甘草查爾酮A 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞中氧化還原穩(wěn)態(tài)調(diào)控的影響

丁舒飛，蔣東曉，邱璐琦，張?zhí)K宏，阮葉萍*

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2.浙江省中山醫(yī)院，浙江 杭州 310005；3.蘇州百遏醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 蘇州 215000）

結(jié)腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率［1］。據(jù)《中國(guó)大腸癌流行病學(xué)及其預(yù)防和篩查白皮書》 顯示，我國(guó)大腸癌的發(fā)病率持續(xù)增長(zhǎng)，且絕大部分患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是Ⅱ期或晚期。盡管臨床上已采用早期篩查、手術(shù)、化療等手段來治療結(jié)腸癌，但是結(jié)腸癌致死的人數(shù)仍然很高［2］，使得患者的生活質(zhì)量未得到有效改善。

活性氧（reactive oxygen species，ROS） 是一種有力的致癌物，近年來研究發(fā)現(xiàn)ROS 抑制劑卻能促進(jìn)部分腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［3-4］。正是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞具有較高的基礎(chǔ)ROS 水平，使得腫瘤細(xì)胞更加依賴抗氧化系統(tǒng)，對(duì)ROS 水平的上升會(huì)更加敏感［5］。因此，以上調(diào)腫瘤ROS 水平為導(dǎo)向?qū)ふ铱拱┧幬镉兄匾饬x。

天然產(chǎn)物具有療效高且副作用小的優(yōu)勢(shì)，是篩選抗癌藥物的重要來源。甘草查爾酮A 是從甘草中提取的一種黃酮類化合物，藥理活性廣泛，目前其抗腫瘤活性最受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)甘草查爾酮A能通過阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方式抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)［6-7］，且能通過上調(diào)ROS 水平抑制結(jié)腸癌的生長(zhǎng)［8］，但具體作用靶點(diǎn)則并不明確。本研究將進(jìn)一步驗(yàn)證甘草查爾酮A 的抗癌能力，并探究其誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用靶點(diǎn)，以期為甘草查爾酮A 應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、HCT116 均由蘇州奧特銘醫(yī)藥科技有限公司贈(zèng)予。HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞均培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 甘草查爾酮A （成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，貨號(hào)BP0855，純度≥98%）。DMEM 高糖培養(yǎng)基 （美國(guó) Gibco 公司，貨號(hào)C11995500BT）；噻唑藍(lán) （methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-Lcysteine，NAC） （美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)M21282、A7250）；FITC Annexin V 凋亡試劑盒（美國(guó)BD 公司，貨號(hào)556547）；Annexin V-APC／7-ADD 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)AP105）；硫氧還蛋白還原酶1 （thioredoxin reductase 1，TrxR1） 重組蛋白 （美國(guó) Abnova 公司，貨號(hào)P3509）；RIPA 裂解液、活性氧檢測(cè)試劑盒、DHE探針 （上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)P0013C、S0033、S0063）；cleaved-PARP 多克隆兔抗體、β-actin 多克隆兔抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號(hào)A19612、AC038）；Bcl-2 多克隆兔抗體、TrxR1 多克隆兔抗體、HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗、ECL 顯色液、GAPDH 多克隆兔抗體（美國(guó)Affinity 公司，貨號(hào)AF6139、DF8339、S0002、KF001、AF7021）；還原型谷胱甘肽 （reduced glutathione，GSH） 含量檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)BC1175）；丁硫氨酸亞砜胺（buthionine sulfoximine，BSO）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR） （上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)S51087、S10151）。

1.3 儀器 生物潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)BCM-1000A）；酶標(biāo)儀 （美國(guó)BioTek 公司，型號(hào)Power Wave X340）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司，型號(hào)Centrifuge 5430R）；熒光倒置顯微鏡、光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號(hào)1X71、CX31）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman 公司，型號(hào)CytoFLEX S）；電泳儀、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)Power Pac Basic 164-5050、ChemiDoc Touch）。

2 方法

2.1 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)腸癌細(xì)胞，以每孔6 000 個(gè)的密度接種于96 孔板，設(shè)甘草查爾酮A 不同濃度梯度（0、5、10、20、30、40 μmol／L），每組3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后棄原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL MTT （0.5 mg／mL），繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)基，每孔避光加入150 μL DMSO 溶液，搖床上振蕩10 min。于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)各孔的光密度（OD） 值，計(jì)算細(xì)胞存活率。選用光學(xué)顯微鏡觀察甘草查爾酮A 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)的改變。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)腸癌細(xì)胞，以每孔6×105個(gè)的密度接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁后分為3 組，分別為對(duì)照組和20、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組。按分組進(jìn)行加藥處理，孵育24 h 后收集細(xì)胞，PBS 清洗1～2 次，按FITC Annexin V 凋亡試劑盒說明書操作，過300 目尼龍篩，上機(jī)檢測(cè)。另設(shè)4 組，分別為對(duì)照組、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組、40 μmol／L 甘草查爾酮A+5 mmol／L NAC 組、5 mmol／L NAC 組，其余操作同上。另設(shè)4 組，分別為對(duì)照組、20 μmol／L 甘草查爾酮A 組、20 μmol／L 甘草查爾酮A+10 mmol／L BSO 組、10 mmol／L BSO 組，其余操作同上。另設(shè)4 組，分別為NC 組、NC+20 μmol／L 甘草查爾酮A 組、TrxR1-shRNA 組、TrxR1-shRNA+20 μmol／L 甘草查爾酮A 組，細(xì)胞凋亡率按Annexin V-APC／7-ADD 試劑盒說明書進(jìn)行操作，其余同上。

2.3 Western blot 法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)腸癌細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)的密度接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁后分為3 組，分別為對(duì)照組和20、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組。按分組進(jìn)行加藥處理，孵育24 h 后用RIPA 裂解液裂解并提取蛋白，BCA 定量試劑盒檢測(cè)各組蛋白濃度。取等量蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)到PVDF 膜。5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，剪膜后加入相對(duì)應(yīng)的一抗，于4 ℃孵育過夜，洗膜，加HRP標(biāo)記羊抗兔二抗于37 ℃孵育2 h，洗膜，加電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，于化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像系統(tǒng)顯影，通過Image J 軟件分析目的條帶灰度值。以目標(biāo)蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值為蛋白相對(duì)表達(dá)。另設(shè)4 組，分別為對(duì)照組、40 μmol／L 甘草查爾酮A組、40 μmol／L 甘草查爾酮A+5 mmol／L NAC 組、5 mmol／L NAC 組，其余操作同上。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS 水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116 細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)的密度接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁后分為3 組，分別為對(duì)照組和20、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組。按分組進(jìn)行加藥處理，孵育24 h 后收集細(xì)胞，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol／L，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106～2×107／mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。PBS 清洗細(xì)胞2～3 次后重懸細(xì)胞，過300 目尼龍篩網(wǎng)至流式管，選擇流式細(xì)胞儀FITC-A 通道檢測(cè)熒光強(qiáng)度。DHE 探針操作同DCFH-DA，選擇流式細(xì)胞儀PC-5.5A 通道檢測(cè)熒光強(qiáng)度。另設(shè)4 組，分別為對(duì)照組、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組、40 μmol／L 甘草查爾酮A +5 mmol／L NAC 組、5 mmol／L NAC 組，其余操作同上。另設(shè)4 組，分別為NC 組、NC+20 μmol／L 甘草查爾酮A 組、TrxR1-shRNA 組、TrxR1-shRNA+20 μmol／L 甘草查爾酮A 組，采用DHE 探針檢測(cè)ROS 水平，其余操作同上。

2.5 分子對(duì)接 通過PDB 數(shù)據(jù)庫下載目標(biāo)蛋白PDB 文件，PubChem 數(shù)據(jù)庫下載小分子SDF 文件，通過Schrodinger 軟件對(duì)蛋白和小分子分別進(jìn)行預(yù)處理，將蛋白處理生成格點(diǎn)文件后再進(jìn)行對(duì)接。

2.6 TrxR1 活性檢測(cè) 通過DTNB 法，將NADPH預(yù)還原的重組TrxR1 蛋白（170 nmol／L） 與不同濃度甘草查爾酮A （0、5、10、20、40、80、100 μmol／L） 加入到96 孔板中，于室溫下孵育0.5 h，加入50 μL 含DTNB （終濃度2 mmol／L） 和NADPH （終濃度0.2 mmol／L） 的TE 緩沖液于每孔中，立即檢測(cè)前3 min 內(nèi)在412 nm 波長(zhǎng)處的吸光度的增加量。細(xì)胞中的TrxR1 活性利用胰島素終點(diǎn)法進(jìn)行測(cè)定。

2.7 GR 活性檢測(cè) 將NADPH 還原的重組蛋白GR （0.25 U／mL） 與不同濃度甘草查爾酮A （0、5、10、20、40、80、100 μmol／L） 加入到96 孔板中，所有反應(yīng)在TE 緩沖體系中進(jìn)行，在室溫下孵育0.5 h，加入50 μL 含氧化型谷胱甘肽（終濃度1 mmol／L） 和NADPH （終濃度0.4 mmol／L） 的TE 緩沖液，立即檢測(cè)前3 min 內(nèi)在340 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。細(xì)胞中的GR 活性利用谷胱甘肽還原酶試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

2.8 慢病毒感染實(shí)驗(yàn) 將HCT116 細(xì)胞接種至96孔板中，培養(yǎng)過夜，使感染前細(xì)胞匯合率在30%～50%之間。設(shè)置感染復(fù)數(shù)（multiplicity of Infection，MOI） 梯度值（0、1、5、10、20、40、80），選擇最佳MOI 值。根據(jù)MOI 值稀釋攜帶無關(guān)序列或TrxR1 沉默序列的慢病毒并加到96 孔板中，24 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。感染72 h 后可在熒光顯微鏡下觀察感染效率。再根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇適宜的MOI 值，重復(fù)以上步驟并用嘌呤霉素篩選細(xì)胞，獲取穩(wěn)轉(zhuǎn)株用于實(shí)驗(yàn)。其中MOI＝慢病毒滴度×慢病毒體積／細(xì)胞數(shù)目。

2.9 細(xì)胞內(nèi)GSH 水平檢測(cè) 細(xì)胞以每孔1×106個(gè)的密度接種于6 孔板并培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后分為3 組，分別為對(duì)照組和20、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組。按分組進(jìn)行加藥處理，孵育24 h 后，PBS 清洗2～3 次，加入3 倍細(xì)胞沉淀體積的試劑重懸細(xì)胞，反復(fù)凍融2～3 次，8 000 r／min 離心10 min，收集上清按GSH 含量檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)GSH 水平。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過Graph Pad Prism 8.0 和SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s） 表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 甘草查爾酮A 對(duì)細(xì)胞存活的影響 如圖1A所示，給藥24 h 后，與對(duì)照組（0 μmol／L 甘草查爾酮A） 比較，5～40 μmol／L 甘草查爾酮A 均能有效抑制HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞的活性（P＜0.05，P＜0.01）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇甘草查爾酮A 進(jìn)行。如圖1B 所示，與對(duì)照組（0 μmol／L 甘草查爾酮A） 比較，20、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞均可見空泡化、變圓、體積變小的現(xiàn)象。

圖1 甘草查爾酮A 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活性（A） 和形態(tài)（B） 的影響（±s，n＝3）Fig．1 Effects of licochalcone A on viability （A） and morphology （B） of colon cancer cells （±s，n＝3）

3.2 甘草查爾酮A 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響 如圖2A 所示，與對(duì)照組（0 μmol／L 甘草查爾酮A）比較，HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞經(jīng)各濃度甘草查爾酮A 處理后，細(xì)胞凋亡率均升高（P＜0.05，P＜0.01）。如圖2B～2C 所示，與對(duì)照組（0 μmol／L甘草查爾酮A） 比較，經(jīng)20 μmol／L 甘草查爾酮A處理后，HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞凋亡蛋白cleaved-PARP 表達(dá)升高 （P＜0.05，P＜0.01），SW480 細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)降低（P＜0.01）；經(jīng)40 μmol／L 甘草查爾酮A 處理后，HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞cleaved-PARP 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。

圖2 甘草查爾酮A 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝3）Fig．2 Effects of licochalcone A on apoptosis of colon cancer cells （±s，n＝3）

3.3 甘草查爾酮A 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞ROS 水平的影響 如圖3A～3B 所示，與對(duì)照組（0 μmol／L 甘草查爾酮A） 比較，HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞在流式細(xì)胞儀FITC-A 通道和PC-5.5A 通道的熒光強(qiáng)度均有增強(qiáng)，ROS 水平均有所上升（P＜0.01）。NAC是一種常見的ROS 抑制劑，如圖3C～3D 所示，與單純給予甘草查爾酮A 比較，甘草查爾酮A 聯(lián)合NAC （預(yù)孵育6 h） 給藥后兩結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平下降（P＜0.01）。說明ROS 抑制劑能逆轉(zhuǎn)甘草查爾酮A 誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞ROS 水平的上升。

圖3 甘草查爾酮A 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞ROS 水平的影響（±s，n＝3）Fig．3 Effects of licochalcone A on ROS level in colon cancer cell （±s，n＝3）

3.4 ROS 抑制劑對(duì)甘草查爾酮A 誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響 如圖4 所示，與40 μmol／L 甘草查爾酮A 組比較，40 μmol／L 甘草查爾酮A+NAC 誘導(dǎo)的HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞凋亡率降低 （P＜0.01），cleaved-PARP 蛋白表達(dá)降低。

圖4 ROS 抑制劑對(duì)甘草查爾酮A 誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝3）Fig．4 Effects of ROS inhibitor on licochalcone A-induced apoptosis of colon cancer cells （±s，n＝3）

3.5 甘草查爾酮A 對(duì)GR 和TrxR1 活性的影響酶學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5A 所示，與對(duì)照組比較，5～100 μmol／L 甘草查爾酮A 均能抑制重組蛋白TrxR1的活性，并呈劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01），而對(duì)重組GR 蛋白活性則幾乎無影響（P＞0.05）。如圖5B～5C 所示，與對(duì)照組（0 μmol／L 甘草查爾酮A） 比較，5～100 μmol／L 甘草查爾酮A 能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中TrxR1 活性 （P＜0.05，P＜0.01），而對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞中GR 活性無明顯影響（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，甘草查爾酮A 能選擇性地抑制還原蛋白TrxR1 的活性。

圖5 甘草查爾酮A 對(duì)GR 和TrxR1 活性的影響（±s，n＝3）Fig．5 Effects of licochalcone A on GR and TrxR1 activities （±s，n＝3）

3.6 甘草查爾酮A 對(duì)TrxR1 蛋白表達(dá)的影響及分子對(duì)接驗(yàn)證 如圖6A 所示，與對(duì)照組（0 μmol／L甘草查爾酮A） 比較，經(jīng)甘草查爾酮A 處理后，HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞TrxR1 蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）。如圖6B 所示，甘草查爾酮A 能和TrxR1 蛋白（PDB code 2ZZ0） 中的Trp 407 形成2 個(gè)氫鍵相互作用，甘草查爾酮A 的α，β 雙鍵能進(jìn)攻TrxR1 的Cys 498 殘基并與Cys 498 殘基相結(jié)合。

圖6 甘草查爾酮A 對(duì)TrxR1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig．6 Effects of licochalcone A on TrxR1 protein expression （±s，n＝3）

3.7 沉默TrxR1 對(duì)甘草查爾酮A 干預(yù)HCT116 細(xì)胞ROS 水平的影響 如圖7A 所示，shRNA 序列1（sh1，CACAGGATTAAGGCAACAAAT） 的沉默效果優(yōu)于 shRNA 序列 2 （sh2，GCTGGATTTCTT GCTGGTATT） 和shRNA 序列3 （sh3，CTGTATTT ACTCCTTTGGAAT），因此選擇sh1 探究沉默TrxR1對(duì)甘草查爾酮A 抗結(jié)腸癌作用的影響。如圖7B 所示，與NC+20 μmol／L 甘草查爾酮A 組比較，沉默TrxR1 能促進(jìn)甘草查爾酮A 上調(diào)HCT116 細(xì)胞ROS水平（P＜0.01），對(duì)甘草查爾酮A 上調(diào)ROS 水平具有協(xié)同效果。

圖7 沉默TrxR1 對(duì)甘草查爾酮A 干預(yù)HCT116 細(xì)胞ROS 水平的影響（±s，n＝3）Fig．7 Effects of TrxR1 silencing on ROS level of licochalcone A-intervened HCT116 cells （±s，n＝3）

3.8 沉默TrxR1 對(duì)甘草查爾酮A 干預(yù)HCT116 細(xì)胞活力和凋亡的影響 如圖8 所示，與NC+20 μmol／L 甘草查爾酮A 組比較，沉默TrxR1 后甘草查爾酮A 誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞凋亡率升高 （P＜0.01），細(xì)胞活力降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，沉默TrxR1 能促進(jìn)甘草查爾酮A 誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞活力。

圖8 沉默TrxR1 對(duì)甘草查爾酮A 干預(yù)HCT116 細(xì)胞活力（A） 和凋亡（B） 的影響（±s，n＝3）Fig．8 Effects of TrxR1 silencing on cell viability （A） and apoptosis （B） of licochalcone A-intervened HCT116 cells （±s，n＝3）

3.9 BSO 對(duì)甘草查爾酮A 誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞凋亡的影響 如圖9A 所示，與對(duì)照組（0 μmol／L 甘草查爾酮A） 比較，甘草查爾酮A 不影響HCT116 細(xì)胞中GSH 水平（P＞0.05）。如圖9B 所示，與20 μmol／L 甘草查爾酮A 組比較，甘草查爾酮A 聯(lián)合BSO （預(yù)孵育4 h） 能促進(jìn)甘草查爾酮A 誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞發(fā)生凋亡（P＜0.01）。

圖9 BSO 對(duì)甘草查爾酮A 誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝3）Fig．9 Effects of BSO on apoptosis of licochalcone A-induced HCT116 cells （±s，n＝3）

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，甘草查爾酮A 能誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞發(fā)生凋亡并上調(diào)ROS 水平，ROS抑制劑能逆轉(zhuǎn)甘草查爾酮A 引起的ROS 水平上升和促凋亡作用。甘草查爾酮A 能選擇性地抑制TrxR1 蛋白活性，對(duì)TrxR1 蛋白表達(dá)幾乎沒有影響，且沉默TrxR1 使結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)甘草查爾酮A干預(yù)更加敏感，表明TrxR1 在甘草查爾酮A 抗結(jié)腸癌過程中發(fā)揮著重要作用。

谷胱甘肽系統(tǒng)和硫氧還蛋白系統(tǒng)是機(jī)體內(nèi)防御氧化應(yīng)激的關(guān)鍵抗氧化系統(tǒng)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的硫氧還蛋白系統(tǒng)和谷胱甘肽系統(tǒng)能夠交叉提供電子，并互為后備系統(tǒng)［5，9］。當(dāng)硫氧還蛋白系統(tǒng)中TrxR1 缺失時(shí)，使腫瘤對(duì)藥物性谷胱甘肽缺乏高度敏感［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默TrxR1 對(duì)HCT116細(xì)胞ROS 水平的升高、細(xì)胞活性以及凋亡幾乎沒有影響，進(jìn)一步說明了細(xì)胞內(nèi)存在TrxR1 的備用系統(tǒng)，能繞過TrxR1 缺陷繼續(xù)維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。GSH 是谷胱甘肽系統(tǒng)中的抗氧化劑，能與氧化劑發(fā)生非酶促反應(yīng)，抑制細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，甘草查爾酮A 不影響GSH 水平，GSH 抑制劑BSO 則能協(xié)同甘草查爾酮A 誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞發(fā)生凋亡，間接說明了TrxR1 可介導(dǎo)甘草查爾酮A 誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

TrxR1 是一種NADPH 依賴的包含黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)構(gòu)域的二聚體含硒酶，廣泛分布于原核細(xì)胞和各類生物體細(xì)胞中。TrxR1 的表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)和預(yù)后密切相關(guān)［12-13］，越來越多實(shí)驗(yàn)證明，通過靶向抑制TrxR1 活性可有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，如胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等［14-16］，且沉默TrxR1 能夠增加藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用［17］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，沉默TrxR1 能夠協(xié)同甘草查爾酮A 的抗結(jié)腸癌作用，可見TrxR1 是開發(fā)抗癌藥物中非常有價(jià)值的靶點(diǎn)。TrxR1 的C 末端-Gly-Cys-Sec-Gly 是氧化還原活性位點(diǎn)［18］。研究發(fā)現(xiàn)，含有α，β-不飽和酮結(jié)構(gòu)的化合物，容易和TrxR1 蛋白晶體結(jié)構(gòu)（Sec 498 殘基被Cys 498 殘基） 的Cys 498 殘基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，如EF24 和B19［14，19］。本研究發(fā)現(xiàn)，含有上述結(jié)構(gòu)的甘草查爾酮A 同樣能與TrxR1蛋白晶體結(jié)構(gòu)內(nèi)的Cys 498 殘基以共價(jià)鍵的形式結(jié)合。Sec 殘基比典型的Cys 殘基親核性高3 個(gè)數(shù)量級(jí)，對(duì)親電物種有著高度反應(yīng)［20］。另有研究發(fā)現(xiàn)，含有上述結(jié)構(gòu)的紫草素能抑制TrxR1 活性，對(duì)U498C TrxR1 （Sec 498 殘基被Cys 498 殘基） 活性幾乎無影響［3］。說明TrxR1 活性的降低有可能與甘草查爾酮A 作用TrxR1 活性位點(diǎn)Sec 有關(guān)，而甘草查爾酮A 和Sec 的共價(jià)結(jié)合是否可逆則有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，甘草查爾酮A 可能通過抑制TrxR1活性來破壞結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究為甘草查爾酮A應(yīng)用于結(jié)腸癌的治療提供了理論依據(jù)，為抗結(jié)腸癌藥物靶點(diǎn)的開發(fā)提供了新思路。