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    易錯PCR提高粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A1活性

    2016-09-07 02:10:26王玉滿薛正蓮蘇燕南安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院安徽蕪湖241000
    安徽工程大學(xué)學(xué)報 2016年4期
    關(guān)鍵詞:沙雷氏卡那霉素磷脂酶

    王玉滿,薛正蓮,王 洲,蘇燕南,朱 昊(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

    易錯PCR提高粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A1活性

    王玉滿,薛正蓮?,王洲,蘇燕南,朱昊
    (安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖241000)

    利用易錯PCR技術(shù)對來自粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06的磷脂酶A1基因plaB進行定向改造,通過引入不同濃度Mg2+、Mn2+得到的易錯PCR產(chǎn)物與表達型質(zhì)粒p ET-28a(+)重組,構(gòu)建磷脂酶A1突變文庫,篩選出高酶活突變株EPB8.該突變酶相對野生酶酶活提高了22.5%,并對突變株EPB8產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化,優(yōu)化后酶活較野生酶酶活提高41%.序列分析表明:plaB基因有11個堿基發(fā)生突變,導(dǎo)致7個氨基酸發(fā)生突變,其中磷脂酶A1蛋白有3個氨基酸突變,分別是Y97C、P98S、X228L,輔助蛋白有4個氨基酸突變,分別是P46L、Q58L、N136D、H233R.該實驗結(jié)果為進一步在分子水平定向提高磷脂酶A1的活性奠定了基礎(chǔ),也為該酶在其他高表達系統(tǒng)中的表達提供了素材.

    粘質(zhì)沙雷氏菌;磷脂酶A1;易錯PCR;產(chǎn)酶條件優(yōu)化

    磷脂酶A1是一類專一水解磷脂sn-1位酰基產(chǎn)生溶血磷脂和自由脂肪酸的酶類[1],可以用于植物脫膠和磷脂改性方面[2],其水解產(chǎn)物溶血磷脂是優(yōu)良的乳化劑、食品添加劑和抗菌劑,廣泛運用在食品、化妝品、醫(yī)藥等各個方面[3].隨著磷脂酶的工業(yè)應(yīng)用廣泛,對其研究也日益增多.由于自然界篩選的菌株酶活不高、產(chǎn)量低,需進一步提高.隨著分子技術(shù)水平的提高,與磷脂酶克隆表達相關(guān)的報道也隨之增多.Michael Givskov[4]等提取液化沙雷氏菌磷脂酶A1基因在大腸桿菌克隆表達,但酶活不到1 U/m L.Jae Kwang Song[5]等構(gòu)建基因文庫成功克隆Serratia sp.MK中磷脂酶A1基因,并在大腸桿菌中表達,但表達量最高為2.21 ug/m L培養(yǎng)基.付建紅[6]等將Serratia sp.xiF1內(nèi)的磷脂酶A1基因分別在大腸桿菌和畢赤酵母中進行表達,在畢赤酵母中表達的重組酶在3.7 L發(fā)酵罐中磷脂酶A1活力達41.8 U/m L.但這些還不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需求,因此,通過蛋白質(zhì)工程手段對磷脂酶進行體外分子改造提高酶活性、穩(wěn)定性及其產(chǎn)量具有重要意義.由于還未知磷脂酶的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,故研究采用易錯PCR技術(shù)改造磷脂酶的分子結(jié)構(gòu).易錯PCR可以體外篩選突變蛋白達到迅速提高酶活力的目的,同時改善酶的一系列性質(zhì)[7].王穎秋[8]等運用易錯PCR方法提高了頭孢菌素C酰化酶活力.劉韓[9]等運用易錯PCR方法提高土芽孢桿菌ZH1羧酸酯酶的熱穩(wěn)定性.Stephens[10]等運用易錯PCR方法改善了真菌木聚糖酶的耐堿性和耐熱性.研究以粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06基因組為模板,擴增得到含輔助蛋白的磷脂酶A1基因plaB為研究對象,以期通過易錯PCR法提高酶活.

    1 材料與方法

    1.1材料

    (1)菌株和質(zhì)粒.粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06由安徽工程大學(xué)微生物實驗室篩選保存;宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)、JM109、質(zhì)粒pET-28a由安徽工程大學(xué)微生物實驗室保存;工程菌BP28/BL21(plaB-p ET-28a/ BL21(DE3))由安徽工程大學(xué)微生物實驗室構(gòu)建保存.

    (2)酶和試劑.PCR系列試劑、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、酶等購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;GeneRuler DNA Ladder Mix、T4 Ligase、限制性內(nèi)切酶購自Thermo,其他試劑均為國產(chǎn)分析純;引物合成由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成.

    (3)培養(yǎng)基.LB培養(yǎng)基:酵母粉5 g(0.5%)、胰蛋白胨10 g(1%)、NaCl 10 g(1%)加水至1 L,p H調(diào)至7.0,固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉;PLB培養(yǎng)基:卵磷脂20 g(2%)、胰蛋白胨10 g(1%)、NaCl 10 g(1%)、酵母粉5 g(0.5%)、0.02%溴甲酚紫(3%)、25 mmol/L CaCl2、1 000 m L蒸餾水,p H調(diào)至7.0;卵磷脂用高速勻漿機乳化后單獨滅菌,固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉;卡那霉素(Kna)儲存質(zhì)量濃度為50 mg/m L,其工作質(zhì)量濃度為50 ug/m L.

    1.2方法

    (1)易錯PCR法擴增磷脂酶A1(plaB)基因.以粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06基因組為模板,利用易錯PCR對目的基因引入突變,目的基因的上游引物:(劃線部位為Bam HⅠ的酶切位點),下游引物為(劃線部分為HindⅢ的酶切位點).50 u L的易錯PCR反應(yīng)體系:5 u L 10×PCR Buffer(無Mg2+)、7 mmol/L MgCl2、0.1 mmol/L MnCl2、5 U Taq DNA Polymerase、上下游引物各10 pmol、模板DNA 20 ng,補dd H2O至50 u L.反應(yīng)程序為95℃5 min,95℃30 s,55℃30 s,72℃2 min,72℃8 min,35個循環(huán),PCR產(chǎn)物檢測后并回收,進行下一步實驗.

    (2)突變文庫的構(gòu)建.將純化后易錯PCR產(chǎn)物和載體pET-28a質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、HindⅢ進行消化,經(jīng)過T4連接酶連接后,隨即轉(zhuǎn)入宿主菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于帶有卡那霉素(50 ug/m L)的LB平板上,37℃倒置培養(yǎng)12~16 h.將平板上長出的菌落接種至含有卡那霉素(50 ug/m L)培養(yǎng)液的LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒,利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入宿主菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含有卡那霉素(50 ug/m L)的PLB平板上,37℃倒置培養(yǎng)12~16 h,構(gòu)建突變文庫.

    (3)磷脂酶A1酶活突變株的初篩.PLB平板含有卵磷脂、溴甲酚紫和CaCl2,可作為篩選平板,產(chǎn)磷脂酶克隆會出現(xiàn)水解暈圈,將含有磷脂酶A1基因plaB重組質(zhì)粒的工程菌BL21(DE3)點種在篩選平板上作為對照,根據(jù)圈徑比的大小,初步篩選出正向突變株.

    (4)目的菌株的復(fù)篩及鑒定.將初篩得到的單菌落接種至5 m L含有卡那霉素(50 ug/m L)培養(yǎng)液的LB培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h,培養(yǎng)物按2%的接種量接至100 m L含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃、200 r/min培養(yǎng)至菌濃為OD600=0.6(對數(shù)生長期)時,加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG,37℃誘導(dǎo)4 h,取發(fā)酵液,采用酸堿滴定法[11].酶活力定義為:在45℃和p H 6.0條件下,1 g固體酶粉(或1 m L液體酶)1 min水解磷脂產(chǎn)生1μmol的可滴定脂肪酸,即為1個酶活力單位(U/g或U/m L)[12],測定發(fā)酵液酶活.選取酶活提高的菌株,提取其質(zhì)粒經(jīng)限制性酶酶切驗證后進行測序分析.

    (5)突變菌株EPB8誘導(dǎo)生長曲線的測定.從平板上挑取P28(p ET-28a(+)/BL21(DE3))、BP28(BP28/BL21(DE3))、EPB8單菌落,接種于5 m L含卡那霉素(50 ug/m L)的LB培養(yǎng)液中,37℃、200 r/min過夜培養(yǎng).1%的接種量,轉(zhuǎn)接至100 m L含卡那霉素(50 ug/m L)的LB培養(yǎng)液的250 m L三角瓶中,37℃、200 r/min培養(yǎng)3~4 h,OD600為0.6時加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG開始計時,每隔1 h取樣測OD600值,記錄數(shù)據(jù)繪制生長曲線.

    (6)EPB8誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件的優(yōu)化.接種1 m L過夜活化的EPB8菌液至100 m L LB培養(yǎng)基中,分別從誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、加入IPTG時的OD600值、IPTG濃度4個方面對EPB8進行產(chǎn)酶條件優(yōu)化[12].誘導(dǎo)時間分別為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h;誘導(dǎo)溫度分別為22℃、27℃、32℃、37℃、42℃;加入IPTG時的OD600值分別為0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、1.2;IPTG加量分別為0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.7 mmol/L、1.0 mmol/L;誘導(dǎo)后進行酶活定量測定.初始時IPTG加量0.2 mmol/L、溫度37℃、OD600值0.6條件下進行優(yōu)化即可.

    2 結(jié)果與分析

    2.1目的基因的獲得

    將粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06接種至5 m L的LB培養(yǎng)液中,37℃、200 r/min培養(yǎng)12~16 h,所得菌液按照基因組提取試劑盒說明步驟進行操作,得到的基因組用1%瓊脂糖凝膠驗證進行.

    2.2易錯PCR條件的確定

    由于Mg2+可以穩(wěn)定非互補堿基對,因此增加Mg2+濃度使之超過正常用量,從而穩(wěn)定非互補的堿基對.而Mn2+能夠降低聚合酶對模板的特異性,提高錯配率[13].研究通過改變Mg2+濃度和添加Mn2+促進堿基的錯配,獲得多樣性突變文庫.采用Mg2+濃度為1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L、7 mmol/L,Mn2+濃度為0、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、1 mmol/L作為梯度進行易錯PCR.

    不同離子濃度下的易錯PCR如圖1所示.由圖1可知,隨著Mn2+濃度的增加,目的基因擴增量減少,條帶彌散性也較嚴(yán)重,所以最適Mn2+濃度為0.1 mmol/L.在最適Mn2+濃度下,Mg2+濃度過低,擴增效率低,甚至沒有條帶,若Mg2+濃度較低,突變率會較低[14],因而選擇較高的Mg2+濃度7 mmol/L.不僅如此,條件6組合濃度基因平均突變率為0.58%,條件8組合濃度為0.63%,所以最終選擇Mg2+濃度為7 mmol/L、Mn2+濃度為0.1 mmol/L,從而實現(xiàn)對目的基因突變率的有效地控制.

    圖1 不同離子濃度下的易錯PCR

    2.3基因文庫的構(gòu)建

    按照上述易錯PCR的條件,以基因組為模板擴增目的基因,大小約1 700 bp,易錯PCR擴增目的基因如圖2所示.經(jīng)膠回收后,同時和載體pET-28a進行雙酶切后連接,轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中得到的轉(zhuǎn)化子構(gòu)成突變文庫.

    2.4突變株的篩選

    (1)初篩.將文庫中的轉(zhuǎn)化子接種至LB培養(yǎng)液中混合過夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至宿主菌大腸桿菌BL21(DE)感受態(tài)細(xì)胞中,涂布在含卡那霉素的PLB平板上,37℃培養(yǎng)12~14 h后,利用磷脂酶A1可以分解卵磷脂在PLB平板產(chǎn)生水解暈圈,根據(jù)水解暈圈的大小及其產(chǎn)生的快慢,可以直觀地篩選酶活突變株.將篩選出酶活發(fā)生變化的突變株點種在含卡那霉素的PLB平板上,與BP28/BL21(簡稱BP28)比較暈圈大小,結(jié)果如圖3所示.由圖3可知,挑取圈徑比較大的突變子6#、8#、16#、18#、19#、21#,在此基礎(chǔ)上進一步復(fù)篩.

    圖2 易錯PCR擴增目的基因

    圖3 PLB平板篩選結(jié)果

    (2)復(fù)篩.將初篩得到的酶活改變的突變株接種至含有50 ug/m L卡那霉素的LB培養(yǎng)中,37℃、200 r/min進行培養(yǎng)至OD600為0.6時,加IPTG誘導(dǎo)4 h,測發(fā)酵液粗酶液酶活進行復(fù)篩,結(jié)果如圖4所示.由圖4可知,酶活都有所提高,但8#突變子提高幅度最大,酶活為19.6 U/m L.為進一步驗證突變子的正確性,對其提取質(zhì)粒進行單酶切驗證,結(jié)果如圖5所示.從圖5中可以看出,突變株單酶切的大小約為7 000 bp和質(zhì)粒(約5 300 bp)與目的基因(約1 700 bp)共同片段的大小相一致.條帶大小正確說明突變子構(gòu)建成功,并命名為EPB8以備下一步實驗.

    2.5突變基因的序列分析

    提取突變株的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及酶切驗證正確后,送上海生工生物有限公司進行測序.對比測序結(jié)果并分析突變率,找出堿基突變和相應(yīng)氨基酸突變位點.

    突變基因的序列分析表明,突變菌株EPB8有11個堿基發(fā)生突變,導(dǎo)致有7個氨基酸發(fā)生突變.其中,磷脂酶A1蛋白有3個氨基酸突變,分別是Y97C、P98S、X228L;輔助蛋白有4個氨基酸突變,分別是P46L、Q58L、N136D、H233R.

    2.6突變株EPB8誘導(dǎo)生長曲線的測定

    按1.2(5)所述方法進行誘導(dǎo)生長曲線的測定,結(jié)果如圖6所示.由圖6可知,BP28和突變株EPB8在未誘導(dǎo)的情況下,生長情況基本相一致.但加入IPTG誘導(dǎo)后,兩菌株生長均表現(xiàn)出受到抑制.一方面IPTG對菌體有一定毒害作用;另一方面,目的產(chǎn)物磷脂酶A1對細(xì)胞也有一定的毒性[12].

    圖4 突變株搖瓶酶活測定

    圖5 突變菌株的酶切圖譜

    圖6 EPB8突變株的誘導(dǎo)生長曲線

    2.7突變菌株EPB8產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

    (1)誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶的影響.按1.2(6)所述方法進行測定,結(jié)果如圖7所示.由圖7可知,誘導(dǎo)時間2 h時酶活性最高,隨著時間的延長,酶活性有所降低,可能IPTG和磷脂酶A1對菌體都有一定毒害作用.誘導(dǎo)時間不宜過長,過長則菌體可能發(fā)生自溶,從而影響目的產(chǎn)物表達.故EPB8菌株最佳誘導(dǎo)時間為2 h.

    (2)誘導(dǎo)溫度對產(chǎn)酶的影響.誘導(dǎo)溫度對目的產(chǎn)物的表達及酶活有著至關(guān)重要的作用,若誘導(dǎo)溫度過高,重組蛋白會形成大量的無活性包涵體,以致胞外酶活降低;溫度過低,影響菌體生長,從而影響重組蛋白的表達.按照1.2(6)所述方法進行測定,誘導(dǎo)2 h測定發(fā)酵液酶活,結(jié)果如圖8所示.由圖8可知,誘導(dǎo)溫度為37℃時,酶活性最高,誘導(dǎo)溫度過高或過低,酶活性都會降低,所以,最佳誘導(dǎo)溫度為37℃.

    (3)誘導(dǎo)起始OD600對產(chǎn)酶的影響.誘導(dǎo)起始OD600對菌體產(chǎn)酶有著較大影響,按照1.2(6)所述方法測定,誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)時間2 h后測定發(fā)酵液酶活,結(jié)果如圖9所示.由圖9可知,誘導(dǎo)時間過早,菌體生長緩慢且菌體量少,外源蛋白的表達量可能會降低,酶活性也不高;若誘導(dǎo)時間過遲,細(xì)菌自身代謝能力降低,不利于外源基因表達,酶活性也是相對較低.當(dāng)OD600為0.8時誘導(dǎo),磷脂酶A1活性最高,誘導(dǎo)起始OD600過高過低都會影響酶活,所以最佳誘導(dǎo)起始OD600為0.8.

    (4)IPTG誘導(dǎo)濃度對產(chǎn)酶的影響.按照1.2(6)所述方法確定IPTG最佳誘導(dǎo)濃度,誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)起始OD600為0.8、誘導(dǎo)2 h后測定發(fā)酵液粗酶活,結(jié)果如圖10所示.由圖10可知,IPTG濃度為0.3 mmol/L時,酶活性最高,IPTG作為誘導(dǎo)劑能啟動lac啟動子的轉(zhuǎn)錄,使目的基因得以表達[12];IPTG濃度>0.3 mmol/L時,酶活性降低,可能是IPTG本身對細(xì)胞具有一定的毒性,對菌體生長有一定抑制作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)量降低;IPTG濃度<0.3 mmol/L時,酶活性也降低.因此,確定最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度為0.3 mmol/L.

    圖7 誘導(dǎo)時間對酶活的影響

    圖8 溫度對酶活的影響

    圖9 誘導(dǎo)OD600對酶活的影響

    圖10 IPTG濃度對酶活的影響

    3 結(jié)論與討論

    研究確定了易錯PCR條件:Mg2+濃度為7 mmol/L、Mn2+濃度為0.1 mmol/L,成功構(gòu)建了突變文庫.通過篩選最后得到酶活提高的突變株EPB8,該突變株最初酶活性測定為19.6 U/m L,相對于未突變前菌株BP28的酶活16 U/m L提高了22.5%,通過進行單因素實驗優(yōu)化,優(yōu)化后的酶活達22.5 U/m L,比優(yōu)化前提高了14.8%.

    粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A1基因plaB經(jīng)易錯PCR方法的定向改造后,磷脂酶A1活性有了較大提高,為后期磷脂酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究提供了一定的素材.突變株EPB8經(jīng)測序分析表明:有7個氨基酸發(fā)生突變,其中288位由X突變?yōu)長,與之前推斷的第195位Ser為此磷脂酶A1的催化中心相距較近,這也可能是酶活提高的原因之一;而亮氨酸又為疏水性氨基酸,疏水性氨基酸在蛋白質(zhì)內(nèi)部,具有保持蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)的作用,288位氨基酸的突變可能會使磷脂酶A1的三級結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,這也為磷脂酶A1的研究奠定了一定的基礎(chǔ).

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    Improving the Activity of Phospholipase A1 from Serratia Marcescs PL-06 by Error-prone PCR

    WANG Yu-man,XUE Zheng-lian?,WANG Zhou,SU Yan-nan,ZHU Hao
    (College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

    In order to obtain phospholipase A1 with higher activity,error-prone PCR was used to evolve the phospholipase A1 from Serratia marcescens PL-06 by adding different concentration of Mg2+and Mn2+.The gene was cloned into p ET28a(+)expression vector,and a mutant library was constructed.After the first and secondary screening,one mutant showed significant elevated activity,named EPB8.The enzyme activity of the mutants was 22.5%higher than that of the wild-type control.And increased by 41%after optimal Fermentation conditions.The sequence of the plaB gene of the mutants showed 7 mutated amino acids.It was found that phospholipase A1 protein revealed three amino acid substitutions:Y97C,P98S,X228L,and auxiliary protein revealed four amino acid substitutions:P46L,Q58L,N136D,H233R.These results provide a basis for further research of phospholipase A1.

    Serratia marcescens;phospholipase A1;error-prone PCR;optimization of fermentation conditions

    Q786

    A

    1672-2477(2016)04-0006-06

    2016-01-10

    國家自然科學(xué)基金資助項目(31471615)

    王玉滿(1989-),女,山東成武人,碩士研究生.

    薛正蓮(1967-),女,安徽和縣人,教授,碩導(dǎo).

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