藍(lán)莓果實(shí)揮發(fā)物對(duì)黑腹果蠅的引誘效果研究

袁鴻宇 ， 劉丹 ， 徐芳玲

（1. 貴州大學(xué)林學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2. 貴州大學(xué)生物多樣性與自然保護(hù)研究中心, 貴州 貴陽(yáng) 550025；3. 貴州省銅仁市林業(yè)科學(xué)院, 貴州 銅仁 554300）

藍(lán)莓Vacciniumspp. 屬杜鵑花科Ericaceae 越橘屬植物，是多年生小漿果果樹。藍(lán)莓果實(shí)中富含多種營(yíng)養(yǎng)元素，包含花青素、黃酮及其糖苷衍生物、超氧化物歧化酶、酚酸和維生素等[1]，對(duì)人類健康非常有益。近年來(lái)，貴州省藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，截至2020 年底，貴州省藍(lán)莓種植面積達(dá)1.21 萬(wàn)hm2，位居全國(guó)首位[2]。黑腹果蠅Drosophilamelanogaster屬雙翅目Diptera 果蠅科Drosophilidae 果蠅屬Drosophila，是危害藍(lán)莓果實(shí)的主要害蟲。該蟲繁殖能力強(qiáng)、發(fā)育周期短，雌蠅將卵產(chǎn)在藍(lán)莓果皮內(nèi)，使孵化的幼蟲得以取食果肉[3]，造成藍(lán)莓果實(shí)變形、軟化、早落、腐爛等，使藍(lán)莓品質(zhì)變差、產(chǎn)量下降，嚴(yán)重阻礙貴州省藍(lán)莓種植業(yè)的發(fā)展[4-5]。目前，主要使用化學(xué)農(nóng)藥防控黑腹果蠅，但因其以幼蟲鉆蛀到果實(shí)內(nèi)部危害，化學(xué)農(nóng)藥很難接觸到靶標(biāo)，防控效果較差，且長(zhǎng)期使用化學(xué)殺蟲劑，不僅破壞果園生態(tài)環(huán)境，還導(dǎo)致害蟲抗藥性增強(qiáng)。因此，黑腹果蠅的防控是貴州省藍(lán)莓種植園亟待解決的一大難題。

植物揮發(fā)物是植物自身合成并釋放的分子量小、常溫易汽化的親脂性次級(jí)代謝產(chǎn)物，揮發(fā)性次生物質(zhì)包括醛、酮、酯、醇以及萜類化合物等[6-7]。植物揮發(fā)物在調(diào)節(jié)昆蟲與植物的關(guān)系，特別是在昆蟲對(duì)寄主植物的定位、選擇合適的交配或產(chǎn)卵地點(diǎn)方面發(fā)揮著重要作用[8-9]。迄今，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)多種植物的揮發(fā)物對(duì)果蠅具有較好的引誘活性，如韭菜Alliumtuberosum、鳳仙花Impatiensbalsamina、魚腥草Houttuyniacordata、蔥Alliumfistulosum、墨西哥鼠尾草Salvialeucantha、萬(wàn)壽菊Tageteserecta等[10-11]。

目前，利用植物源信息化合物誘殺害蟲是國(guó)際公認(rèn)的害蟲綠色防控技術(shù)，通過(guò)植物揮發(fā)性物質(zhì)干擾昆蟲對(duì)寄主植物的選擇，可降低害蟲的危害，植物揮發(fā)物也可作為害蟲引誘源對(duì)害蟲進(jìn)行誘捕，或者與性信息素引誘劑聯(lián)用，提高誘捕效率[12]。植物揮發(fā)物在害蟲防治中的主要應(yīng)用形式是利用植物揮發(fā)物中的有效成分開(kāi)發(fā)植物源引誘劑和驅(qū)避劑[13]。因此，筆者選取不同成熟度的藍(lán)莓果實(shí)，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC/MS）分析其浸提液的揮發(fā)物成分和相對(duì)含量，利用Y 型嗅覺(jué)儀探究這些揮發(fā)物對(duì)黑腹果蠅的室內(nèi)引誘效果，以期為開(kāi)發(fā)黑腹果蠅的植物源引誘劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑腹果蠅采自貴州省麻江縣藍(lán)夢(mèng)谷藍(lán)莓基地（26°17′ ～ 26°36′N，107°17′ ～ 107°53′E），保存于貴州大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。利用玉米培養(yǎng)基在人工氣候箱中飼養(yǎng)并擴(kuò)繁果蠅，人工氣候箱設(shè)置參數(shù)為溫度（25 ± 1）℃、相對(duì)濕度 60% 、光周期12L:12D。試驗(yàn)采用的是羽化3 d 的黑腹果蠅成蟲。

98%葉醇、98%氧化芳樟醇、98%3-戊酮、95%異戊酸甲酯、98%乙酸葉醇酯、98%α-萜品醇、93%石竹烯、99%異戊酸乙酯、98%2-甲基丁酸乙酯、99%鄰二甲苯、99%二甲基硫醚、99% 2-己烯醛、99%桉葉油醇、98%鯊烯、99%乙酸-2-己烯-1-醇酯、96%2-己烯醇、97%己醛、98%芳樟醇、99%乙酸己酯、99%苯乙烯、99%甲苯、99%正己烷，均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

HP6F890/5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；RXZ-430C 型人工氣候箱，新江南儀器有限公司；SPH 860 色差儀，德國(guó)Colorlite 公司； Y形嗅覺(jué)儀，賽蘭博化學(xué)儀器藥品公司。

1.2 藍(lán)莓果實(shí)成熟度的色度測(cè)定

利用色差儀測(cè)定整個(gè)藍(lán)莓果實(shí)，包括3 個(gè)側(cè)面和底部。采用CIE Lab 表色系統(tǒng)測(cè)定藍(lán)莓果實(shí)的紅度值（a）和黃度值（b）兩個(gè)參數(shù)。每次挑選出50 顆大小均勻、無(wú)機(jī)械損傷的藍(lán)莓果實(shí)，每個(gè)果實(shí)重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3 藍(lán)莓果實(shí)提取物的GC/MS 分析

稱取未熟、半熟、全熟藍(lán)莓果實(shí)各3.0 g，分別粉碎后用3 mL 正己烷室溫下浸提3 次，每次24 h，得到其浸提液[14]，過(guò)濾后置-18 ℃下保存?zhèn)溆?。選擇1 μL 不同成熟度藍(lán)莓果實(shí)浸提液作為供試溶液，利用HP6F890/5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

色譜條件：色譜柱為DB-1MS（30 m × 0.25 mm ×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫50 ℃ 保持1 min，以6 ℃/min 升至250 ℃，保持2 min，運(yùn)行時(shí)間36.34 min，載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），載氣流量為1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源為EI 源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，四級(jí)桿溫度150 ℃，發(fā)射電流34.6 μA，倍增器電壓1 518 V，接口器溫度280 ℃，質(zhì)量掃描范圍45 ～ 350 m/z。

1.4 黑腹果蠅對(duì)藍(lán)莓果實(shí)揮發(fā)性化合物的嗅覺(jué)行為反應(yīng)

使用 Y 型嗅覺(jué)儀測(cè)試藍(lán)莓浸提液中鑒定分離出的化合物對(duì)黑腹果蠅的嗅覺(jué)行為反應(yīng)。 Y 型嗅覺(jué)儀的制作參考申建梅 等[15]的處理方法，測(cè)試前將流速記調(diào)為250 mL/min，取未稀釋的果實(shí)揮發(fā)性化合物5 μL 滴加于濾紙條，放入味源瓶中作為處理組，另一味源瓶中加入等量的正己烷濾紙條作為對(duì)照，待果蠅移動(dòng)到Y(jié) 形管兩臂時(shí)，觀察并記錄Y 形管兩臂中的果蠅數(shù)量。每50 頭成蟲為一組，重復(fù)6 次。每組測(cè)試后及時(shí)調(diào)換Y 型管中的處理臂和對(duì)照臂，將味源瓶用乙醇和水清洗干凈并晾干后使用。

反應(yīng)率(%)=(味源管中果蠅數(shù)量 + 對(duì)照管中果蠅數(shù)量)/測(cè)試果蠅總數(shù) × 100

引誘率(%)=味源管中果蠅數(shù)量/(味源管中果蠅數(shù)量 + 對(duì)照管中果蠅數(shù)量) × 100

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用NIST98 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖鑒別揮發(fā)物成分，峰面積歸一化法測(cè)定各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。使用IBM SPSS Statistics 26.0 單因素方差分析比較藍(lán)莓果實(shí)揮發(fā)性化合物對(duì)黑腹果蠅引誘效果之間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟度藍(lán)莓果實(shí)果皮色澤的變化

藍(lán)莓果實(shí)成熟最明顯的外觀變化是果實(shí)色度的變化。藍(lán)莓果實(shí)成熟度依據(jù)其色度范圍值聚類分為未熟果、半熟果及成熟果（圖1）。未熟果的色度分布在一、二象限，半熟果、全熟果的色度分布在二象限。未熟果的紅度值a 為-6.5 ～ 0，黃度值b 為34.0 ～ 42.0；半熟果的紅度值a 為20.0 ～ 27.5，黃度值b 為2.0 ～ 9.0；全熟果的紅度值a 為12.0 ～ 19.0，黃度值b 為1.5 ～ 5.0。

圖1 不同成熟度藍(lán)莓果實(shí)的表觀特征Fig. 1 The apparent characteristics of blueberry fruits with different maturity

2.2 藍(lán)莓果實(shí)揮發(fā)物成分種類和相對(duì)含量

不同成熟度藍(lán)莓果實(shí)揮發(fā)物的主要化學(xué)成分共21 種，其中以醇類、醛類和酯類為主（表1）。

表1 藍(lán)莓果實(shí)揮發(fā)性組分相對(duì)含量及對(duì)黑腹果蠅的引誘效果Tab. 1 Relative contents of volatile compounds from blueberry fruit and attractive effect on D. melanogaster

未熟果主要含有15 種揮發(fā)物質(zhì)，相對(duì)含量97.73%，醇類相對(duì)含量最多，可達(dá)53.58%；半熟果主要含有11 種揮發(fā)物質(zhì)，相對(duì)含量93.06%，醛類相對(duì)含量最多，可達(dá)65.37%；成熟果中主要含有13 種揮發(fā)物質(zhì)，相對(duì)含量90.47%，其中5 種醇類物質(zhì)相對(duì)含量為36.97%，而4 種酯類相對(duì)含量31.68%。

不同成熟度藍(lán)莓果實(shí)含己醛、2-己烯醛、2-己烯醇、鄰二甲苯、α-萜品醇5 種共同揮發(fā)物成分，但含量差異較大，其中醇類相對(duì)含量較高。未熟果含有7 種特有揮發(fā)物，即石竹烯、乙酸己酯、乙酸-2-己烯-1-醇酯、3-戊酮、二甲基硫醚、甲苯和鯊烯；全熟果含有1 種特有揮發(fā)物，即異戊酸甲酯。

2.3 黑腹果蠅對(duì)藍(lán)莓果實(shí)揮發(fā)性化合物的嗅覺(jué)行為反應(yīng)

黑腹果蠅對(duì)藍(lán)莓果實(shí)21 種揮發(fā)性化合物均具有較強(qiáng)的嗅覺(jué)反應(yīng)，平均反應(yīng)率在89.00%左右，黑腹果蠅對(duì)藍(lán)莓果實(shí)21 種揮發(fā)性化合物的嗅覺(jué)反應(yīng)率差異不顯著（表1），只有甲苯具有一定的驅(qū)避作用。其中引誘率超過(guò)80.00%的揮發(fā)性化合物有5 種，引誘率由高到低依次為葉醇，氧化芳樟醇，3-戊酮，異戊酸甲酯，乙酸葉醇酯，分別為92.49%，91.32%，89.07%，87.97%，81.60%；引誘效果最弱的為苯乙烯和乙酸己酯，引誘率均在50%左右。

3 結(jié)論與討論

目前，已有眾多學(xué)者進(jìn)行了關(guān)于越橘屬揮發(fā)物的收集以及成分分析的研究，但不同品種、不同發(fā)育階段、不同地區(qū)越橘屬的揮發(fā)性物質(zhì)組分及其含量差異很大[16]。Lugemwa 等[17]研究發(fā)現(xiàn)矮叢越橘Vacciniumangustifolium果實(shí)中醇類物質(zhì)含量高達(dá)25% ～ 40%；胡秋麗[18]研究發(fā)現(xiàn)，北高叢越橘的主要成分為芳樟醇、α-松油醇，而南高叢越橘的主要成分為芳樟醇、葉醛等。本試驗(yàn)中，從藍(lán)莓果實(shí)揮發(fā)物中鑒定出21 種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括醇類、酯類、醛類、苯類、萜烯類，藍(lán)莓果實(shí)未成熟時(shí)以醇類和醛類為主，在成熟期轉(zhuǎn)變?yōu)榇碱惡王ヮ悾麑?shí)揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生與成熟度密切相關(guān)[19]。

植食性昆蟲通過(guò)識(shí)別植物揮發(fā)物的特定組分或常見(jiàn)組分的特定比例來(lái)識(shí)別寄主植物，進(jìn)而對(duì)寄主植物作出特定的行為選擇[20]。果蠅同樣是依靠嗅覺(jué)系統(tǒng)完成寄主定位，并對(duì)取食和產(chǎn)卵場(chǎng)所進(jìn)行定位[21]。目前，學(xué)者們?cè)诩闹髦参飺]發(fā)物對(duì)昆蟲引誘效果的研究方面進(jìn)行了大量的探討，但寄主植物揮發(fā)物對(duì)黑腹果蠅引誘效果的研究較少。本試驗(yàn)中，測(cè)定了藍(lán)莓果實(shí)中21 種揮發(fā)性化合物對(duì)黑腹果蠅的引誘效果，除甲苯表現(xiàn)為一定的驅(qū)避性外，其他20 種成分均表現(xiàn)出一定的引誘效果。其中葉醇、氧化芳樟醇、3-戊酮、異戊酸甲酯和乙酸葉醇酯的引誘效果高達(dá)80%以上。

植物揮發(fā)性信息化學(xué)物質(zhì)在植食性昆蟲的寄主選擇中起著重要作用，這為黑腹果蠅防治新技術(shù)研究提供了新思路。植物信息化學(xué)物質(zhì)在害蟲的綜合防治中具有維護(hù)物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性等眾多優(yōu)點(diǎn)，符合對(duì)害蟲可持續(xù)控制的目標(biāo)[8]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，可以利用葉醇、氧化芳樟醇作為引誘源，制作專一誘捕黑腹果蠅的誘捕器，在一定程度上控制黑腹果蠅的危害程度，也不會(huì)干擾其他昆蟲。

本試驗(yàn)中，只測(cè)試了藍(lán)莓果實(shí)揮發(fā)性化合物的引誘效果，不同揮發(fā)物混合液的引誘效果如何并未知曉，后續(xù)可以考慮將不同有效成分按照特定比例混配，并確定不同有效成分間的最佳配比。Dickens等[22]研究發(fā)現(xiàn)，將反-2-己烯醛和性信息素結(jié)合可誘捕到更多的地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata。性信息素與藍(lán)莓果實(shí)揮發(fā)物成分混合是否對(duì)引誘黑腹果蠅具有增效作用，還有待進(jìn)一步研究。