不同連作年限栝樓根際土壤微生物群落多樣性分析

徐筋燕　何曉蘭　邵明燦　萬云龍　刁亞梅　楊中?！」鶗?/p>

摘要：為明確連作對(duì)栝樓根際土壤微生物群落的影響和栝樓連作障礙產(chǎn)生的原因，以連作2年和連作4年的栝樓根際土壤為研究對(duì)象，進(jìn)行土壤理化性質(zhì)測(cè)定以及土壤細(xì)菌16S和真菌ITS高通量測(cè)序。土壤理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明，與連作2年的栝樓根際土壤樣本相比，連作4年的栝樓根際土壤樣本中有機(jī)碳含量下降；與對(duì)照土壤樣本和連作2年的栝樓根際土壤樣本相比，連作4年的栝樓根際土壤樣本陽離子交換量（CEC）下降，說明土壤保肥能力已下降。細(xì)菌群落α多樣性分析結(jié)果顯示，栝樓連作對(duì)細(xì)菌群落的影響相對(duì)較小。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，與對(duì)照土壤樣本相比，栝樓連作根際土壤中一些具有重要功能的細(xì)菌門相對(duì)豐度下降。與對(duì)照土壤樣本相比，連作2年和連作4年的栝樓根際土壤樣本中真菌群落群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生明顯變化，一些有害真菌屬如Stagonosporopsis、Rhizoctonia和Colletotrichum的相對(duì)豐度大幅增加。典型相關(guān)分析結(jié)果表明，硝態(tài)氮含量、全磷含量和速效磷含量是栝樓根際土壤微生物群落多樣性的主要影響因素；pH值、陽離子交換量是CK土壤微生物群落多樣性的主要影響因素。

關(guān)鍵詞：栝樓；連作；根際土壤；微生物群落；土壤理化性質(zhì)；高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)：S567.23+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2023）05-1140-11

Analysis of microbial community diversity in rhizosphere soil of continuous cropping Trichosanthes kirilowiiXU Jin-yan HE Xiao-lan SHAO Ming-can WAN Yun-long DIAO Ya-mei YANG Zhong-hai GUO Shu-qiao

（1.Institute of Industrial Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.Institute of Vegetable Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;3.School of Agronomy and Horticulture， Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry， Jurong 212400， China;4.Lianshui Yuguo Agricultural Development Co.， Ltd.， Huaian 223411， China）

Abstract：To clarify the effects of continuous cropping on the rhizosphere soil microbial community of Trichosanthes kirilowii and the causes of continuous cropping obstacles， rhizosphere soil samples of Trichosanthes kirilowii after continuous cropping for two and four years were used for analyzing in this study. The physicochemical properties of the soil samples were determined， and the bacterial 16S library and fungal ITS library were constructed and sequenced by high-throughput sequencing technology. The results of physicochemical properties showed that compared with the rhizosphere soil samples of Trichosanthes kirilowii after continuous cropping for two years， the organic carbon content in the rhizosphere soil samples of Trichosanthes kirilowii after continuous cropping for four years decreased. Compared with the control soil samples and the rhizosphere soil samples of Trichosanthes kirilowii after continuous cropping for two years， the cation exchange capacity （CEC） of soil samples began to decrease after four years of continuous cropping， indicating that the soil fertility retention capacity began to decrease. The results of α-diversity of bacterial communities showed that the continuous cropping of Trichosanthes kirilowii had a relatively small effect on bacterial community. However， the relative abundance of some functional bacteria in the rhizosphere soil samples of continuous cropping Trichosanthes kirilowii decreased campared with that in the control soil samples. Compared with the control soil samples， the structure and composition of fungal communities in the rhizosphere soil samples of Trichosanthes kirilowii after continuous cropping for two years and four years changed significantly， and the relative abundance of some harmful fungi such as Stagonosporopsis， Rhizoctonia and Colletotrichum increased significantly. The results of canonical correlation analysis showed that nitrate nitrogen content， total phosphorus content and available phosphorus content were the main influencing factors of microbial community diversity in rhizosphere soil of Trichosanthes kirilowii， and pH and CEC were the main influencing factors of soil microbial community diversity in CK.

Key words：Trichosanthes kirilowii;continuous cropping;rhizosphere soil;microbial community;physicochemical properties of the soil；high-throughput sequencing

栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim）又名瓜蔞，屬于葫蘆科栝樓屬，是中國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，具有非常高的藥用價(jià)值。栝樓的根、莖、葉均可入藥，栝樓根即天花粉，是中國(guó)臨床常用中藥材，具有降血糖、抗腫瘤和抗病毒等多種療效[1-3]。栝樓果實(shí)在臨床上分為3種，即全瓜蔞（栝樓果實(shí)）、瓜蔞皮和瓜蔞籽，可用于治療肺癰、肺熱咳嗽和大便秘結(jié)等，此外，它在呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病治療方面以及抗菌、抗腫瘤等方面均具有一定的作用[4-7]。瓜蔞籽營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、氨基酸和多種人體所需微量元素，近年來已逐漸成為一種廣受大眾喜愛的休閑食品。栝樓等傳統(tǒng)中藥材在治療新型冠狀病毒感染中發(fā)揮了重要的作用[8-10]，因此，近年來對(duì)于栝樓的需求也逐漸呈現(xiàn)供不應(yīng)求的狀態(tài)。

栝樓屬于多年生宿根類作物，種植以后可以連續(xù)收獲4～6年。但隨著連作時(shí)間的增加，會(huì)發(fā)生明顯的連作障礙，主要表現(xiàn)為暴發(fā)嚴(yán)重的病蟲害（炭疽病、蔓枯病等），產(chǎn)量、品質(zhì)下降。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2018-2020年，江蘇省蘇北地區(qū)栝樓主栽區(qū)連作3年以上的栝樓減產(chǎn)30%～80%，部分嚴(yán)重地塊甚至絕產(chǎn)，給江蘇省栝樓產(chǎn)業(yè)造成了巨大的打擊，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)上億元。解決栝樓連作障礙問題已經(jīng)刻不容緩。連作障礙是指在同一地塊上連續(xù)種植同種或同科作物，即使在正常的管理?xiàng)l件下，作物仍然表現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、抗逆性降低、病蟲害嚴(yán)重和產(chǎn)量下降等現(xiàn)象。很多作物受連作障礙影響，導(dǎo)致產(chǎn)量、品質(zhì)下降和高死亡率等問題，而宿根類中藥材因其特殊的栽培條件，受到連作障礙的影響更大，約70%的宿根類藥材都存在不同程度的連作障礙問題[11-14]。有研究結(jié)果表明，增加連作時(shí)間會(huì)導(dǎo)致土壤肥力下降、養(yǎng)分失衡、土壤酶活性降低、植物病蟲害發(fā)生率增加、根際有毒物質(zhì)積累量增加[15-16]，這些變化均會(huì)對(duì)植物根際微生物群落產(chǎn)生較大影響，并進(jìn)一步影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

土壤微生物群落能夠影響植物的生理性狀和生長(zhǎng)發(fā)育，與植物密切相關(guān)[17]。植物根際微生物特別是細(xì)菌能夠參與一些重要的生物進(jìn)程，包括土壤有機(jī)質(zhì)分解、土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和循環(huán)等[18]，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有非常重要的作用。而大多數(shù)土壤真菌包含很多致病菌，并不利于植物生長(zhǎng)。通常情況下，植物和根際微生物群落之間存在著一定的平衡關(guān)系，土壤中以細(xì)菌為主，真菌數(shù)量較少。連作會(huì)導(dǎo)致土壤中細(xì)菌與真菌的比例失衡，細(xì)菌數(shù)量、種類減少，真菌種類、數(shù)量增加，從而導(dǎo)致土壤肥力下降，植物病蟲害發(fā)生率增加[15，19]。對(duì)連作的花生根際土壤進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)連作會(huì)導(dǎo)致土壤中一些有益真菌［如叢枝菌根真菌（AMF）和木霉屬（Trichoderma）真菌］相對(duì)豐度減少，部分有害真菌［如鐮刀菌屬（Fusarium）真菌］相對(duì)豐度增加，從而導(dǎo)致花生產(chǎn)量下降[19]；連續(xù)種植黑胡椒會(huì)導(dǎo)致土壤pH值、有機(jī)質(zhì)含量和土壤細(xì)菌豐度下降，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致黑胡椒生長(zhǎng)不良[20]。關(guān)于栝樓連作障礙的研究起步較晚，栝樓根際土壤微生物群落多樣性及其對(duì)栝樓連作影響方面的研究較少。

本研究擬以非栝樓根際土壤為對(duì)照，以連作2年和連作4年的栝樓根際土壤樣本為研究對(duì)象，檢測(cè)不同土壤樣本理化性質(zhì)的變化，并利用16S和ITS高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)栝樓根際土壤微生物群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)分析，探討連作對(duì)栝樓根際土壤微生物群落組成和多樣性的影響，挖掘影響栝樓連作的微生物類群，以期為揭示栝樓連作障礙的成因及找到緩解方式提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1供試材料

土壤采集地點(diǎn)位于江蘇省淮安市高溝鎮(zhèn)（34°01′N，119°20′E），采集時(shí)間為2020年10月。選取江蘇省栝樓主栽品種皖蔞9號(hào)、皖蔞17號(hào)根際土壤作為研究對(duì)象，分別選擇連作2年和連作4年的栝樓根際土壤進(jìn)行取樣，對(duì)照土壤樣本為取樣地塊周邊未耕作自然土壤。

1.2土壤樣本采集

每個(gè)地塊隨機(jī)選取5個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)選取3株植株，收集位于塊根四周10～20 cm處的根系土壤以及附著在植株根系附近的土壤，隨后將5個(gè)采樣點(diǎn)的樣本充分混合。每個(gè)栝樓品種選取2個(gè)地塊進(jìn)行取樣，即每個(gè)連作時(shí)間采集4份土壤樣本，共獲得土壤樣本12份，其中對(duì)照組（CK）4份，連作2年組（CC2）4份，連作4年組（CC4）4份。將每份土壤樣本分成2份，分別用于土壤微生物測(cè)定和理化性質(zhì)測(cè)定。

1.3土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤樣本全氮含量利用凱氏定氮法測(cè)定，硝態(tài)氮含量利用雙波長(zhǎng)比色法測(cè)定，全磷、速效磷含量利用鉬銻抗比色法測(cè)定，全鉀、速效鉀含量利用ICP-aes法測(cè)定，有機(jī)碳含量利用重鉻酸鉀容量法測(cè)定。利用電位測(cè)定法測(cè)定土壤pH值，利用比色法測(cè)定土壤陽離子交換量（CEC）。

1.4土壤細(xì)菌16S和真菌ITS高通量測(cè)序

土壤細(xì)菌16S和真菌ITS高通量測(cè)序由上海翰宇生物科技有限公司完成。對(duì)土壤樣本進(jìn)行基因組DNA抽提并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)抽提DNA的質(zhì)量濃度和純度。利用Dual-barcode技術(shù)和Illumina PE250測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣本進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

首先，根據(jù)條形碼（Barcode）得到所有樣本的有效序列，過濾read尾部質(zhì)量值為20以下的堿基；其次，根據(jù)雙末端測(cè)序（PE）reads之間的疊連關(guān)系，將成對(duì)的read拼接成一條序列，最小疊連長(zhǎng)度為10 bp，拼接序列的疊連區(qū)允許的最大錯(cuò)配比為0.2；最后，根據(jù)首尾兩端的條形碼和引物區(qū)分樣本，并調(diào)整序列方向，條形碼允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。在此過程中，利用Usearch軟件和Gold數(shù)據(jù)庫(kù)，采用無參和有參結(jié)合的方式去除嵌合體。

將序列根據(jù)97%的相似性進(jìn)行分類操作單元（OTU）劃分，采用RDP classi fier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析。16S細(xì)菌比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為Silva（Release138.1，http：//www.arb-silva.de），ITS真菌比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為Unite（Release 8.2，http：//uni te.ut.ee/index.php）。使用97%相似度的OTU，利用Mothur軟件做稀釋性曲線分析；利用Bray-curtis算法進(jìn)行樣本間基于群落組成的層次聚類分析；利用R語言進(jìn)行主成分分析（PCA），用Vegan軟件包進(jìn)行典型相關(guān)分析（CCA），利用ggplot2軟件包作圖。

2結(jié)果與分析

2.1連作對(duì)栝樓根際土壤理化性質(zhì)的影響

對(duì)不同連作時(shí)間栝樓根際土壤樣本理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定內(nèi)容包括土壤全氮、全磷、全鉀、速效磷、速效鉀、硝態(tài)氮含量以及土壤pH值和CEC。結(jié)果（表1）表明，連作2年組和連作4年組的栝樓根際土壤樣本中速效鉀、硝態(tài)氮含量顯著高于對(duì)照，連作4年組的栝樓根際土壤樣本中速效磷含量顯著高于對(duì)照，但是不同連作時(shí)間栝樓根際土壤樣本中的全氮、全鉀之間沒有顯著差異。土壤有機(jī)碳是通過微生物作用形成的腐殖質(zhì)、動(dòng)植物殘?bào)w和微生物體的合稱，其含量大小具有指示土壤肥力的作用。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，CC4有機(jī)碳含量顯著低于CC2，說明隨著連作時(shí)間的增加，土壤肥力已經(jīng)開始下降。CEC可作為評(píng)價(jià)土壤保肥能力的正向指標(biāo)。表1顯示，土壤陽離子交換量隨著連作時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)，CC4栝樓根際土壤樣本中的CEC較CK下降了7.51%。結(jié)合有機(jī)碳含量測(cè)定結(jié)果，說明隨著連作時(shí)間的延長(zhǎng)，栝樓根際土壤保肥能力逐漸下降。

2.2栝樓根際土壤微生物測(cè)序結(jié)果和多樣性分析

2.2.1測(cè)序結(jié)果分析對(duì)不同連作時(shí)間栝樓根際土壤樣本進(jìn)行細(xì)菌16S和真菌ITS高通量測(cè)序，所有樣本中共得到727 613個(gè)細(xì)菌有效序列，平均長(zhǎng)度446.54 bp，覆蓋度96.3%～98.9%；獲得734 546個(gè)真菌有效序列，平均長(zhǎng)度289.52 bp，覆蓋度99.6%～99.9%（表2）。采用對(duì)序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，使用97%相似度的OTU進(jìn)行稀釋曲線分析。圖1顯示，土壤樣本序列的稀釋曲線逐漸趨于平緩，說明測(cè)序數(shù)據(jù)基本合理，測(cè)序深度包含了樣本中絕大多數(shù)細(xì)菌和真菌類型，能夠反應(yīng)土壤中細(xì)菌和真菌的群落組成。

利用韋恩圖對(duì)不同樣本的OTU進(jìn)行可視化分析，結(jié)果（圖2）表明，CK、CC2、CC4的土壤樣本中細(xì)菌OTU分別有7 278個(gè)、6 839個(gè)和7 212個(gè)，其中所有土壤樣本共有的細(xì)菌OTU有4 285個(gè)，CK、CC2、CC4的土壤樣本獨(dú)有的細(xì)菌OTU分別為1 450個(gè)、980個(gè)和1 422個(gè)；CK、CC2、CC4的土壤樣本中真菌OTU分別有1 355個(gè)、2 137個(gè)和2 045個(gè)，其中共有的真菌OTU有525個(gè)，CK、CC2、CC4的土壤樣本獨(dú)有的真菌OTU分別為528個(gè)、711個(gè)和653個(gè)。表明栝樓根際和連作時(shí)間對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有較大影響。

2.2.2α多樣性分析比較微生物群落α多樣性，利用Chao1指數(shù)指示菌群豐度，利用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)指示菌群多樣性，分析栝樓根際和連作時(shí)間對(duì)土壤微生物群落豐度和多樣性的影響。細(xì)菌群落多樣性分析結(jié)果（圖3）表明，CK、CC2、CC4土壤樣本細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)值分別為5 666.7、5 402.6和5 713.5，Shannon指數(shù)分別為7.32、7.19和7.25，Simpson指數(shù)分別為0.001 67、0.001 93和0.001 73，樣本間無明顯差異。對(duì)真菌群落多樣性進(jìn)行分析，圖3顯示，Chao1指數(shù)最高為CC4，最低為CK；Shannon指數(shù)最高為CC4，最低為CK；Simpson指數(shù)最低的為CC4，最高為CK，說明連作4年的栝樓根際土壤真菌豐度和多樣性最高，其次為連作2年栝樓根際土壤樣本。以上結(jié)果表明栝樓連作會(huì)導(dǎo)致根際土壤真菌豐度和多樣性大幅提高，但是對(duì)細(xì)菌群落的影響相對(duì)較小。

2.2.3β多樣性分析圖4顯示，細(xì)菌群落主成分分析（PCA）中PC1和PC2這2個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為19.6%和14.5%。CK土壤樣本細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)與CC2、CC4存在明顯差異，CC2和CC4的栝樓根際土壤樣本細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)存在交集，說明栝樓根際會(huì)影響栝樓根際土壤細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)，但是連作時(shí)間對(duì)細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)影響相對(duì)較小。所有土壤樣本中真菌群落PCA結(jié)果表明，PC1和PC2這2個(gè)主成分分析的貢獻(xiàn)率分別為13.4%和12.1%，CK土壤樣本真菌群落組成結(jié)構(gòu)與CC2存在明顯差異。與CK和CC2相比，CC4的4個(gè)樣本之間的距離較大，說明群落結(jié)構(gòu)差異較大。以上結(jié)果說明栝樓根際和連作時(shí)間會(huì)對(duì)栝樓根際土壤中真菌群落組成結(jié)構(gòu)造成較大影響。

2.3栝樓根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析

3種土壤樣本中的細(xì)菌被歸類為47個(gè)門、124個(gè)綱、301個(gè)目、495個(gè)科、1 025個(gè)屬和1 693個(gè)種；真菌被歸類為8個(gè)門、30個(gè)綱、80個(gè)目、164個(gè)科、321個(gè)屬和605個(gè)種。

2.3.1不同土壤樣本微生物門水平群落結(jié)構(gòu)分析圖5a顯示，在所有樣本細(xì)菌群落組成的47個(gè)門中，相對(duì)豐度達(dá)到5.0%以上的優(yōu)勢(shì)菌門依次為Proteobacteria（30.8%～34.1%）、Actinobacteriota（13.9%～22.8%）、Gemmatimonadota（10.0%～12.9%）、Bacteroidota（6.9%～9.9%）、Myxococcota（6.5%～8.9%）和Acidobacteriota（5.4%～7.7%）。與CK相比，CC2和CC4的栝樓根際土壤樣本中Proteobacteria、Gemmatimonadota、Myxococcota和Acidobacteriota的相對(duì)豐度均下降，而Actinobacteriota的相對(duì)豐度逐漸增大。除了優(yōu)勢(shì)菌門，一些具有重要功能的細(xì)菌門，如Nitrospirota在CC2和CC4中的相對(duì)豐度與CK相比分別降低了3.5%和34.7%；CC4中Bacteroidota相對(duì)豐度與CK相比降低了17.9%，Chloroflexi相對(duì)豐度與CK相比降低了18.1%。

在所有樣本真菌群落組成的8個(gè)門中，Ascomycota和未歸類真菌門的相對(duì)豐度最高，其次是Mucoromycota、Basidiomycota、Chytridiomycota、Blastocladiomycota、Zoopagomycota和Olpidiomycota（圖5b）。與CK相比，CC2和CC4的栝樓根際土壤樣本中Ascomycota相對(duì)豐度分別減少了15.3%和21.2%，Blastocladiomycota相對(duì)豐度下降了83.8%和79.7%，其余真菌門相對(duì)豐度均明顯增加，Mucoromycota相對(duì)豐度分別增加了1.88倍和3.08倍，Basidiomycota相對(duì)豐度分別增加了3.29倍和6.36倍，Chytridiomycota相對(duì)豐度分別增加了1.81倍和18.6%，Zoopagomycota相對(duì)豐度分別增加了2.12倍和4.51倍。此外，與CK相比，CC2和CC4的栝樓根際土壤樣本中未歸類真菌門的相對(duì)豐度也大幅增加，分別增加了34.5%和32.1%。以上結(jié)果表明，栝樓根際和連作使得栝樓根際微生物群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生了明顯的變化，特別是對(duì)真菌群落的結(jié)構(gòu)和組成影響更為明顯。

2.3.2不同土壤樣本微生物屬水平群落結(jié)構(gòu)分析所有樣本共包含1 025個(gè)細(xì)菌屬和321個(gè)真菌屬。圖6a顯示，在1 025個(gè)細(xì)菌屬中，相對(duì)豐度最高的10個(gè)細(xì)菌屬分別為Gemmatimonadaceae、MND1、MB-A2-108_norank、Haliangium、MBNT15_norank、S0134 terrestrial group、NB1-j_norank、Ellin6067、Gaiella和67-14_norank。與CK相比，CC2、CC4栝樓根際土壤樣本中Gemmatimonadaceae、Haliangium、S0134 terrestrial group細(xì)菌屬相對(duì)豐度均下降；MB-A2-108_norank、NB1-j_norank、Gaiella和67-14_norank細(xì)菌屬相對(duì)豐度均增加；MBNT15_norank相對(duì)豐度先增加后下降。對(duì)相對(duì)豐度最高的10個(gè)細(xì)菌屬進(jìn)行分析，與CC2相比，CC4栝樓根際土壤樣本中除了MBNT15_norank和Ellin6067相對(duì)豐度下降，其余8個(gè)細(xì)菌屬相對(duì)豐度均增加。此外，與CK相比，CC2和CC4非優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中有益細(xì)菌屬Bryobacter的相對(duì)豐度分別下降了67.2%和57.4%；Steroidobacteraceae相對(duì)豐度分別下降了46.5%和48.7%；Nitrospira相對(duì)豐度分別降低了11.7%和15.1%。

圖6b顯示，在所有321個(gè)真菌屬中，除去相對(duì)豐度最高的未歸類真菌屬，在CK土壤樣本中相對(duì)豐度大于5%的優(yōu)勢(shì)真菌屬依次為Zopfiella、Cercophora、Schizothecium和Podospora，而在CC2栝樓根際土壤樣本中相對(duì)豐度大于5%的優(yōu)勢(shì)菌屬依次為L(zhǎng)ophotrichus、Stagonosporopsis、Mortierella、Dendrostilbella和Schizothecium，CC4栝樓根際土壤樣本中相對(duì)豐度大于5%的優(yōu)勢(shì)菌屬為Mortierella和Fusarium。與CK相比，CC2、CC4栝樓根際土壤樣本的真菌群落結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生了巨大變化，一些有害真菌屬的相對(duì)豐度大幅增加，例如Stagonosporopsis的相對(duì)豐度分別增加了85.10倍和25.60倍，Rhizoctonia相對(duì)豐度分別增加了54.80倍和13.70倍，Colletotrichum相對(duì)豐度分別增加了4.82倍和6.00倍，Plectosphaerella相對(duì)豐度分別增加了21.00倍和11.50倍。以上結(jié)果表明，栝樓根際和連作明顯影響根際土壤中細(xì)菌和真菌的豐度和結(jié)構(gòu)，使得部分有益細(xì)菌屬的相對(duì)豐度降低，而部分引起嚴(yán)重病害的真菌屬相對(duì)豐度則大幅增加。

2.4土壤理化性質(zhì)與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的關(guān)系對(duì)各個(gè)樣本不同細(xì)菌屬、真菌屬與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行典型相關(guān)分析（CCA），首先進(jìn)行細(xì)菌屬與土壤理化性質(zhì)的典型相關(guān)分析，對(duì)CCA結(jié)果進(jìn)行置換檢驗(yàn)（置換次數(shù)為999），P=0.011，表明環(huán)境因子顯著影響細(xì)菌物種分布。對(duì)每個(gè)環(huán)境因子進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮含量（P=0.003）、pH值（P=0.026）、全磷含量（P=0.050）和速效磷含量（P=0.020）4個(gè)因素對(duì)栝樓根際土壤細(xì)菌分布具有顯著影響。對(duì)真菌屬與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行典型相關(guān)分析，對(duì)CCA結(jié)果進(jìn)行置換檢驗(yàn)（置換次數(shù)為999），P=0.007，說明環(huán)境因子顯著影響真菌物種分布。對(duì)每個(gè)環(huán)境因子進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮含量（P=0.035）、速效磷含量（P=0.042）和CEC（P=0.001）3個(gè)因素對(duì)栝樓根際土壤真菌分布具有顯著影響。圖7顯示，硝態(tài)氮含量、全磷含量和速效磷含量是栝樓根際土壤微生物群落多樣性的主要影響因素；pH值、CEC是CK土壤微生物群落多樣性的主要影響因素。

3討論

許多與植物相關(guān)的微生物會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收、病害以及產(chǎn)量產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，這些微生物甚至被稱為植物微生物組或者植物的另一個(gè)基因組[17]。同時(shí)，植物根系會(huì)對(duì)根際土壤的生物、理化性質(zhì)產(chǎn)生影響[21]，這種影響會(huì)反饋于土壤微生物，從而影響他們的結(jié)構(gòu)和活性[17]。連作會(huì)對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生巨大影響，包括影響微生物群落結(jié)構(gòu)等，這種改變可能會(huì)導(dǎo)致土壤肥力下降，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的植物病蟲害[15-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，栝樓連作障礙的產(chǎn)生與栝樓根際土壤真菌和細(xì)菌比例失衡、真菌結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化以及有害真菌相對(duì)豐度大幅增加緊密相關(guān)。與對(duì)照土壤樣本相比，連作2年和連作4年的栝樓根際土壤樣本中真菌OTU數(shù)目增加，而細(xì)菌OTU數(shù)量稍有下降。目前的研究結(jié)果表明，很多土壤細(xì)菌在植物生長(zhǎng)過程中起重要的作用[17]，如變形菌門在土壤碳、氮、硫循環(huán)中均起著關(guān)鍵的作用[22]，放線菌具有分解纖維素和木質(zhì)素的功能，同時(shí)還具有固氮和解磷作用[23-31]；大多數(shù)土壤真菌對(duì)于植物的生長(zhǎng)是不利的[19-20]。因此，栝樓連作土壤樣本中真菌豐度和多樣性的提高，說明隨著連作時(shí)間的增加，栝樓生存環(huán)境正在逐漸惡化。

在本研究中，連作的栝樓根際土壤微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，其中變化最為明顯的是真菌群落結(jié)構(gòu)。真菌群落結(jié)構(gòu)變化包括一些有害真菌屬相對(duì)豐度的大幅上升。相比對(duì)照土壤樣本，連作2年和連作4年的栝樓根際土壤樣本中Stagonosporopsis的相對(duì)豐度分別增加了85.10倍和25.60倍，該真菌屬與葫蘆科植物蔓枯病和菊科植物的射線枯萎病有關(guān)[32-33]；Rhizoctonia相對(duì)豐度增加了54.80倍和13.70倍，該菌屬與煙草葉斑病和根腐病關(guān)聯(lián)緊密[34]；Colletotrichum相對(duì)豐度分別增加了4.82倍和6.00倍，該菌屬會(huì)引起植物炭疽病和枯萎病[35]；Plectosphaerella相對(duì)豐度分別增加了21.00倍和11.50倍，該菌屬與作物根腐病緊密相關(guān)[36]。本研究結(jié)果表明，栝樓連作對(duì)栝樓根際土壤中真菌結(jié)構(gòu)和多樣性的影響非常明顯，會(huì)導(dǎo)致栝樓根際土壤中真菌結(jié)構(gòu)失衡，大量有害真菌相對(duì)豐度大幅提升，從而導(dǎo)致栝樓發(fā)生嚴(yán)重的病蟲害。

除了有害真菌相對(duì)豐度的增加，一些有益菌相對(duì)豐度的下降，也與栝樓連作障礙具有一定的相關(guān)性。CC4中Bacteroidota和Chloroflexi等具有代謝營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和通過光合作用產(chǎn)能等功能的細(xì)菌門類[37-39]，相對(duì)豐度與對(duì)照相比也有不同程度的降低，說明栝樓連作土壤的代謝功能、產(chǎn)能等可能均受到了影響。硝化菌門的Nitrospira和Nitrosospira在土壤微生物的氮代謝中起著主導(dǎo)作用，也是響應(yīng)缺氮脅迫的土壤微生物標(biāo)志物[40-41]。在本研究中，連作2年和連作4年的栝樓根際土壤樣本中Nitrospira相對(duì)豐度較對(duì)照土壤分別降低了11.7%和15.1%。該研究結(jié)果與土壤樣本中氮含量的變化相反，說明栝樓可能面臨著缺氮脅迫，而這種脅迫并不是土壤氮含量導(dǎo)致的，而是土壤中微生物氮素分解和利用能力降低所導(dǎo)致的。今后應(yīng)將提高栝樓栽培土壤氮素分解和利用能力作為栝樓連作障礙緩解和土壤改良的目標(biāo)之一。

栝樓根際土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)具有緊密的相關(guān)性。CCA結(jié)果表明，細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)與硝態(tài)氮含量、全磷含量、速效磷含量和pH值緊密相關(guān)；真菌群落組成和結(jié)構(gòu)與硝態(tài)氮含量、速效磷含量和CEC緊密相關(guān)。氮和磷在植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有非常重要的作用，同時(shí)也對(duì)土壤微生物群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)具有深遠(yuǎn)的影響[42-43]。本研究結(jié)果表明，硝態(tài)氮含量、全磷含量和速效磷含量是栝樓根際土壤微生物群落多樣性的主要影響因素；pH值、CEC是CK土壤微生物群落多樣性的主要影響因素。本研究還發(fā)現(xiàn)，土壤pH值對(duì)細(xì)菌群落多樣性影響明顯高于真菌群落多樣性，而CEC對(duì)真菌群落多樣性影響高于細(xì)菌群落多樣性。土壤pH值對(duì)土壤酶活性、土壤養(yǎng)分的釋放和轉(zhuǎn)運(yùn)等均有影響，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。由于適宜真菌生長(zhǎng)的pH值范圍較大（3.0～8.0），而適宜細(xì)菌生長(zhǎng)的pH值范圍則相對(duì)較小，因此pH值的改變對(duì)真菌群落多樣性影響較小[44]。由于真菌的菌絲具有高結(jié)合陽離子能力，不同種類的真菌對(duì)陽離子吸附能力存在著較大的差異并且對(duì)作物和環(huán)境存在一定的依賴，因此土壤CEC的變化對(duì)于真菌群落的影響較大[45]。

在本研究中，連作2年和連作4年的栝樓根際土壤樣本中真菌的組成和結(jié)構(gòu)也存在著較大的差異，除了受到栝樓根際和連作時(shí)間的影響外，人為操作也是該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因之一。由于栝樓連作3年以上就會(huì)出現(xiàn)病害嚴(yán)重和產(chǎn)量下降的現(xiàn)象，因此農(nóng)民在栽培過程中會(huì)通過增施有機(jī)肥和增加農(nóng)藥施用量等措施來保證連作3年以上栝樓產(chǎn)量，從而導(dǎo)致本研究中土壤樣本之間的較大差異。該現(xiàn)象說明栝樓根際土壤微生物菌落多樣性是可以通過采取不同措施進(jìn)行改變的。下一步將研究不同栽培措施、土壤養(yǎng)分、添加劑對(duì)土壤細(xì)菌和有害真菌豐度、多樣性的影響，以期通過降低栝樓根際土壤有害微生物的相對(duì)豐度，提高有益微生物的相對(duì)豐度，從而緩解栝樓連作障礙。

4結(jié)論

栝樓連作會(huì)造成其根際土壤養(yǎng)分和理化性質(zhì)發(fā)生變化。同時(shí)，根際微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生巨大的變化，表現(xiàn)為一些有害真菌屬（如Stagonosporopsis、Rhizoctonia和Colletotrichum）的相對(duì)豐度成倍增長(zhǎng)，一些有益細(xì)菌門（如Bacteroidota、Chloroflexi和Nitrospirota等）的相對(duì)豐度下降，這可能是造成栝樓連作障礙和病蟲害頻發(fā)的原因之一。典型相關(guān)分析結(jié)果表明，硝態(tài)氮含量、全磷含量和速效磷含量是栝樓根際土壤微生物群落多樣性的主要影響因素；pH值、CEC是CK土壤微生物群落多樣性主要影響因素。本研究結(jié)果揭示了栝樓連作障礙的產(chǎn)生可能是根際土壤微生物群落組成和豐度失衡，有害真菌大量積累導(dǎo)致的，可以為下一步緩解栝樓連作障礙提供技術(shù)支撐。

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（責(zé)任編輯：王妮）