鐵死亡通路中ACSL4、LPCAT3蛋白表達在特發(fā)性炎性肌病中的研究

王虎年，柴克霞，張莉

1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部，青海西寧 810001；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，青海西寧 810001

鐵死亡（ferroptosis）最早發(fā)現(xiàn)于2003年，相關(guān)研究學(xué)者將其定義為一種基于鐵依賴性脂質(zhì)過氧化反應(yīng)后的不可逆死亡模式[1]。2021年，學(xué)者Dixon正式將其命名為鐵死亡[2]。作為一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死方式，其具有不同于以往任何一種細(xì)胞死亡的方式。在損傷機制上，主要為細(xì)胞中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的不斷積累，超過自身的清除能力后破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成不可修復(fù)的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

1 鐵代謝

研究表明，植物中的非血紅素Fe3+與動物中的血紅素Fe2+[3]，均能夠被人體吸收后轉(zhuǎn)化為鐵元素。鐵和鐵的衍生物在參與細(xì)胞代謝過程中，如果含量超過正常范圍會引發(fā)Fe2+過多地參與芬頓反應(yīng)，衍生大量羥基自由基，進而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)過氧化物聚積過多，抑制鐵的活性或誘發(fā)鐵死亡。

1.1 鐵的吸收與轉(zhuǎn)運

非血紅素Fe3+在與細(xì)胞色素B接觸之后，兩者會產(chǎn)生還原反應(yīng)生成大量Fe2+，隨后在二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1（divalent metal transporter 1, DMT1）的輔助下，F(xiàn)e2+進入小腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cell, IEC），借助IEC 的吸收使血紅素Fe2+逐漸被機體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞鐵。另一方面，細(xì)胞外部的Fe3+和轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin, TF）具有極高的相溶性，獨立的TF分子能夠同時驅(qū)使兩個Fe3+朝鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1, TFR1）表面遷移，最終衍生出TF-[Fe3+]2-TFR1復(fù)合物[4]，其能夠快速到達細(xì)胞內(nèi)部，通過與細(xì)胞溶酶體反應(yīng)，在溶酶體酸性環(huán)境中，生成大量作用于活性鐵還原酶STEAP3的Fe3+，STEAP3在細(xì)胞質(zhì)中通過催化還原反應(yīng)生成Fe2+。過多的Fe2+，不斷參與芬頓反應(yīng)，同時產(chǎn)生過量的過氧化物。并且被細(xì)胞膜上鐵轉(zhuǎn)運蛋白氧化轉(zhuǎn)變?yōu)镕e3+，最終被遷移至細(xì)胞外側(cè)[5]。

1.2 鐵代謝失衡

疾病發(fā)生時，TF與胞膜上的TFR1結(jié)合增加，造成細(xì)胞內(nèi)的鐵離子負(fù)載增加[6]，游離鐵能夠加大芬頓反應(yīng)和過氧化氫反應(yīng)，催化生成大量羥基自由基和活性氧（reactive oxygen species, ROS），其可進一步攻擊細(xì)胞膜與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA結(jié)構(gòu)，引發(fā)細(xì)胞初始結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞功能變化。

2 脂質(zhì)代謝

多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids,PUFAs）劃分為ω-3類與ω-6類[7]。其中ω-3類PUFAs對人體具有較大益處，如：花生四烯酸（arachidonic acid, AA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）、二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid,EPA）等。

2.1 脂質(zhì)代謝的脂酰輔酶A合成酶家族

從化學(xué)性質(zhì)上看，脂肪酸并不活躍，只有ATP、輔酶A 、鎂離子等較為充足的情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體外膜中的脂酰輔酶A合成酶（acyl-CoA synthetases, ACSL）才能對脂肪酸產(chǎn)生催化作用，使之轉(zhuǎn)化為能夠在特定通路代謝的脂酰輔酶A，從催化脂肪酸碳鏈長度上看，ACSL具有長鏈、中鏈、短鏈3種類型，例如長鏈脂酰輔酶A合成酶4（long-chain acyl-CoA synthetase 4, ACSL4）。在ACSL家族中，能夠被其催化的脂肪酸碳鏈數(shù)量介于12～20個[8]。與之相關(guān)的研究結(jié)果證實，機體中的脂肪酸代謝過程離不開ACSL家族的參與，而ACSL家族的核心作用就是提供脂肪酸代謝[9]。在哺乳動物中，ACSL的同工酶主要有ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5、ACSL6共5個種類。雖然所有亞型催化過程與酶促反應(yīng)具有較高的相似性，但酶動力學(xué)特征、反應(yīng)物質(zhì)、亞細(xì)胞定位存在較大差異，因此每種亞型引導(dǎo)脂肪酸走向特定的代謝通路，由此所引起的疾病也是不同的。心臟和脂肪組織，以及骨骼肌中的ACSL1表達水平最高[10]，胚胎發(fā)育階段的ACSL3表達水平最高，類固醇生成組織中的ACSL4含量較多，且分布較為均勻，小腸是ACSL5的重要聚積場所，ACSL6只能在大腦中得到表達。在亞細(xì)胞定位方面，ACSL4則是以過氧化物酶體與線粒體相關(guān)聯(lián)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜為定位，在鐵死亡中與溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase3, LPCAT3）構(gòu)成脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵蛋白。

2.2 鐵死亡中的ACSL4、LPCAT3通路蛋白

PUFAs作為細(xì)胞膜磷脂雙分子層不可缺少的重要成分，是細(xì)胞膜流動過程的重要作用物質(zhì)。磷脂在含有大量PUFAs的情況下，極有可能轉(zhuǎn)化為加速細(xì)胞的鐵死亡的過氧化脂質(zhì)。因此，PUFAs含量與定位是決定細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度和鐵死亡程度的兩大要素。脂質(zhì)過氧化主要是氧化劑由初始PUFAs中的二烯丙基亞甲基群中俘獲穩(wěn)定性較差的氫原子，在過氧化作用下形成脂質(zhì)過氧化自由基和脂質(zhì)過氧化氫[11]。脂質(zhì)的代謝過程主要經(jīng)歷了兩個階段：①多不飽和脂肪酸的磷脂（polyunsaturated fattyacid-phosphatidyl ethanolamine,PUFA-PE）合成階段，游離PUFAs在該階段主要負(fù)責(zé)為合成脂質(zhì)信號傳導(dǎo)遞質(zhì)提供底物。②過氧化階段，該階段會產(chǎn)生酯化膜磷脂，如果膜磷脂未形成或未發(fā)生過氧化反應(yīng)，就無法產(chǎn)生鐵死亡信號。大量脂質(zhì)組學(xué)研究證實，DHA和EPA等為ACSL4更偏好利用的PUFAs，其在ACSL4的作用下會?；磻?yīng)為PUFA-CoA，然后通過溶血磷脂酰膽堿?；cLPCAT3結(jié)合，催化形成酯化物，隨后不斷和細(xì)胞中的磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine, PE）產(chǎn)生反應(yīng)，生成大量PUFA-PE，同時LPCAT3會持續(xù)不斷的將PUFA-PE轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上，使兩者不斷的融合內(nèi)化，PUFA-PE此時的過氧化定位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。隨著細(xì)胞內(nèi)PUFA-PE不斷地產(chǎn)生與積累，脂質(zhì)過氧化步驟啟動。具體來說，過氧化反應(yīng)有兩種形式，一種是無酶參與的脂質(zhì)過氧化；另一種是有酶參與的脂質(zhì)過氧化。其中，沒有酶參與的脂質(zhì)過氧化實際上是脂質(zhì)自身的氧化反應(yīng)。細(xì)胞中聚集的Fe2+超過臨界狀態(tài)時，會產(chǎn)生過芬頓反應(yīng)持續(xù)釋放大量羥基自由基，PUFAs會持續(xù)氧化反應(yīng)為脂質(zhì)過氧化氫。同時，生成的所有基團均能夠在連鎖反應(yīng)過程中誘導(dǎo)PUFAs的氧化過程，生成大量脂質(zhì)過氧化物。在酶參與的脂質(zhì)過氧化中，脂氧合酶為脂質(zhì)過氧化的催化物，PUFAs首先生成多種類型的脂質(zhì)過氧化氫，然后經(jīng)過Fe2+的催化轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)催化物—烷氧基自由基[12]。脂質(zhì)過氧化能夠生成一些對細(xì)胞活性具有毒害作用的物質(zhì)，一旦這些物質(zhì)超出代謝范圍，就會造成生理功能蛋白活性下降，誘發(fā)鐵死亡。氧化反應(yīng)持續(xù)過程中，PUFAs會逐漸耗竭，原有細(xì)胞膜的流動性結(jié)構(gòu)隨之發(fā)生較大變化，膜的通透性會增強，從而加速細(xì)胞死亡。需要指出的是，在Fe2+過量的情況下，F(xiàn)e2+不僅會參與自由基形成過程，也會對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)起到積極的催化作用。由此可見ACSL4和LPCAT3在鐵死亡發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，由此可以確定，如果給予相應(yīng)抑制劑降低ACSL4、LPCAT3的生成量，即可減少鐵死亡發(fā)生率，這對相關(guān)疾病的治療具有重大意義。

3 氨基酸代謝

哺乳動物細(xì)胞膜上的胱氨酸-谷氨酸交換轉(zhuǎn)運體Sys-temXc-集中度較高，其結(jié)構(gòu)為輕鏈亞基和重鏈亞基組成，二硫鍵在其中發(fā)揮著重要的鏈接作用[13]。Sys-temXc-可促進細(xì)胞中的谷氨酸向細(xì)胞外部轉(zhuǎn)移，讓細(xì)胞外的胱氨酸向細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)移，從而生成能夠輔助谷胱甘肽（glutathione, GSH）合成的半胱氨酸。GSH在細(xì)胞內(nèi)部主要起到抗脂質(zhì)氧化作用，能夠拮抗鐵死亡過程。因此，細(xì)胞抗脂質(zhì)氧化能力強弱可根據(jù)半胱氨酸豐度大小進行判定。在細(xì)胞內(nèi)部Sys-temXc-系統(tǒng)活躍度不高時，細(xì)胞依然能夠在轉(zhuǎn)硫途徑的引導(dǎo)下合成半胱氨酸。GSH能夠加強細(xì)胞的氧化抗性，避免出現(xiàn)氧化物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)過度積累。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase4, GPX4）是由大量硒蛋白成分組成，可通過GSH輔助因子進行活性調(diào)節(jié)。一些研究結(jié)果證實GPX4的合成過程需要Sys-temXc-參與。GPX4對于鐵死亡過程具有積極的調(diào)節(jié)作用，能夠通過脂質(zhì)修復(fù)酶和GSH的反應(yīng)物質(zhì)脂質(zhì)過氧化氫生成不具備細(xì)胞毒性的脂質(zhì)醇，使氫過氧化物產(chǎn)生量減少，從而抑制脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程，降低鐵死亡發(fā)生率。簡而言之，GPX4能夠使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的物質(zhì)還原為脂質(zhì)醇，減少脂質(zhì)過氧化程度。Zhao Y等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的GPX4表達水平顯著高于正常組織，腫瘤患者的GPX4表達水平越高，預(yù)后效果越差。同時，他還采用能夠?qū)﹁F死亡起到誘導(dǎo)作用的RSL3誘導(dǎo)GPX4表達，發(fā)現(xiàn)RSL3不僅抑制了GPX4表達能力，還顯著提高了化療藥物對腫瘤組織的治療效果，即化療能明顯改善化療藥物的抗腫瘤作用。另外有相關(guān)研究表明，Erastin能夠抑制Sys-temXc-的生物學(xué)活性，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[15]。

4 3條途徑的相互聯(lián)系

正常新陳代謝中，細(xì)胞會自然代謝出脂質(zhì)氫過氧化物[16]，而GPX4能夠?qū)⑵溥€原為脂質(zhì)醇，降低細(xì)胞過氧化程度，保護細(xì)胞活性。在細(xì)胞鐵數(shù)量過多且脂質(zhì)代謝功能異常的情況下，脂質(zhì)氫過氧化物數(shù)量將顯著增加，導(dǎo)致GPX4快速耗竭。過量脂質(zhì)氫過氧化物能夠在Fe2+介導(dǎo)后通過芬頓反應(yīng)轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)自由基，通過與PUFAs反應(yīng)，加強脂質(zhì)過氧化程度，使原有的細(xì)胞膜理化性質(zhì)發(fā)生突變，細(xì)胞膜厚度減小，細(xì)胞外氧化劑對細(xì)胞滲透能力增強，細(xì)胞內(nèi)的代謝狀態(tài)隨之改變，大量脂質(zhì)自由基沉淀在細(xì)胞內(nèi)部，直至過氧化的下游的毒性產(chǎn)物在生化通路中的數(shù)量不斷增加，細(xì)胞氧化失去平衡，造成細(xì)胞鐵死亡。

5 皮肌炎的鐵死亡抑制胰島素/Akt信號通路

在正常的新陳代謝中，胰島β細(xì)胞會自動分泌大量能夠在血管通路中流動的胰島素，一旦胰島素達到骨骼肌組織便會與細(xì)胞膜胰島素受體α亞基結(jié)合起來，激活β亞基蛋白酪氨酸激酶，磷酸化胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1,IRS-1）。IRS-1在活躍狀態(tài)下能夠持續(xù)向磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）傳輸刺激信號[17]，而PI3K則會通過下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路刺激磷酸化蛋白激酶B（protein kinase B, PKBAkt），使之進入活躍狀態(tài)[14]。Akt在激活之后能夠?qū)Σ骖^框蛋白O3轉(zhuǎn)錄因子（forkhead box O3, FoxO3）起到抑制作用，從而實現(xiàn)以FoxO3表達為引導(dǎo)的肌肉特異E3泛素連接酶Atrogin-1/MAFbx產(chǎn)生過程和自噬介質(zhì)Binp3表達過程起到調(diào)節(jié)作用。由于上調(diào)Atrogin-1/MAFbx表達水平能夠激活泛素-蛋白酶體系統(tǒng)功能，促使骨骼肌蛋白分解速度加快；如果Binp3表達能力得到增強，自噬溶酶體通路將被激活，自噬過程將會加速進行。因此，激活維持胰島素/Akt信號通路不僅能夠抑制骨骼肌細(xì)胞內(nèi)蛋白異常分解過程，還能夠顯著改善骨骼肌細(xì)胞的生存環(huán)境。在分泌量非常有限或毒性產(chǎn)物較多的情況下，胰島素/Akt信號通路將被抑制，胰島素對機體的作用顯著減弱，骨骼肌細(xì)胞會自動關(guān)閉當(dāng)前的下游信號通路，激活泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬溶酶體途徑[18]，使骨骼肌細(xì)胞蛋白發(fā)生非正常分解。相關(guān)研究證明，在與腸內(nèi)分泌細(xì)胞膜GPR120結(jié)合過程中，能夠參與其中的PUFAs只有EPA和DHA，兩者的參與會加速分泌胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1, GLP-1）的過程，引發(fā)腸促胰島素效應(yīng)。此外，在使固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）表達能力受到抑制后，EPA與DHA可通過優(yōu)化機體內(nèi)部的脂質(zhì)代謝環(huán)境加快胰島素分泌過程。然而特發(fā)性炎性肌?。╥diopathic inflammatory myopathy, IIM）的鐵死亡發(fā)生時，EPA與DHA作為游離的PUFAs，在ACSL4、LPCAT3的作用下，不斷被消耗，并產(chǎn)生了脂質(zhì)過氧化，即在EPA與DHA被消耗不能發(fā)揮腸促胰島素效應(yīng)等情況下；且其在鐵死亡通路上進一步氧化產(chǎn)生了有害物質(zhì)，抑制胰島素/Akt信號通路的活性，激活了泛素-蛋白酶體與自噬溶酶體通路，加劇了IIM發(fā)生時骨骼肌蛋白的分解，這兩種現(xiàn)象在判斷IIM發(fā)病中骨骼肌組織萎縮癥狀和萎縮是否持續(xù)發(fā)展方面具有重要參考價值。

6 總結(jié)與展望

鐵死亡在最近幾年的研究中關(guān)注程度不斷提高，其發(fā)生后會出現(xiàn)兩種現(xiàn)象，一種是細(xì)胞內(nèi)游離鐵增多，另一種是脂質(zhì)過氧化物含量超標(biāo)。鐵死亡在多種疾病的發(fā)病中起到重要作用，有著復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中鐵代謝，脂質(zhì)代謝，氨基酸代謝為最重要的三條通路，相互影響，共同促進鐵死亡的發(fā)生。大量證據(jù)表明鐵死亡將有望成為免疫系統(tǒng)疾病治療新的研究方向。