貴州蜜環(huán)菌資源的分子標(biāo)記與遺傳多樣性分析

王彩云, 武新玲, 侯 俊, 王 永, 成忠均, 張翔宇*

(1.畢節(jié)市中藥研究所, 貴州 畢節(jié) 551700; 2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 山東 濟(jì)南 250355; 3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所, 北京 100193; 4.大方縣鄉(xiāng)村振興局, 貴州 大方 551600)

0 引言

【研究意義】蜜環(huán)菌屬〔Armillaria(Fr.) Staude〕是擔(dān)子菌綱傘菌目口蘑科中具有重要藥用、經(jīng)濟(jì)價(jià)值的屬,也是全球森林生態(tài)系統(tǒng)真菌區(qū)系中重要組成部分。蜜環(huán)菌(Armillariamellea)不僅是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材豬苓(Grifolaumbellata)和天麻(Gastrodiaelatal)栽培必不可少的共生菌,而且具有較高的食藥用價(jià)值。另外,蜜環(huán)菌在全世界寒帶和溫帶侵染600多種樹(shù)木,可導(dǎo)致林木根朽病,闊葉樹(shù)及針葉樹(shù)尤為嚴(yán)重[1]。目前,全球蜜環(huán)菌生物種為北美10個(gè)、歐洲7個(gè)、非洲5個(gè)、澳洲5個(gè),亞洲至少存在19個(gè)生物種,我國(guó)分布有15種[2]。自1978年Korhonen首次發(fā)現(xiàn)蜜環(huán)菌生物種以來(lái),生物種已成為蜜環(huán)菌系統(tǒng)分類的基礎(chǔ),根據(jù)生物種建立的分類種,已得到森林病理學(xué)和菌物分類學(xué)界的廣泛認(rèn)可[3]。而蜜環(huán)菌屬的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和遺傳多樣性研究是現(xiàn)代蜜環(huán)菌生物種研究的熱點(diǎn)之一,具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】國(guó)內(nèi)外學(xué)者在蜜環(huán)菌屬的分子鑒定及遺傳多樣性方面開(kāi)展了大量研究,COETZEE等[4-5]基于ITS和IGS-1序列進(jìn)行了來(lái)自印尼、馬來(lái)西亞以及南美的部分蜜環(huán)菌屬種的系統(tǒng)進(jìn)化地位分析和分子鑒定;KIM等[6-7]采用RFLP、ITS、AFLP等多種標(biāo)記手段對(duì)北美的部分蜜環(huán)菌屬種進(jìn)行了鑒定以及系統(tǒng)進(jìn)化分析,部分菌株得到有效區(qū)分;國(guó)內(nèi)關(guān)于蜜環(huán)菌報(bào)道中,王守現(xiàn)等[8]用RAPD技術(shù)進(jìn)行了13個(gè)蜜環(huán)菌菌株的遺傳多樣性分析,提出RAPD技術(shù)可以有效區(qū)分蜜環(huán)菌菌株并分析其遺傳多樣性;孫立夫等[9]應(yīng)用ISSR技術(shù)分析了采自東北的53個(gè)法國(guó)蜜環(huán)菌菌株的遺傳多樣性,提出ISSR標(biāo)記在蜜環(huán)菌中存在較高的多態(tài)性。【研究切入點(diǎn)】目前,有關(guān)蜜環(huán)菌的研究報(bào)道主要集中于生物學(xué)特征、化學(xué)成分分析等方面[10-16],有關(guān)貴州蜜環(huán)菌菌株分子標(biāo)記及遺傳多樣性分析的報(bào)道相對(duì)較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)貴州天麻主產(chǎn)區(qū)畢節(jié)地區(qū)19個(gè)蜜環(huán)菌居群的菌株遺傳多樣性進(jìn)行分析,構(gòu)建聚類分析樹(shù)狀圖,弄清親緣關(guān)系,并討論其形成的可能原因,以期為蜜環(huán)菌的優(yōu)良資源篩選及后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蜜環(huán)菌 供試蜜環(huán)菌為畢節(jié)市中藥研究所從貴州天麻主產(chǎn)區(qū)收集的蜜環(huán)菌資源(表1),經(jīng)分離、提純后的試管種。

表1 供試蜜環(huán)菌資源信息與來(lái)源

1.1.2 主要試劑和儀器 用于PCR反應(yīng)的2×M5HiPer plus Taq HiFi PCR mix 購(gòu)于北京聚合美生物科技有限公司,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量(Marker)DL5000購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(TaKaRa)。DNA提取試劑盒(貨號(hào)DP305)購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。PCR擴(kuò)增儀(Appliedbiosystems,Veriti)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad,XRS+)、NanoDrop分光光度儀(Thermo Scientific,NanoDrop2000)、電泳儀(Bio-Rad,通用電泳儀164-5070)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及濃度測(cè)定 取適量蜜環(huán)菌的新鮮菌索,置于液氮中研磨后利用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒(貨號(hào)DP305)提取蜜環(huán)菌DNA,將DNA原液保存于-20 ℃?zhèn)溆?。再利用微量核酸蛋白分析儀Nanodrop 2 000測(cè)定DNA濃度及純度,并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性。

1.2.2 分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物及篩選 依據(jù)參考文獻(xiàn)[17-19],選擇3對(duì)引物進(jìn)行蜜環(huán)菌分子標(biāo)記擴(kuò)增并進(jìn)行分析,其中,1#引物[17]序列為AR1,5′-CTGACCTGTTAAAGGGTATGTGC-3′;AR2,5′-AAGCTGAATCCTTCTACAAAGTCAA-3′;2#引物[18]序列為EF595F,5′-CGTGACTTCATCAAGAACATG-3′;EF1160R,5′-CCGATCTTGTAGACGTCCTG-3′;3#引物[19]序列為L(zhǎng)R12R,5’-CTGAACGCCTCTAAGTCAGAA-3′;O-l:5′-AGTCCTATGGCCGTGGAT-3′。以此3對(duì)引物分別對(duì)蜜環(huán)菌DNA進(jìn)行分子標(biāo)記擴(kuò)增,選擇合適引物。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 以蜜環(huán)菌DNA為模板,分別利用1.2.2確定的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行,反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃延長(zhǎng)7 min,4 ℃保存。PCR擴(kuò)增體系為DNA 3 μL,F/R引物各0.5 μL,10 μL 2× M5HIPer plus Taq HIFI PCR mix,ddH2O 6 μL,總體系為20 μL。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠,電泳儀180 V電壓15 min,測(cè)定引物是否能擴(kuò)增出目的片段。

1.2.4 序列比對(duì)及聚類分析 將PCR擴(kuò)增所得原液送至中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院進(jìn)行Sanger測(cè)序。用ContigExpress拼接測(cè)序結(jié)果,并去除兩端不準(zhǔn)的部分。將拼接好的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),并下載同源度較高的序列用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。運(yùn)用DNASTAR中的EditSeq對(duì)堿基長(zhǎng)度、GC含量等進(jìn)行測(cè)量;利用MEGA7.0進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜜環(huán)菌菌株的DNA質(zhì)量

用植物基因組DNA試劑盒(DP305)提取蜜環(huán)菌基因組DNA,OD260/OD280值在1.63～1.96,DNA濃度為24.9～117.8 ng/μL(表2),其純度和產(chǎn)量均較高,說(shuō)明所提取的DNA可用于后續(xù)試驗(yàn)。

表2 供試蜜環(huán)菌樣品的DNA濃度與OD260/OD280值

2.2 蜜環(huán)菌菌株的適宜引物

3對(duì)引物以蜜環(huán)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),2#、3#引物均能有效對(duì)19份蜜環(huán)菌DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增(圖1)。2#、3#引物適用于蜜環(huán)菌種群,對(duì)蜜環(huán)菌DNA模板產(chǎn)生各自特有且清晰的目的基因帶。因此,選用2#、3#引物進(jìn)行分子標(biāo)記擴(kuò)增分析。

圖1 蜜環(huán)菌樣品用2#(上)、3#(下)引物擴(kuò)增的目的片段圖譜

2.3 蜜環(huán)菌菌株的堿基組成

由表3可知,19株蜜環(huán)菌以2#、3#引物擴(kuò)增獲得序列的堿基長(zhǎng)度、GC含量等均不同。其中,以2#引物擴(kuò)增的序列,堿基片段長(zhǎng)度為574～667 bp,平均值為593 bp;GC含量為51.79%～54.27%,平均含量為53.56%。C含量為23.43%～30.13%,平均含量為26.38%;G含量為23.43%～30.34%,平均含量為27.18%;A含量為25.21%～22.15%,平均含量為23.31%;T含量為22.01%～24.62%,平均含量為22.96%。以2#為引物時(shí),各供試菌株的GC含量差異不明顯,表明其親緣關(guān)系較近,其中,10號(hào)、13號(hào)菌株的堿基長(zhǎng)度以及GC含量、各堿基含量均相同,表明2個(gè)菌株的親緣關(guān)系極為接近。以3#引物擴(kuò)增的序列,堿基片段長(zhǎng)度為828～925 bp,平均值為891 bp;GC含量為43.01%～45.00%,平均含量為44.02%。C含量為18.15%～25.42%,平均含量為22.74%;G含量為17.51%～25.16%,平均含量為21.26%;A含量為23.82%～33.57%,平均含量為28.68%;T含量為23.62%～33.06%,平均含量為27.20%。以3#為引物時(shí),各供試菌株的GC含量差異不明顯,表明其親緣關(guān)系較近,其中,1號(hào)菌株與3號(hào)菌株的GC含量相同,堿基長(zhǎng)度相同,表明其親緣關(guān)系極為接近。

表3 2#、3#引物擴(kuò)增19個(gè)蜜環(huán)菌菌株的堿基組成

2.4 蜜環(huán)菌菌株的相似率

由表4可見(jiàn),各供試蜜環(huán)菌菌株以2#引物擴(kuò)增得到的序列比對(duì)覆蓋率不低于82%,序列相似率不低于96.08%。其中,8、14、17的DNA序列與A.mellea的同源性最高,序列相似率均達(dá)99%以上,基因覆蓋度均達(dá)96%以上,其余16個(gè)菌株的DNA序列與A.gallica的同源性最高,序列相似率均高于96%,基因覆蓋度均達(dá)82%以上。

表4 各菌株用2#、3#引物擴(kuò)增序列的相似率

各供試蜜環(huán)菌菌株以3#引物擴(kuò)增得到的序列比對(duì)覆蓋率不低于93%,序列相似率不低于98.45%。其中,10號(hào)菌株的序列比對(duì)覆蓋率為93.00%,序列相似率為99.88%,與A.sinapina的同源性最高;11號(hào)菌株的序列比對(duì)覆蓋率為99.00%,序列相似率為99.54%,與A.cepistipes的同源性最高;8、14、17的DNA序列與A.mellea的同源性最高,序列相似率均達(dá)98%以上,基因覆蓋度均達(dá)94%以上;其余14個(gè)菌株的DNA序列與A.gallica的同源性最高,序列相似率均高于99%,基因覆蓋度均達(dá)94%以上。綜上,貴州天麻主產(chǎn)區(qū)畢節(jié)市野生蜜環(huán)菌資源,大部分為A.gallica,少部分為A.mellea。

2.5 蜜環(huán)菌菌株的聚類

如圖2所示,2#引物將19份天麻樣品分為7大類,樣品(2)、4、2、(1)、16、17聚為第1類,其中4、(2)、2、(1)的遺傳距離最近;第2類為樣品7、12;第3類為樣品9、15;第4類為樣品8、3、11;樣品6單獨(dú)聚為一類;第6類為樣品1、5、14;第7類為樣品10、13。與上述分類不同,3#引物將19份樣品分為5大類,樣品4、13、9、11聚為第1類;樣品6、12、17聚為第2類;樣品14單獨(dú)為1類,與A.mellea的遺傳距離最近;樣品(1)、10單獨(dú)為第4類;樣品2、(2)、8、16、7、5、15、1、3聚為第5類,其中,樣品2、(2)遺傳距離最近,5、15、1、3遺傳距離最近。

圖2 2種引物擴(kuò)增蜜環(huán)菌樣品DNA目的片段的進(jìn)化樹(shù)

從2#、3#引物的擴(kuò)增序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)看,19個(gè)菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的聚類結(jié)果與表3的GC含量分析基本一致;與表4結(jié)果接近。來(lái)自不同地區(qū)的蜜環(huán)菌菌株未聚為一類,說(shuō)明蜜環(huán)菌資源遺傳多樣性豐富,與地理環(huán)境關(guān)系不密切。8號(hào)和9號(hào)菌株均來(lái)自畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)楊家灣鎮(zhèn),8號(hào)分離于菌材,9號(hào)分離于子實(shí)體,但是遺傳距離較遠(yuǎn),親緣關(guān)系不密切,可能是相同地區(qū)的菌株自身發(fā)生遺傳變異,導(dǎo)致菌株的遺傳多樣性。

3 討論

近年來(lái),世界各地關(guān)于蜜環(huán)菌的報(bào)道越來(lái)越多,歐洲、北美等地對(duì)蜜環(huán)菌的研究較早也比較深入,我國(guó)有關(guān)蜜環(huán)菌的研究進(jìn)展較快,蜜環(huán)菌的鑒定方法隨之從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)展到如今的分子生物學(xué)鑒定。作為傳統(tǒng)經(jīng)典的鑒定方法,形態(tài)學(xué)有著其獨(dú)特的優(yōu)越性,但由于蜜環(huán)菌分類特征不明顯,表觀形態(tài)多樣,而且需要結(jié)合孢子、菌索、子實(shí)體等樣本才能鑒定,受到較大限制;在分子生物學(xué)鑒定中,采用單個(gè)的IGS、ITS、EF-1α序列無(wú)法準(zhǔn)確鑒定每個(gè)蜜環(huán)菌種?；诖?研究選擇特異性引物2#(翻譯延伸因子1α基因,EF-1α)以及3#引物(基因間隔區(qū),IGS),其中,翻譯延伸因子1α基因參與蛋白質(zhì)的合成。研究結(jié)果表明,2個(gè)引物擴(kuò)增序列得到的聚類結(jié)果不一樣,可能是因?yàn)?種引物擴(kuò)增的區(qū)域進(jìn)化速度不相同,EF-1α的進(jìn)化相對(duì)保守。對(duì)采自貴州畢節(jié)市的19份野生蜜環(huán)菌資源進(jìn)行基于分子標(biāo)記的遺傳多樣性分析后,2對(duì)引物均能有效擴(kuò)增蜜環(huán)菌的基因組DNA,并能對(duì)貴州畢節(jié)產(chǎn)區(qū)蜜環(huán)菌資源進(jìn)行有效分類,對(duì)蜜環(huán)菌遺傳多樣性研究提供了寶貴資源,該分子標(biāo)記體系的建立為今后利用分子標(biāo)記對(duì)蜜環(huán)菌遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系分析及種質(zhì)資源鑒定等研究工作奠定了基礎(chǔ)。

研究種質(zhì)資源遺傳多樣性的有效方法是聚類分析和GC含量,在生物體的DNA序列中,GC含量能夠反映出種屬間親緣關(guān)系的遺傳特性,每個(gè)物種的DNA中都有其特定的GC含量,不同物種的GC含量不同,GC含量差異越小,親緣關(guān)系越接近[20]。基于聚類和GC含量等對(duì)來(lái)源于貴州主產(chǎn)區(qū)的19份蜜環(huán)菌種質(zhì)進(jìn)行分析,以2#引物擴(kuò)增的序列分為7大類群,以3#引物擴(kuò)增的序列分為5大類群,不同地區(qū)來(lái)源的種質(zhì)相互交錯(cuò),親緣關(guān)系與地理來(lái)源無(wú)明顯相關(guān)性,但貴州畢節(jié)市野生蜜環(huán)菌資源大部分為A.gallica,少部分為A.mellea。黃萬(wàn)兵等[21]研究提出,A.gallica、A.cepistipes能促進(jìn)天麻生長(zhǎng);CHA等[22-23]研究提出,A.gallica的共生效果相對(duì)較好。研究發(fā)現(xiàn),貴州畢節(jié)市天麻主產(chǎn)區(qū)存在豐富的A.gallica資源,因此完全有條件篩選最適宜當(dāng)?shù)靥炻榉N植的蜜環(huán)菌菌種來(lái)發(fā)展天麻產(chǎn)業(yè),無(wú)需從外地引種、購(gòu)種,從而有效避免長(zhǎng)期跨地區(qū)引種帶來(lái)的產(chǎn)量不穩(wěn)、菌種退化等問(wèn)題。

4 結(jié)論

2#、3#引物能有效擴(kuò)增蜜環(huán)菌的基因組DNA,并能將采自貴州畢節(jié)市的19份野生蜜環(huán)菌資源進(jìn)行有效分類。通過(guò)序列比對(duì)、GC含量分析以及聚類分析發(fā)現(xiàn),不同地區(qū)的蜜環(huán)菌資源相互交錯(cuò),親緣關(guān)系與地理來(lái)源無(wú)明顯的相關(guān)性,貴州畢節(jié)市野生蜜環(huán)菌資源大部分為A.gallica,少部分為A.mellea。