潰瘍病的發(fā)生對(duì)半滑舌鰨體表黏膜菌群結(jié)構(gòu)的影響

王禎輝　付建東　薛淑霞

摘? ? 要：潰瘍病是危害養(yǎng)殖半滑舌鰨的一種流行性疾病，黏膜菌群在維持魚體健康中發(fā)揮了重要的作用。為了分析潰瘍病的發(fā)生對(duì)半滑舌鰨體表黏膜菌群結(jié)構(gòu)的影響，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)體表黏膜菌群16S rRNA基因的V4高變異區(qū)進(jìn)行測(cè)序，分析了健康（MH）、患潰瘍病早期（體表散布小的潰瘍點(diǎn)）（PMD）和晚期（體表有明顯潰瘍?cè)睿∕D）的半滑舌鰨體表黏膜菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：在MH、PMD和MD樣本中分別鑒定到了4 036、1 758、1 763個(gè)OUTs（Operational Taxonomic Units）。在屬分類水平上，MH樣品中Pseudoalteromonas、unidentified_Chloroplast、Blautia和Bifidobacterium豐度較高，而在PMD和MD樣品中，其優(yōu)勢(shì)菌群是Pseudomonas和Vibrio。物種注釋表明，MH樣品中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)比PMD和MD樣品中的細(xì)菌群落更具多樣化。細(xì)菌分離結(jié)果顯示，在PMD和MD樣品中發(fā)現(xiàn)了更多潛在的致病菌。綜上，在養(yǎng)殖半滑舌鰨潰瘍病的發(fā)生過(guò)程中，魚體表皮黏膜細(xì)菌菌群的豐度、多樣性及均一性水平均顯著下降。研究結(jié)果為闡明半滑舌鰨潰瘍病的發(fā)生機(jī)制提供了新思路。

關(guān)鍵詞：半滑舌鰨；潰瘍??；黏膜菌群

中圖分類號(hào)：S941? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2023.S.013

Analysis of Mucus Bacterial Communities Associated to Skin Ulcer Disease of Chinese Tongue Soles（Cynoglossus semilaevis）

WANG Zhenhui1， FU Jiandong1， XUE Shuxia2

（1. Tianjin Haifa Zhenpin Industrial Development Company Limited， Tianjin 300450， China; 2. College of Life Sciences， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China）

Abstract： Skin ulcer disease is an epidemic disease affecting cultured Chinese tongue sole， and the mucus bacteria plays an important role in maintaining fish health. In order to analyze the relationship of skin mucus bacterial communities and the occurrence of skin ulcer disease， the skin mucus bacterial communities with three typical statuses including healthy （MH）， early stage of the disease （having pustules on the skin） （PMD）， and late stage of the diseases （having obvious ulcers on the skin） （MD） were analyzed by sequencing the V4 hypervariable region of the 16S rRNA gene using pyrosequencing technique. The result showed that 4 036， 1 758 and 1 763 operational taxomonic units （OTUs） were identified in MH， PMD and MD samples， respectively. The genus taxonomic analysis showed that Pseudoalteromonas， unidentified_Chloroplast， Blautia and Bifidobacterium were more abundant in MH sample whereas in PMD and MD samples were Pseudomonas and Vibrio. In addition， tags annotation showed that the bacterial community in the MH sample was much more diverse than that in PMD and MD samples. The bacterial isolation results showed that more potential pathogenic bacteria were also found in PMD and MD samples. In conclusion， the abundance， diversity and evenness levels of the mucus bacterial communities of the fish are significantly decreased during the development of ulcer disease in cultured Chinese tongue soles. The results of the study provides new ideas to elucidate the mechanism of ulcer disease in Chinese tongue soles.

Key words： cynoglossus semilaevis; skin ulcer disease; mucus bacterial communities

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）主要分布于我國(guó)黃渤海近海海域，是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚類[1]。高密度集約化的養(yǎng)殖模式導(dǎo)致半滑舌鰨病害頻發(fā)，養(yǎng)殖成活率降低，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，制約了半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[2]。根據(jù)已有的研究結(jié)果[3-5]，結(jié)合筆者對(duì)天津地區(qū)養(yǎng)殖半滑舌鰨疾病調(diào)查情況，潰瘍病被認(rèn)為是目前危害半滑舌鰨養(yǎng)殖重要的細(xì)菌性疾病。潰瘍病發(fā)病初期，表皮會(huì)形成一些小的膿包，然后膿包會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成較大面積的潰瘍?cè)?，造成魚體死亡。

魚類針對(duì)病原體擁有較多的防御機(jī)制，其中體表黏膜組織為重要的第一道物理防御屏障[6-7]。研究表明，魚類黏膜組織中定植著大量的細(xì)菌，一個(gè)平衡穩(wěn)定的細(xì)菌群落對(duì)維持魚體健康起了重要的作用[8-9]。然而，魚類黏膜菌群結(jié)構(gòu)可能會(huì)被多種因素干擾而失去平衡，包括網(wǎng)捕、使用抗生素[10]、鹽度[11]、遺傳[12]等。目前針對(duì)半滑舌鰨黏膜組織中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究較少，對(duì)于半滑舌鰨黏膜組織中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與潰瘍病發(fā)生之間的關(guān)系還不明晰。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了健康的、患病初期和患病期的半滑舌鰨體表黏膜菌群結(jié)構(gòu)，闡明了半滑舌鰨黏膜組織中細(xì)菌組成與潰瘍病發(fā)生之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

半滑舌鰨取自天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，從養(yǎng)殖池中隨機(jī)取5尾沒(méi)有明顯疾病癥狀的半滑舌鰨，平均體質(zhì)量（243±13） g，設(shè)為MH組；5尾體表有膿包的魚體，平均體質(zhì)量（225±17） g，設(shè)為PMD組；5尾體表有明顯潰瘍?cè)畹聂~體，平均體質(zhì)量（236±24） g，設(shè)為MD組（圖1）。將每組魚放到解剖盤中，用無(wú)菌水沖洗其體表。用滅菌的手術(shù)刀從魚體有鱗一側(cè)刮取粘液，放入離心管，-80 ℃保存。使用DNA提取試劑盒（Omega Bio-Tek，美國(guó)）進(jìn)行DNA提取。將DNA稀釋到1 ng·μL-1。

1.2 16S rDNA文庫(kù)的構(gòu)建及高通量測(cè)序

文庫(kù)構(gòu)建參考Xue等[13]的方法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增16S rDNA的高變異區(qū)，引物為515F-806R[14]，擴(kuò)增反應(yīng)體系為Phusion高保真PCR Master Mix（New England Biolabs）。利用TruSeq DNA PCR-free Sample Preparation Kit（Illumina，美國(guó)）建立測(cè)序文庫(kù)。構(gòu)建好的文庫(kù)利用Qubit@ 2.0 Fluorometer （Thermo Scientific）和 Agilent Bioanalyzer 2100進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，評(píng)估合格的文庫(kù)在IlluminaHiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序由諾禾致源生物科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用FLASH[15]等軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行去冗余。使用UCHIME算法[16]將獲得的序列與參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，去除嵌合體序列，最終獲得有效序列。利用Uparse[17]對(duì)獲得的有效序列進(jìn)行聚類分析（97%一致性），生成OTUs。使用MUSCLE軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析。分別在界、門、綱、目、科和屬等分類層次上進(jìn)行注釋。通過(guò)Qiime軟件[18]計(jì)算Observed species、 Chao1、Shannon、Simpson、ACE和Goods coverage指數(shù)數(shù)值，分析樣本中細(xì)菌的多樣性和復(fù)雜性。

1.4 半滑舌鰨細(xì)菌的分離鑒定

針對(duì)MH、PMD和MD組的魚體，用2216E平板（天和微生物試劑公司，中國(guó)杭州）分別從魚體體表的膿包（PMD）、潰瘍?cè)睿∕D），以及肝臟和腎臟中分離細(xì)菌。在28 ℃培養(yǎng)24 h后，將優(yōu)勢(shì)單個(gè)菌落接種到新的平板上，進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增[13]。PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、測(cè)序，通過(guò)BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTUs分析

在樣品MH、PMD和MD中分別鑒定到了4 036、1 758、1 763個(gè)OTUs。Venn分析顯示，3個(gè)樣品中共有902個(gè)OTUs，而MH樣品中有2 369個(gè)特有的OTUs（圖2）。這表明健康半滑舌鰨魚體體表的細(xì)菌多樣性和豐富度顯著高于患病魚體。從Shannon、Simpson、Chao 1、ACE、Goods coverage、observed species和PD_whole_tree數(shù)據(jù)分析中也可以看出，健康魚體體表菌群的多樣性水平更高（表1）。

2.2 OTUs注釋分析

所有的OTUs按界、門、綱、目、科和屬的分類層次進(jìn)行注釋。在綱分類層面上，MD和PMD樣品中，Gammaproteobacteria分別占細(xì)菌總數(shù)的92.9%、92.0%；而在MH樣本中，Gammaproteobacteria占比72.6%，其次是Clostridia（3.6%）、Alphaproteobacteria （5.3%）、Chloroplast（1.5%）、unidentified_Actinobacteria

（1.7%）、Bacilli（1.8%）和Betaproteobacteria（1.4%）（圖3-A）。在目分類層面上，MH、PMD和MD樣本中，豐度差異最大的是Alteromonadales（MH為42.0%、PMD為 34.7%、MD為 20.9%）， 其次為Pseudomonadales （MH為11.5%、PMD為32.5%、MD為41.4%），Vibrionales（MH為10.1%、PMD為16.4%、MD為17.3%），Clostridiales（MH為3.5%、PMD為0.73%、MD為0.76%），unidentified_Chloroplast

（MH為1.5%、PMD為0.027%、MD為 0.034%），Rhodobacterales （MH為2.2%、PMD為0.59%、MD為0.54%），Lactobacillales（MH為1.3%、PMD為0.13%、MD為0.17%）（圖3-B）。在科分類水平上，Pseudomonadaceae和Lachnospiraceae的豐度在3個(gè)組中呈現(xiàn)出明顯的差異。Pseudomonadaceae在MH樣本中的占比為9.9%，而在PMD和MD樣本中的占比分別為29.3%、38.4%。相反，Lachnospiraceae在MH樣本中的占比為2.3%，明顯高于PMD和MD組（分別為0.29%、0.33%）（圖3-C）。在屬分類水平，3個(gè)樣本中的細(xì)菌豐度也存在較大的差異，包括Pseudomonas （MH為9.9%、PMD為29.3%、MD為38.4%）， Vibrio （MH為9.9%、PMD為16.4%、MD為17.2%）， unidentified_Chloroplast（MH為1.5%、PMD為0.03%、MD為0.03%）， Blautia（MH為1.1%、PMD為0.06%、MD為0.06%）（圖3-D）。

2.3 黏膜菌群多樣性和均一性分析

為了進(jìn)一步分析健康和患潰瘍病半滑舌鰨體表菌群的差異，使用稀釋曲線和等級(jí)豐度曲線來(lái)闡釋樣本中OTUs的分布特征[14，19]，稀釋曲線是通過(guò)計(jì)算代表OTUs的隨機(jī)選擇的測(cè)序序列數(shù)量而繪制（圖4）。稀釋曲線體現(xiàn)了測(cè)序數(shù)據(jù)的合理性，并間接反映了細(xì)菌群落的豐度和多樣性水平。MH樣品中的20 797條序列代表了超過(guò)1 368個(gè)觀察到的物種，而在PMD和MD樣品中，這些序列分別代表了667、662個(gè)物種。這表明MH樣品中細(xì)菌的多樣性程度更高。根據(jù)每個(gè)OUT的豐度對(duì)其進(jìn)行排序，以O(shè)TUs的豐度為Y軸，排序的次序?yàn)閄軸，繪制等級(jí)豐度曲線（圖5）。曲線越平坦，表明樣品中細(xì)菌種類的分布越均一。從圖5可以看出，與PMD和MD樣品相比，MH樣品的等級(jí)豐度曲線顯示出更均衡的細(xì)菌物種分布。

2.4 患潰瘍病魚體細(xì)菌分離鑒定

從患潰瘍病的半滑舌鰨體內(nèi)共分離獲得83株細(xì)菌（表2），經(jīng)初步鑒定，這些細(xì)菌大部分為弧菌，其中哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）17株，輪蟲弧菌（V. rotiferianus）16株，創(chuàng)傷弧菌14株（V. vulnificus）。從健康的半滑舌鰨體內(nèi)未分離到潛在致病菌。

3 討論與結(jié)論

半滑舌鰨是我國(guó)北方地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖魚類，皮膚潰瘍病的發(fā)生給半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的損失。已有研究表明，從患潰瘍病的半滑舌鰨體內(nèi)分離獲得了多種細(xì)菌性病原[3-5]。本研究也從患病魚體中分離獲得了包括哈維氏弧菌、溶藻弧菌和輪蟲弧菌在內(nèi)的多種病原菌，提示該病是由多種病原感染引起的綜合性疾病。本研究所采集的樣本包括健康的和自然發(fā)病的魚體（包括發(fā)病早期和晚期），可以客觀地反映潰瘍病的發(fā)生對(duì)魚體體表黏膜菌群的影響。

與陸生動(dòng)物相比，魚類體表黏膜與水環(huán)境直接接觸，體表黏膜中存在一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)生態(tài)系統(tǒng)[20]，這個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定對(duì)維持魚體健康發(fā)揮了重要的作用。在之前的研究中已經(jīng)闡明了養(yǎng)殖魚類潰瘍病的發(fā)生與養(yǎng)殖水體中細(xì)菌菌群之間存在潛在的相關(guān)性[13]。因此，筆者推測(cè)養(yǎng)殖半滑舌鰨潰瘍病發(fā)生與魚類體表黏膜中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，半滑舌鰨體表黏膜中細(xì)菌菌群的多樣性與潰瘍病表現(xiàn)出一定的關(guān)聯(lián)性。與患潰瘍病的半滑舌鰨相比，健康魚體的表皮黏膜菌群豐度更高，更具多樣化和均一性。這表明健康魚體表皮黏膜中豐富、多樣、均衡的細(xì)菌菌群可能會(huì)抑制條件致病菌的繁殖。相反，表皮黏膜中失衡的細(xì)菌菌群會(huì)使致病菌“有機(jī)可乘”，導(dǎo)致潰瘍病的發(fā)生。本研究中，常見的魚類致病菌，如假單胞菌和弧菌，在患潰瘍病的魚體體表黏膜中豐度顯著增加，增加了半滑舌鰨患病的風(fēng)險(xiǎn)。

Gammaproteobacteria是魚類表皮黏膜和腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群[21-22]。本研究結(jié)果表明，在MH、PMD和MD 3個(gè)樣本中，Gammaproteobacteria也具有較高的豐度，但是其豐度在3個(gè)樣本中呈現(xiàn)出顯著的差異（MH中72.6%、PMD中92.0%、MD中92.9%）。Gammaproteobacteria包含一些魚類條件致病菌，如弧菌和假單胞菌。弧菌是海水中的常見細(xì)菌，是眾所周知的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的致病菌，弧菌的感染和流行會(huì)給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成災(zāi)難性的損失[23]。假單胞菌也是海水養(yǎng)殖魚類的重要致病病原[24]。本研究結(jié)果表明，與健康魚體相比，患潰瘍病半滑舌鰨體表黏膜中弧菌和假單胞菌的豐度顯著升高。另外，健康魚體體表黏膜中Lachnospiraceae豐度要顯著高于患病魚體。Pince等[25]報(bào)道，Lachnospiraceae可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性排斥保護(hù)魚類體表角質(zhì)細(xì)胞免受病原體的侵染?；紳儾“牖圉嶓w表黏膜中Lachnospiraceae豐度的降低，減弱了其對(duì)半滑舌鰨體表的角質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用，間接增加了病原菌的侵染機(jī)會(huì)。

微生物生態(tài)系統(tǒng)的功能和穩(wěn)定性受到其豐度和均一度的影響[26-27]。本研究中，健康和患潰瘍病半滑舌鰨表皮黏膜中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在著明顯的差異。健康樣本中細(xì)菌的OTUs數(shù)量、shannon指數(shù)、Chao1、ACE數(shù)值都顯著高于患病樣本。另外，稀釋度和等級(jí)豐度分析表明，健康魚體體表黏膜中細(xì)菌菌群比患潰瘍病魚體更具多樣性和均一性。Hillebrand等[28]指出，一個(gè)多樣、均衡的細(xì)菌菌群可以為宿主提供更好的保護(hù)。由此，筆者可以推測(cè)，半滑舌鰨表皮黏膜中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的顯著變化可能是半滑舌鰨潰瘍病發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因素。表皮黏膜中細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)變化可以作為監(jiān)測(cè)半滑舌鰨潰瘍病發(fā)生的指標(biāo)。

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收稿日期：2023-04-22

基金項(xiàng)目：天津市海水養(yǎng)殖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（ITTMRS2022006）

作者簡(jiǎn)介：王禎輝（1980—），男，河北唐山人，獸牧師，主要從事海水珍品魚類養(yǎng)殖研究。