馬鈴薯GA2ox家族基因響應(yīng)赤霉素（GA）和低溫脅迫表達(dá)分析

劉計濤　王夢詩　索海翠　王麗　單建偉　李成晨　安康　李小波

摘要：本研究基于結(jié)構(gòu)域篩選馬鈴薯（Solanum tuberosum）基因組，獲得13個StGA2ox基因家族成員。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，StGA2ox家族基因分為C19和C20 2個家族，其中C19又分為2個亞族，13個StGA2ox基因不均勻得分布于8條染色體上，其中有5對共線性基因?qū)Γ?號染色體上有3個基因形成1個串聯(lián)重復(fù)基因簇。此外，StGA2ox啟動子區(qū)域存在響應(yīng)低溫脅迫、植物激素等多種順式作用元件。利用實(shí)時熒光定量PCR方法分析外源GA₃和低溫脅迫處理條件下StGA2ox表達(dá)模式，所有StGA2ox基因均能夠被外源GA₃誘導(dǎo)表達(dá)，其中StGA2ox2、StGA2ox4、StGA2ox8、StGA2ox9和StGA2ox10受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)顯著上調(diào)，暗示著這5個基因在調(diào)節(jié)馬鈴薯低溫脅迫耐性中發(fā)揮重要功能，可以作為進(jìn)一步開展馬鈴薯耐低溫研究的候選基因。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；GA2ox基因；生物信息學(xué)分析；赤霉素（GA）；低溫脅迫

中圖分類號：S532文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2023）05-1110-10

Expression analysis of GA2ox family genes in response to gibberellin （GA） and cold stress in potatoLIU Ji-tao，WANG Meng-shi，SUO Hai-cui，WANG Li，SHAN Jian-wei，LI Cheng-chen，AN Kang，LI Xiao-bo

（Crops Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Crops Genetics and Improvement of Guangdong Province， Guangzhou 510640， China）

Abstract：In this study， 13 StGA2ox family members were obtained by domain screening of the potato genome. Bioinformatics analysis showed that StGA2ox family genes were divided into two families， C19 and C20， and C19 was divided into two subfamilies. The 13 StGA2ox genes which were unevenly distributed on eight chromosomes， including five pairs of collinear gene pairs. And three genes on chromosome 7 formed a tandem repeat gene cluster. In addition， there were several cis-acting elements in the promoter region of StGA2ox in response to cold stress， phytohormones and so on. Real-time PCR was used to analyze the expression pattern of StGA2ox in potato under exogenous GA₃and cold stress treatment. All StGA2ox genes could be induced by exogenous GA₃. Among them， StGA2ox2， StGA2ox4， StGA2ox8， StGA2ox9 and StGA2ox10 were significantly up regulated by cold stress， suggesting that these five genes played an important role in regulating the cold stress tolerance of potato and could be used as candidate genes for further research on cold stress tolerance of potato.

Key words：potato；GA2ox gene;bioinformatic analysis；gibberellin （GA）;cold stress

馬鈴薯是中國重要的糧食作物，在保障國家糧食安全上起著重要的作用[1]。但是，隨著全球氣候的變化，低溫脅迫已經(jīng)成為制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。已經(jīng)有研究結(jié)果表明，許多植物激素如油菜素內(nèi)酯（BR）、赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、細(xì)胞分裂素（CK）和乙烯（ET）等參與植物對低溫等非生物脅迫的響應(yīng)[2-4]，其中GA在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育與非生物脅迫響應(yīng)的平衡中起著重要作用[5]。高等植物中活性GA的主要成分是GA₁、GA₃、GA₄和GA₇[6]，其主要功能包括促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長、種子萌發(fā)以及植物營養(yǎng)和生殖生長[7-10]。此外，GA還參與植物低溫脅迫耐性調(diào)節(jié)[11-12]，如在擬南芥、番茄、薺菜和棉花中過表達(dá)CBF1，促進(jìn)DELLA蛋白的積累，抑制了GA信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，提升了植物低溫脅迫耐性[11，13-15]。擬南芥和水稻GA不敏感突變體gai表現(xiàn)出較強(qiáng)低溫脅迫耐性[11-12]。這些結(jié)果表明，植物通過抑制GA信號傳導(dǎo)提升低溫脅迫耐性。

赤霉素2-氧化酶（GA2ox）是調(diào)節(jié)活性GA降解的主要功能酶，在調(diào)節(jié)植物低溫脅迫耐性中發(fā)揮重要功能[11，16-18]。GA2ox能夠?qū)⒒钚訥A1和GA3轉(zhuǎn)變?yōu)槭Щ畹腉A8和GA34，或促進(jìn)GA合成前體的降解[16，19]，在擬南芥、水稻、梨和山茶中，過表達(dá)GA2ox能夠抑制GA的合成，提升植物低溫或干旱等非生物脅迫耐性[20-23]。GA2ox家族從屬于2OG-Fe（Ⅱ）oxygenase超家族，含有2OG-Fe Ⅱ（PF03171）結(jié)構(gòu)域[24]，GA2ox家族普遍存在于植物中，如在擬南芥、水稻、棉花、二穗短柄草和苜蓿中均被報道[25-29]?；诎被嵝蛄械倪M(jìn)化樹分析將GA2ox基因家族分為3個亞族：C19-Ⅰ，C19-Ⅱ和C20[25，30-31]。研究發(fā)現(xiàn)，GA2ox基因家族的擴(kuò)大源于單子葉植物和雙子葉植物基因組的加倍[32]，這導(dǎo)致不同成員存在功能冗余和表達(dá)差異的現(xiàn)象，這有利于植物提升低溫等非生物脅迫耐性[33-36]。

目前，在玉米、水稻、葡萄、擬南芥、棉花和桃等植物中，已經(jīng)對GA2ox家族基因進(jìn)行了系統(tǒng)分析[29，37-41]，但在馬鈴薯中關(guān)于GA2ox家族基因的分布、結(jié)構(gòu)和功能尚未有詳細(xì)報道。因此，本研究基于馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)，全面解析StGA2ox基因家族的成員數(shù)量、基因特征、染色體上的位置、系統(tǒng)發(fā)育樹以及編碼的蛋白質(zhì)理化特性、亞細(xì)胞定位等，同時對其響應(yīng)低溫脅迫和GA的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探究StGA2ox的功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試馬鈴薯品種為費(fèi)烏瑞它（購于天津市天興佳業(yè)科技有限公司），將種薯切分為25～30 g且包含至少1個芽眼的小塊，然后在光照培養(yǎng)箱（達(dá)斯卡特 DGZC-P1000B）進(jìn)行盆栽，基質(zhì)由草炭土和蛭石2∶1（質(zhì)量比）混合而成，光照模式為16 h光照，光照度為12 000 lx。

1.2低溫脅迫與外源GA處理

低溫脅迫處理：選取24株4周大的馬鈴薯盆栽苗，平均分為6組，每組4個生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行低溫（-2 ℃）脅迫處理，分別將幼苗置于低溫0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后，取頂部向下第3～4片功能葉于液氮中備用。

外源GA處理：選取長勢一致的盆栽苗28棵，用100 μmol/L赤霉素（GA₃）噴施葉面1次，每組4個生物學(xué)重復(fù)，處理后0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h分別取葉片于液氮中備用。

1.3StGA2ox基因家族成員鑒定

從馬鈴薯參考基因組數(shù)據(jù)庫Spud DB Potato Genatics Resources（http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/index.shtml）下載馬鈴薯基因組、CDS、StGA2ox基因的染色體位置信息和氨基酸序列。并利用2OG-FeⅡ（PF03171）結(jié)構(gòu)域篩選馬鈴薯基因組內(nèi)StGA2ox基因家族成員，并利用SMART確認(rèn)篩選出的成員編碼的蛋白質(zhì)是否含有2OG-FeⅡ結(jié)構(gòu)域，參考擬南芥、番茄GA2oxs蛋白氨基酸序列進(jìn)行blastp比對，最終確定馬鈴薯特異的StGA2ox基因家族成員。

1.4StGA2ox家族基因生物信息學(xué)分析

采用在線分析工具WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）分析StGA2ox家族基因編碼蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/）分析StGA2ox家族基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)。在馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫中查找StGA2ox基因的染色體位置信息及對應(yīng)染色體信息，利用TBtools軟件（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools/releases）進(jìn)行StGA2ox基因染色體定位和基因共線性分析。利用Gene Structure Display Server v2.0 （http：//gsds.gao-lab.org/）對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。進(jìn)化樹采用MEGA7.0（http：//www.megasoftware.net/），以鄰接法（Neighbor-Joining method）和Poission模式（Poission Modle）構(gòu)建。結(jié)構(gòu)域分析采用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme/）在線分析，然后利用TBtools軟件作圖。

1.5基因表達(dá)分析

采用實(shí)時熒光定量PCR（Real-time PCR）方法檢測StGA2ox的表達(dá)模式。將處理的樣本采用Trizol（TaKaRa）法提取馬鈴薯葉片RNA，分別采用試劑盒GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2 （TSK302M，擎科生物，廣州）和2×TSINGKE? Master SYBR Green I qPCR Mix-UDG （Without ROX）（TSE204，擎科生物，廣州）進(jìn)行cDNA合成和qPCR擴(kuò)增，基因相對表達(dá)量計算采用2-△△Ct方法，差異顯著分析采用t-test（P＜0.05）進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1StGA2ox家族基因鑒定

通過Pfam對2OG-FeII（PF03171）結(jié)構(gòu)域篩選獲得候選基因，然后通過參考已報道的擬南芥、水稻、玉米和番茄GA2ox蛋白氨基酸序列blastp比對，最后確定13個編碼StGA2ox蛋白的基因。根據(jù)這些基因在染色體上的位置分布，分別命名為StGA2ox1～StGA2ox13（表1）。通過蛋白質(zhì)理化特性分析，發(fā)現(xiàn)StGA2ox蛋白的氨基酸數(shù)為324～359 aa，相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為3.624×104～4.188×104和5.61～8.64，不穩(wěn)定性系數(shù)為33.43～55.95，脂溶指數(shù)和親水性指數(shù)為72.48～89.97和-0.519～-0.184。通過預(yù)測，StGA2oxs蛋白是一類穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，StGA2ox1、StGA2ox2、StGA2ox4、StGA2ox6、StGA2ox7、StGA2ox10、StGA2ox12和StGA2ox13定位于細(xì)胞核，StGA2ox3、StGA2ox5和StGA2ox9定位于細(xì)胞質(zhì)，StGA2ox8和StGA2ox11定位于質(zhì)體中。

2.2不同物種GA2ox家族基因進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步解析擬南芥、水稻、玉米、番茄和馬鈴薯GA2ox家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用MAGE 7.0軟件對各物種中GA2ox家族基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。結(jié)果表明，GA2ox基因家族可以分為C19和C20兩類，其中C19類GA2oxs基因又分為Ⅰ和Ⅱ兩個亞家族，C19-Ⅰ亞族包含成員最多，共計23個，涉及擬南芥、水稻、玉米、番茄和馬鈴薯5個物種，C20家族包含15個成員，除番茄外其他4個物種均有分布，C19-Ⅱ亞族包含成員最少，包含12個成員（表2）。

馬鈴薯GA2ox家族基因在3個亞族分類中均有分布，其中StGA2ox4、StGA2ox5、StGA2ox7和StGA2ox12屬于C20家族，StGA2ox1、StGA2ox2和StGA2ox6屬于C19-Ⅱ亞族，其余StGA2ox基因?qū)儆贑19-Ⅰ亞族。此外，在C19-Ⅰ亞族中StGA2ox3、StGA2ox8～StGA2ox13與SlGA2ox2、SlGA2ox4、SlGA2ox5親緣關(guān)系較近且處在同一分支，在C19-Ⅱ亞族中StGA2ox1、StGA2ox2、StGA2ox6和SlGA2ox1、SlGA2ox3親緣關(guān)系最近，在同一分支，在C20家族中StGA2ox4、StGA2ox5、StGA2ox12與AtGA2ox8親緣關(guān)系最近，StGA2ox7與AtGA2ox10緊鄰。這些結(jié)果表明馬鈴薯GA2ox家族基因與同屬茄科的番茄親緣關(guān)系最近。

2.3StGA2ox基因染色體定位與共線性分析

根據(jù)StGA2ox基因家族基因組信息，通過TBtools軟件進(jìn)行染色體可視化定位和共線性分析（圖2）。13個StGA2ox基因分布在8條染色體上，其中1號、2號和10號染色體上分別含有2個成員，4號、5號、6號和8號染色體上只含有1個成員，7號染色體上包含StGA2ox8、StGA2ox9和StGA2ox10 3個基因，由于其在染色體上的物理距離小于100 kb，且進(jìn)化樹分析其同源性較高，推斷其為一個串聯(lián)的基因簇。進(jìn)一步分析馬鈴薯StGA2ox基因家族的擴(kuò)張模式和基因復(fù)制事件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，13個StGA2ox基因之間存在5對共線性基因?qū)?，表明馬鈴薯StGA2ox基因家族在進(jìn)化過程中存在基因復(fù)制現(xiàn)象，導(dǎo)致基因家族的多樣性。

2.4StGA2ox家族基因結(jié)構(gòu)和Motif分析

對馬鈴薯13個StGA2ox基因家族成員進(jìn)行系統(tǒng)基因結(jié)構(gòu)和Motif分析（圖3），結(jié)果表明，除去StGA2ox4包含3個內(nèi)含子4個外顯子外，其余所有StGA2ox均包含2個內(nèi)含子3個外顯子，其中StGA2ox1不包含非編碼區(qū)。進(jìn)一步分析StGA2ox蛋白氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)所有基因均包含motif 1和motif 3，C20家族基因不包含motif 4，motif 10主要存在于C19-Ⅱ亞族基因中，而motif 5主要存在于C19-Ⅰ亞族基因中。

2.5馬鈴薯StGA2ox基因啟動子cis-element分析

為進(jìn)一步解析StGA2ox家族基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)機(jī)制，根據(jù)馬鈴薯基因組獲得1.5 kb啟動子序列，并通過PLACE網(wǎng)站進(jìn)行分析。結(jié)果（圖4）表明，StGA2ox基因啟動子區(qū)域富含響應(yīng)植物激素的順式作用元件，包括脫落酸（ABA）響應(yīng)元件ABRE、赤霉素（GA）響應(yīng)元件GARE、茉莉酸（JA）響應(yīng)元件JARE、乙烯（ET）響應(yīng)元件ERE、小楊酸（SA）響應(yīng)元件SARE和生長素（Auxin）響應(yīng)元件ARE；還包含生長發(fā)育相關(guān)順式作用元件I-box、LAMP和G-box等，以及MYC、LTR和W-box等逆境脅迫相關(guān)順式作用元件。其中，除StGA2ox6和StGA2ox8外，所有StGA2ox啟動子上都含有GA響應(yīng)順式作用元件GARE，StGA2ox1～StGA2ox4和StGA2ox9～StGA2ox12都含有低溫脅迫響應(yīng)順式作用元件LTR，這一結(jié)果暗示著StGA2ox家族基因在響應(yīng)GA和低溫脅迫上可能發(fā)揮重要功能，但是家族成員之間的功能存在差異。

2.6StGA2ox響應(yīng)GA處理和低溫脅迫的表達(dá)模式分析為了進(jìn)一步解析StGA2ox家族基因響應(yīng)GA和低溫脅迫的表達(dá)模式，通過RT-PCR方法分析低溫脅迫24 h和外源GA₃處理后48 h馬鈴薯葉片中13個StGA2ox基因的表達(dá)。在外源GA₃處理條件下，StGA2ox1、StGA2ox2和StGA2ox6基因的表達(dá)在處理后3 h顯著上調(diào)，隨后又降低，在GA₃處理3 h后分別為對照的6.56倍、41.68倍和2.36倍；StGA2ox3和StGA2ox8～StGA2ox13基因在GA₃處理后0～6 h表達(dá)上調(diào)，12～48 h又逐漸降低，最終在48 h恢復(fù)至0 h的水平，在處理后6 h表達(dá)量是對照的5.89～27.29倍，其中StGA2ox12表達(dá)量變化最小，StGA2ox13表達(dá)量變化最大；StGA2ox4和StGA2ox5基因在GA₃處理后0～12 h表達(dá)量上調(diào)，12～48 h表達(dá)量逐漸降低，在處理后12 h表達(dá)量分別為對照的73.19倍和16.2倍；另外，StGA2ox7的表達(dá)量僅在GA₃處理后6 h迅速上調(diào)至對照的20.85倍，隨后迅速降至對照的90%（圖5）。

在低溫脅迫條件下，StGA2ox1、StGA2ox3、StGA2ox11和StGA2ox12基因的表達(dá)被抑制，低溫脅迫6 h，StGA2ox1、StGA2ox3、StGA2ox11表達(dá)量最低，下調(diào)50%、61%、78%；而StGA2ox2、StGA2ox4和StGA2ox8～StGA2ox10基因的表達(dá)量受低溫脅脅迫誘導(dǎo)上調(diào)，并且在低溫脅迫24 h后，分別上調(diào)了8.68倍、20.28倍、6.84倍、14.62倍和6.44倍；StGA2ox6的表達(dá)量在低溫脅迫1 h后達(dá)到對照的2.29倍，隨后又降低至0 h的水平；StGA2ox7的表達(dá)量在0～12 h差異不顯著，僅在24 h下調(diào)63%（圖6）。綜上所述，StGA2ox家族基因在響應(yīng)GA3和低溫脅迫中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，為充分理解馬鈴薯StGA2ox家族基因的功能提供了依據(jù)。

3討論

馬鈴薯是重要的糧菜兼用型經(jīng)濟(jì)作物，具有產(chǎn)量高、效益好和營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)［42-45］。低溫寒害是影響馬鈴薯產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一，中國幾乎所有馬鈴薯生態(tài)種植區(qū)都會受其影響。GA是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育重要的植物激素，廣泛參與植物對低溫脅迫等非生物脅迫的響應(yīng)[17]。GA2-oxidases是調(diào)節(jié)植物活性GA鈍化的關(guān)鍵酶之一，能夠降低植物活性GA含量，負(fù)調(diào)控植物的生長發(fā)育，參與低溫、干旱等非生物脅迫響應(yīng)[41]。GA2ox家族基因編碼的蛋白質(zhì)包含2OG-FeⅡ（PF03171）結(jié)構(gòu)域，從屬于20G-Fe（Ⅱ） oxygenase基因超家族[24]。目前，許多物種中已經(jīng)進(jìn)行了全基因組家族分析，如擬南芥中鑒定出10個AtGA2ox基因，荔枝中鑒定出9個LcGA2ox基因[28，46]，水稻中包含10個成員[25]，玉米中鑒定到分布于7個染色體上的13個ZmGA2ox基因[40]。

在本研究中，基于馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)共獲得13個StGA2ox基因，進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，StGA2ox基因家族分為2個家族，其中C19家族又分為C19-Ⅰ亞族和C19-Ⅱ亞族，這與其他作物中的研究結(jié)果一致[39]。分析基因家族成員的結(jié)構(gòu)和保守motif序列，能夠?yàn)楦娼忉尰蚣易暹M(jìn)化和功能分化提供重要依據(jù)[47]，研究發(fā)現(xiàn)，StGA2ox不同亞家族之間基因結(jié)構(gòu)和保守motif序列存在顯著差異，在玉米、水稻和荔枝等作物中也有相同的結(jié)果[25，28，40]。為了進(jìn)一步明確馬鈴薯StGA2ox基因家族的基因組信息，通過染色體定位發(fā)現(xiàn)這13個StGA2ox基因主要分布于8條染色體上，并在7號染色體上存在一個串聯(lián)基因簇。此外，共線性分析結(jié)果表明，StGA2ox存在5對共線性基因?qū)?，表明其在進(jìn)化中存在基因復(fù)制現(xiàn)象，這些結(jié)果可為深入理解StGA2ox基因家族的進(jìn)化過程提供參考。

植物通過合成或鈍化維持內(nèi)源GA相對平衡，保障植物正常的生長發(fā)育進(jìn)程[16]，GA2ox基因能夠負(fù)反饋調(diào)節(jié)活性GA的動態(tài)平衡，促進(jìn)植物的正常生長[17]。研究結(jié)果表明，所有的StGA2ox基因都能夠被外源GA誘導(dǎo)表達(dá)，且表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，但是不同家族基因存在顯著差異，如C19-Ⅱ亞族基因StGA2ox1、StGA2ox2、StGA2ox6的表達(dá)對外源GA處理響應(yīng)最早，其次為C19-Ⅰ亞族基因StGA2ox3、StGA2ox11和StGA2ox13，最晚響應(yīng)的是C20家族基因StGA2ox4和StGA2ox5。此外，GA2ox作為調(diào)節(jié)植物活性GA的重要基因，廣泛參與了激素信號傳導(dǎo)和非生物脅迫響應(yīng)[41]。例如，低溫脅迫能夠促進(jìn)OsGA2ox6和OsGA2ox7基因表達(dá)，使活性GA鈍化[48]，ZmGA2ox6和ZmGA2ox10能夠被低溫脅迫和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[41]。研究發(fā)現(xiàn)StGA2ox2、StGA2ox4、StGA2ox8、StGA2ox9和StGA2ox10受低溫脅迫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，暗示這5個基因在調(diào)節(jié)馬鈴薯低溫脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用?；虻谋磉_(dá)受上游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，順式作用元件是影響基因表達(dá)的重要因素[49]。通過啟動子分析發(fā)現(xiàn)響應(yīng)GA的GARE順式作用元件存在于所有StGA2ox啟動子上，并且在StGA2ox1～StGA2ox4和StGA2ox9～StGA2ox12的啟動子上存在響應(yīng)低溫脅迫的LTR順式作用元件，這與玉米、水稻和高粱等作物中的研究結(jié)果一致[41]。綜上所述，本研究結(jié)果能夠?yàn)榻馕鲴R鈴薯StGA2ox基因通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)活性GA動態(tài)平衡，參與調(diào)節(jié)低溫脅迫響應(yīng)的作用機(jī)理提供依據(jù)，有助于馬鈴薯寒害預(yù)防理論的完善。

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