的交聯(lián)度次之。結(jié)果顯示三萜類化合物熊果酸和黃酮類化合物木犀草素、芹菜素可能是泡桐葉在體內(nèi)發(fā)揮潰瘍修復(fù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，該預(yù)測(cè)結(jié)果與泡桐葉的傳統(tǒng)功效研究基本吻合，提示熊果酸、木犀草素和芹菜素可作為Q-marker 的來(lái)源。

圖6 潰瘍性疾病的相關(guān)基因收集圖

圖7 “藥物成分-疾病” 交集基因

圖8 “藥物成分-傳統(tǒng)功效” 網(wǎng)絡(luò)

4.2.2 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò) 將105 個(gè)交集基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫(kù)以“Homosapiens” 為條件獲取蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，將置信度得分設(shè)置為0.400，考察“藥物-靶點(diǎn)-疾病” 之間所存在的蛋白互作關(guān)系，見(jiàn)圖9A。PPI 網(wǎng)絡(luò)共包含104 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 610條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為31，平均局部聚類系數(shù)為0.739。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行集中性分析和打分，篩選出所有條件都大于中位值的基因，即篩選核心靶點(diǎn)。經(jīng)過(guò)2 次篩選構(gòu)建子網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖9B，得到20 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為 VEGFA、HIF1A、CASP3、CCND1、MMP2、FOS、NFKBIA、BCL2L1、AKT1、MMP9、PPARG、JUN、EGFR、ERBB2、TP53、PTGS2、ICAM1、STAT3、IL1B、MYC。結(jié)果顯示這些關(guān)鍵靶點(diǎn)可能在泡桐葉改善潰瘍性疾病方面具有重要意義。

圖9 泡桐葉活性成分與潰瘍的交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)（A） 和核心靶點(diǎn)的子網(wǎng)絡(luò)（B）

4.2.3 GO、KEGG 富集分析 通過(guò)R 軟件包“org.Hs.eg.db” 將核心靶點(diǎn)symbol 轉(zhuǎn)化為entrez ID。再使用R 語(yǔ)言對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，將富集顯著性排名靠前的結(jié)果導(dǎo)入Chiplot （https：／／www.chiplot.online／）在線編輯可視化（P＜0.05）。圖10A 為GO 注釋的結(jié)果，包含分子功能 （molecular function，MF）、生物過(guò)程（biological process，BP） 和細(xì)胞組分（cell component，CC）中富集顯著性排名前八的條目，橫坐標(biāo)表示該類別下富集泡桐葉修復(fù)潰瘍潛在靶點(diǎn)的數(shù)量。在生物過(guò)程方面，泡桐葉主要涉及輻射反應(yīng)、光刺激反應(yīng)、紫外線反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)非生物刺激的反應(yīng)等過(guò)程；細(xì)胞組成方面主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、核膜、膜筏等；分子功能方面主要涉及與DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、RNA 聚合酶II-特異性DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、蛋白磷酸酶和磷酸酶等分子的結(jié)合。圖10B 顯示了富集排名前二十的KEGG 信號(hào)通路，如癌癥通路、MAPK 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路等。圖10C展示的是富集靶點(diǎn)最多的癌癥通路（18 個(gè)），可見(jiàn)泡桐葉的作用靶點(diǎn)主要富集在抗細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)新生血管形成的通路上，這些信號(hào)通路可能與其能修復(fù)潰瘍密切相關(guān)。

圖10 泡桐葉修復(fù)潰瘍的GO （A） 和KEGG （B） 富集分析以及主要作用通路（C）

4.3 基于生物信息學(xué)與現(xiàn)代藥理學(xué)活性的Q-marker 預(yù)測(cè) 根據(jù)泡桐葉的現(xiàn)代藥理學(xué)活性研究，以 “antibacterial”“anti-inflammatory” “antioxidant” “antiviral” “anti-tumor”“cytoprotection” 為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找相關(guān)基因，以“Score≥1” 篩選出成分與靶點(diǎn)的交集基因，見(jiàn)圖11。運(yùn)用Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建藥物成分與現(xiàn)代藥理學(xué)活性靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)，獲取degree 值導(dǎo)入Chiplot 制作熱圖并進(jìn)行聚類分析，見(jiàn)圖12。由此可知，泡桐葉中參與抗菌的潛在靶點(diǎn)較少，而抗炎、抗氧化、抗病毒的潛在靶點(diǎn)較多。以成分與作用靶點(diǎn)的交聯(lián)度為參考，熊果酸、木犀草素和芹菜素因交聯(lián)度較高聚成一類。結(jié)果顯示熊果酸、木犀草素、芹菜素可能是泡桐葉發(fā)揮藥效的主要活性物質(zhì)，推測(cè)這些成分可能是泡桐葉在體內(nèi)產(chǎn)生抗炎、抗病毒、抗氧化、細(xì)胞保護(hù)、抗腫瘤等作用的潛在靶點(diǎn)。該預(yù)測(cè)結(jié)果與現(xiàn)代藥理活性研究基本吻合，提示熊果酸、木犀草素、芹菜素可作為Q-marker 的來(lái)源。

圖11 藥物成分靶點(diǎn)與現(xiàn)代藥理活性靶點(diǎn)的交集基因

圖12 “藥物成分-活性靶點(diǎn)” 交聯(lián)度熱圖

4.4 泡桐葉的傳統(tǒng)功效與現(xiàn)代藥理活的相關(guān)性 潰瘍性疾病的發(fā)展與內(nèi)毒素、細(xì)菌等進(jìn)入體內(nèi)激活異常免疫反應(yīng)，黏膜屏障受損，菌群失調(diào)等方面相關(guān)［79］，從傳統(tǒng)功效和現(xiàn)代藥理活性的靶基因交互情況（圖13） 可知，泡桐葉表現(xiàn)出的多種現(xiàn)代藥理活性與其傳統(tǒng)功效存在一定的關(guān)聯(lián)，這與以往的研究一致［80］，即中藥可通過(guò)抗菌、抗氧化、抗炎、細(xì)胞保護(hù)、抗病毒等方面的作用改善潰瘍性疾病。可見(jiàn)泡桐葉的多種現(xiàn)代藥理活性與其傳統(tǒng)功效相印證，提示所預(yù)測(cè)的Q-marker 可同時(shí)作為傳統(tǒng)功效和現(xiàn)代藥理活性的篩選來(lái)源。

圖13 泡桐葉的傳統(tǒng)功效與現(xiàn)代藥理活性的交集基因

5 結(jié)語(yǔ)與展望

為了全面、系統(tǒng)、科學(xué)地評(píng)價(jià)泡桐葉的質(zhì)量，保證其臨床用藥的安全性和有效性，本研究基于質(zhì)量標(biāo)志物的核心概念，先通過(guò)綜合分析泡桐葉的親緣關(guān)系、化學(xué)成分、傳統(tǒng)功效和現(xiàn)代藥理活性，初步篩選出候選質(zhì)量標(biāo)志物，再結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)候選成分進(jìn)行系統(tǒng)性的預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，泡桐葉的多種現(xiàn)代藥理活性與其傳統(tǒng)功效相印證。熊果酸、木犀草素和芹菜素可能是泡桐葉產(chǎn)生抗?jié)?、抗菌、抗炎、抗氧化、?xì)胞保護(hù)、抗病毒、抗腫瘤等作用的潛在靶點(diǎn)，而且這些成分可能與泡桐葉修復(fù)潰瘍創(chuàng)面的良好效果密切相關(guān)。泡桐葉的活性成分在靶點(diǎn)和通路層面表現(xiàn)出良好的協(xié)同性，靶點(diǎn)所富集的抗細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)新生血管形成等通路可能是泡桐葉改善潰瘍性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。相關(guān)研究顯示［50，81］熊果酸和黃酮類化合物對(duì)潰瘍性疾病具有良好的預(yù)防、治療、協(xié)同作用，這與本研究的預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。因此，建議將熊果酸、木犀草素、芹菜素作為泡桐葉的Q-marker。

盡管文獻(xiàn)分析結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)質(zhì)量標(biāo)志物是一種方便、高效的方法，但所預(yù)測(cè)的結(jié)果還需要結(jié)合相關(guān)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證，才能進(jìn)一步明確泡桐葉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。課題組的下一步計(jì)劃是通過(guò)分子對(duì)接結(jié)合實(shí)驗(yàn)，探索藥物小分子和大分子受體的具體作用方式和結(jié)合構(gòu)型，深入挖掘泡桐葉修復(fù)潰瘍創(chuàng)面的機(jī)理，篩選出泡桐葉中與靶點(diǎn)結(jié)合的先導(dǎo)化合物，闡明分子的活性位點(diǎn)和產(chǎn)生活性的原因，旨在優(yōu)化泡桐葉原料的質(zhì)量控制和提取制劑工藝，為臨床應(yīng)用復(fù)方桐葉燒傷油治療潰瘍性疾病和創(chuàng)面修復(fù)提供理論依據(jù)。

此外，雖然黃酮類化合物已被證實(shí)具有廣泛的藥用價(jià)值［82］，但是對(duì)香葉基黃酮類化合物在體內(nèi)研究則相對(duì)較少。目前，對(duì)于泡桐葉中的幾種香葉基黃酮類化合物的生物活性研究，已經(jīng)建立了一定的藥理學(xué)認(rèn)知基礎(chǔ)，后續(xù)可對(duì)這些有活性的先導(dǎo)化合物進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾和開(kāi)發(fā)，讓香葉基黃酮類化合物的應(yīng)用前景更加廣闊。