血小板膜糖蛋白特異性抗體在ITP患兒中的表達及其與療效、出血程度的關(guān)系分析

張 晴,李 旭,高長俊,任 蓉,韓 靜

(唐山市婦幼保健院小兒血液科,河北 唐山 063000)

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)為兒童時期最常見的自身免疫出血性疾病,亦稱特發(fā)性血小板減少性紫癜,可見皮膚或黏膜出血點、瘀點、瘀斑、束臂試驗陽性、血小板計數(shù)(platelet count,PLT)減少、出血時間延長、骨髓象典型表現(xiàn)等[1]。但在對ITP患兒的臨床診治中,部分家長容易因顧慮較多(如患兒年齡較小、具有創(chuàng)傷性等)而無法配合骨髓穿刺術(shù)檢查。近年來,隨著分子生物學、醫(yī)學免疫學等不斷發(fā)展,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)血小板抗原產(chǎn)生特異性抗體為ITP發(fā)病的重要原因之一[2-4],其中又以血小板膜糖蛋白(platelet membrane glycoprotein,GP)特異性抗體最為常見。GP特異性抗體異常升高可增加血小板對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的破壞而促進病情進展,但目前臨床關(guān)于GP特異性抗體(抗GPⅠb/Ⅸ抗體、抗GPⅡb/Ⅲa抗體)對ITP患兒療效、預后等的影響尚無統(tǒng)一定論。故開展本研究,旨在進一步分析GP特異性抗體在ITP患兒中的表達情況及其與療效、出血程度的關(guān)系,為ITP臨床診治提供參考,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年2月至2020年12月于唐山市婦幼保健院兒科就診的102例ITP患兒為研究對象,并將其納入病例組,另選取同期同院進行體檢的110例健康兒童納入健康組。納入標準:①病例組患兒診斷符合中華醫(yī)學會兒科學分會血液學組關(guān)于《兒童原發(fā)性免疫性血小板減少癥診療建議》中的相關(guān)標準[5];②初診者;③無其他免疫系統(tǒng)疾病、造血系統(tǒng)疾病者;④完成各項檢測,診斷明確,且均接受糖皮質(zhì)激素沖擊療法治療者等。排除標準:①有免疫抑制劑治療史,或治療期間接受其他治療者;②合并惡性腫瘤、肝腎器官功能障礙者;③合并先天性心臟病、唐氏綜合征、地中海貧血等疾病者;④其他繼發(fā)性的血小板減少癥者等。脫落與剔除標準:①治療、檢查依從性差者;②治療期間死亡者。

健康組:男62例,女48例;居住地:城市69例,農(nóng)村41例;年齡1～8歲,平均(4.63±1.20)歲。病例組:男55例,女47例;居住地:城市64例,農(nóng)村38例;年齡1～7歲,平均(4.19±1.05)歲。兩組一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲唐山市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會審批(倫理批號:2018-LY-B012),ITP患兒與健康兒童家屬均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 治療方法

病例組患兒均接受糖皮質(zhì)激素沖擊療法,即予以地塞米松磷酸鈉注射液(1mL:2mg,國藥準字H61020227,陜西博森生物制藥股份集團有限公司)治療,0.6mg·kg-1·d-1,連用4d,以4周為1個療程,共治療5個療程,并隨訪3個月。

1.2.2 GP特異性抗體檢測方法

①標本采集:采集兩組入院后的空腹外周血5mL,予以EDTA抗凝處理后,離心(離心半徑10cm,3 500r/min,離心15min),分離血漿后置于-80℃冰箱保存待測;②改良單克隆抗體血小板抗原固定試驗檢測GP特異性抗體,主要操作包括:取正常人O型血小板懸液調(diào)整密度(調(diào)整后:1×109/L)后移至離心管(EP管,100uL/管),然后加入待測血漿(100uL),混勻后室溫孵育(60min);③加磷酸鹽(phosphate buffered saline,PBS)/EDTA緩沖液(0.6mL)洗滌3次(3 000g離心,2min/次,棄去上清),每管加入血小板裂解液(100uL)進行震蕩、使其混勻,然后進行冰箱孵育(4℃,30min),再做離心處理(26 000g,離心30min);④稀釋上清液(1∶5)后加樣(每孔100uL)至俘獲單抗的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)包被的酶標板上,設雙復孔,進行室溫振蕩孵育(60 min);⑤以PBS/吐溫(Tween)(0.01 mol/L)洗滌4次,每孔加入堿性磷酸酶標記的羊抗人IgG(100uL),封膜、室溫振蕩孵育(60min);⑥再用PBS/Tween(0.01 mol/L)洗滌6次,加入對硝基苯磷酸鹽底物緩沖液(100uL),水浴箱孵育至顯色(37℃,2～3h);⑦采用酶標儀(MR-96 A型,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測定吸光度(A)值(主要為405nm、490nm處),每板設4個正常對照,用A405nm減A490nm,若A值大于正常A值的均數(shù)+3倍標準差視為陽性[6]。

1.3 觀察指標

1.3.1 兩組GP特異性抗體表達情況

根據(jù)1.2.2檢測結(jié)果記錄兩組抗GPⅠb/Ⅸ抗體、抗GPⅡb/Ⅲa抗體表達水平。

1.3.2 出血部位及不同GP特異性抗體出血程度

記錄ITP患兒出血部位,根據(jù)1.2.2檢測結(jié)果記錄ITP患兒抗GPⅠb/Ⅸ抗體陽性、抗GPⅡb/Ⅲa抗體陽性、雙抗體陽性、雙抗體陰性情況,同時分析不同GP特異性抗體表達下的出血程度,ITP出血分級標準見表1[7]。

表1 ITP出血分級標準

1.3.3 不同GP特異性抗體療效

治療5個療程后檢測并比較不同GP特異性抗體(抗GPⅠb/Ⅸ抗體陽性、抗GPⅡb/Ⅲa抗體陽性、雙抗體陽性、雙抗體陰性)表達下的療效,檢測方法同1.2.2,根據(jù)《美國血液學會免疫性血小板減少癥基于證據(jù)的實踐指南(兒童)》評估患兒療效[8],PLT≥30×109/L且為治療前的2倍以上(相隔7d以上測定2次),亦無出血癥狀為有效;PLT<30×109/L(必須相隔1d以上測定2次)或為治療前的2倍以下,和/或有出血癥狀為無效。

1.3.4 不同GP特異性抗體預后

隨訪3個月后檢測并比較不同GP特異性抗體(抗GPⅠb/Ⅸ抗體陽性、抗GPⅡb/Ⅲa抗體陽性、雙抗體陽性、雙抗體陰性)表達下的預后,檢測方法同1.2.2,隨訪3個月后PLT≥100×109/L為完全緩解,隨訪3個月后PLT<100×109/L為未完全緩解。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 兩組GP特異性抗體表達情況比較

病例組抗GPⅠb/Ⅸ抗體、抗GPⅡb/Ⅲa抗體表達水平高于健康組,差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為16.521、51.718,P<0.05),見表2。

表2 兩組GP特異性抗體表達情況比較

2.2 ITP患兒出血部位及不同GP特異性抗體出血程度比較

102例ITP患兒抗GPⅠb/Ⅸ抗體陽性、抗GPⅡb/Ⅲa抗體陽性、雙抗體陽性、雙抗體陰性檢出率分別為15.69%(16/102)、4.90%(5/102)、30.39%(31/102)、49.02%(50/102),0級、1級、2級出血率分別為16.67%、50.00%、33.33%,口腔、皮膚、鼻、胃腸道出血各22、18、26、19例,無月經(jīng)、泌尿系、顱內(nèi)、結(jié)膜出血;且0級出血以雙抗體陽性占比(0)最低,1級出血以抗GPⅡb/Ⅲa抗體陽性占比(80.00%)最高,2級出血以抗GPⅠb/Ⅸ抗體陽性、雙抗體陽性占比(62.50%、48.39%)較高,差異有統(tǒng)計學意義(H=38.237,P<0.05),見表3。

表3 不同GP特異性抗體出血程度比較 [n(%)]

2.3 不同GP特異性抗體療效比較

102例ITP患兒治療5個療程后有效率為78.43%;雙抗體陰性ITP患兒有效率為96.00%,高于抗GPⅠb/Ⅸ抗體陽性、抗GPⅡb/Ⅲa抗體陽性、雙抗體陽性ITP患兒的50.00%、60.00%、67.74%,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.866,P<0.05),見表4。

表4 不同GP特異性抗體療效比較 [n(%)]

2.4 不同GP特異性抗體預后比較

102例ITP患兒隨訪3個月后完全緩解率為68.63%;雙抗體陰性ITP患兒完全緩解率為92.00%,高于抗GPⅠb/Ⅸ抗體陽性、抗GPⅡb/Ⅲa抗體陽性、雙抗體陽性ITP患兒的31.25%、40.00%、54.84%,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=27.709,P<0.05),見表5。

表5 不同GP特異性抗體預后比較 [n(%)]

3 討論

3.1 ITP患兒的發(fā)病機制與其研究現(xiàn)狀

ITP為兒童常見良性出血性疾病,可致皮膚黏膜自發(fā)性出血、血小板減少、凝血功能障礙等,其中顱內(nèi)出血是引起患兒死亡的重要原因。同時,該病發(fā)病機制復雜,隨著近年來對ITP發(fā)病機制的相關(guān)研究不斷深入,越來越多的學者認為,GP特異性抗體介導的血小板破壞是ITP的經(jīng)典發(fā)病機制,能夠有效區(qū)別非免疫性血小板減少及免疫性血小板減少,具有特異性高、陽性預測值較高等特點,且不同GP特異性抗體作用的強度、持續(xù)時間等均存在明顯差異[9]。但目前國內(nèi)關(guān)于GP特異性抗體的報道多集中于成人ITP表達情況的分析,關(guān)于ITP患兒的相關(guān)報道較少。因此,分析GP特異性抗體在ITP患兒中的表達情況及其與療效、出血程度的關(guān)系對ITP患兒治療方案的選擇及疾病預后的改善意義重大。

3.2 ITP患兒GP特異性抗體表達及不同GP特異性抗體出血程度

既往研究發(fā)現(xiàn),ITP患者出血程度不盡相同,且大多患者臨床出血程度與PLT呈反比,即PLT越低、出血癥狀越嚴重;PLT越高、出血癥狀越輕,但某些PLT者臨床并無出血癥狀或僅伴有輕度出血,不同個體間存在差異[10-11]。本研究結(jié)果顯示,病例組抗GPⅠb/Ⅸ抗體、抗GPⅡb/Ⅲa抗體表達水平高于健康組,且0級出血以雙抗體陽性占比最低,1級出血以抗GPⅡb/Ⅲa抗體陽性占比最高,2級出血以抗GPⅠb/Ⅸ抗體陽性、雙抗體陽性占比較高,提示ITP患兒GP特異性抗體表達較高,且不同GP特異性抗體出血程度存在差異。分析原因可能為抗GPⅠb/Ⅸ抗體、抗GPⅡb/Ⅲa抗體不僅可直接對ITP患兒的血小板產(chǎn)生作用,亦可結(jié)合機體中的血小板抗原形成復合物,進而影響ITP患兒血液纖維程度,參與血小板的黏附、聚集;同時,抗GPⅠb/Ⅸ抗體是血小板血管性血友病因子的重要受體,可發(fā)揮降低ITP患兒血小板黏附的作用,進而阻止血管損傷部位血小板黏附、聚集,加重患兒出血癥狀,使得抗GPⅠb/Ⅸ抗體陽性、雙抗體陽性患兒2級出血占比較高,進一步促進患兒病情進展[12-15]。因此,臨床可通過監(jiān)測GP特異性抗體表達水平來預測其病情進展情況。

3.3 不同GP特異性抗體療效與預后

糖皮質(zhì)激素是ITP患兒的一線治療藥物之一,可通過抑制自身抗體產(chǎn)生、封閉網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)免疫球蛋白Fc部分c末端的受體(Fc受體)等,減少血小板的破壞而產(chǎn)生治療效果[16-17]。本研究結(jié)果顯示,102例ITP患兒治療5個療程后有效率為78.43%、隨訪3個月后完全緩解率為68.63%,且雙抗體陰性ITP患兒有效率、完全緩解率較高,而其余各組比較差異無統(tǒng)計意義,進一步說明GP特異性抗體陰性ITP患兒療效、預后較好,而抗GPⅠb/Ⅸ抗體陽性、抗GPⅡb/Ⅲa抗體陽性、雙抗體陽性ITP患兒對一線治療的反應較差,可致治療無效、預后不良等,臨床可根據(jù)患兒病情予以個體化治療?？紤]原因可能為ITP患兒的發(fā)生與自身GPⅠb、GPⅡb抗原的免疫失耐受密切相關(guān),主要包括中樞免疫失耐受和外周免疫失耐受等更高層次上的免疫耐受機制紊亂,使得糖皮質(zhì)激素難以控制病情進展;同時,GPⅠb屬于Leucine豐富家族蛋白,抗GPⅠb/Ⅸ抗體、抗GPⅡb/Ⅲa抗體表達水平升高可能提示ITP患兒出現(xiàn)感染,而糖皮質(zhì)激素的使用有助于病原菌的生長,刺激抗GPⅠb/Ⅸ抗體、抗GPⅡb/Ⅲa抗體產(chǎn)生,形成惡性循環(huán)而使糖皮質(zhì)激素治療失敗[18-20]。其中,抗GPⅠb/Ⅸ抗體、抗GPⅡb/Ⅲa抗體是傳導血小板聚集信號的關(guān)鍵環(huán)節(jié),可通過不同途徑(主要為Fc依賴途徑、Fc非依賴途徑)清除血小板促進病情進展[21],臨床可通過以上靶點研發(fā)新的藥物對ITP患兒進行治療。

綜上,ITP患兒抗GPⅠb/Ⅸ抗體、抗GPⅡb/Ⅲa抗體表達水平較高,且其不同表達水平與患兒出血程度、療效及預后均有密切關(guān)系,臨床可通過監(jiān)測GP特異性抗體來對ITP患兒進行早期診斷,并對其出血程度、療效、預后等進行預測。但本研究亦存在一定的不足,如樣本量較少、觀察時間短、納入病例單一等,可能導致結(jié)果存在一定偏倚,臨床可進一步研究以明確GP特異性抗體與ITP患兒病情進展、療效、預后等的關(guān)系。