LC-MS/MS測定牛奶中四環(huán)素殘留量的不確定度評定

馮翀 王小喬 潘秀麗 馬建忠

摘 要：目的：分析評定《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31658.17—2021）檢驗方法中牛奶獸藥殘留四環(huán)素測量結(jié)果的不確定度。方法：根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）、參照GB 31658.17—2021方法測定牛奶中四環(huán)素含量。通過對牛奶中四環(huán)素殘留量檢測過程中相關(guān)不確定度分量進行數(shù)學(xué)建模，分析評定牛奶中獸藥殘留四環(huán)素測量結(jié)果的不確定度。結(jié)果：牛奶中四環(huán)素測量的擴展不確定度為1.197 4 μg·kg-1，牛奶中四環(huán)素殘留量測定結(jié)果為（41.58±1.197 4） μg·kg（k=2）。結(jié)論：在四環(huán)素的檢測中，可通過控制標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程、增加標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的測量次數(shù)和提高儀器的穩(wěn)定性和靈敏度等方法來提高四環(huán)素檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

關(guān)鍵詞：牛奶；四環(huán)素；不確定度；評定

Abstract： Objective： To analyze and evaluate the uncertainty of the measurement results of tetracycline residue in milk in GB 31658.17—2021 test method. Method： The content of tetracycline in milk was determined according to JJF 1059.1—2012 and GB 31658.17—2021. The uncertainty of the measurement result of tetracycline residue in milk was analyzed and evaluated by mathematical modeling of the correlation uncertainty in the detection process of tetracycline residue in milk. Result： The extended uncertainty of the measurement of tetracycline in milk was?1.197 4 μg·kg-1， and the residual determination of tetracycline in milk was （41.58±1.197 4） μg·kg-1 （k=2）. Conclusion： The accuracy and reliability of tetracycline detection can be improved by controlling the preparation process of the standard solution， increasing the measurement times of the standard curve solution and improving the stability and sensitivity of the instrument.

Keywords： milk; tetracycline; uncertainty; evaluation

四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生，具有抑菌作用，是畜牧養(yǎng)殖業(yè)治療和控制傳染病的最重要的廣譜抗生素之一，對肺炎球菌、衣原體和支原體等有防治作用[1]，被廣泛應(yīng)用于動物疾病的預(yù)防和治療[2]。因四環(huán)素在畜牧養(yǎng)殖中的濫用，造成牛奶中四環(huán)素藥物殘留，使得牛奶食品安全存在一定風(fēng)險[3]。測定牛奶中四環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)方法主要是LC-MS/MS法。評定測量結(jié)果的不確定度是確認四環(huán)素殘留量檢測準(zhǔn)確性的主要方法。本文參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31658.17—2021）、《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）進行牛奶中四環(huán)素殘留量的不確定度評定，查找影響四環(huán)素殘留量檢測過程的關(guān)鍵因素，在檢測過程中，把控影響檢驗結(jié)果的關(guān)鍵因子，以期提高檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，為政府部門監(jiān)管牛奶食品安全以及企業(yè)控制牛奶的產(chǎn)品質(zhì)量提供幫助[4]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛奶，超市購買。

四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（純度：96.9%）；色譜純甲醇；色譜純乙腈；色譜純甲酸；超純水等。

安捷倫高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；旋渦振蕩儀；電子天平；移液器等。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢驗依據(jù)

檢測依據(jù)為《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31658.17—2021）。

1.2.2 樣品處理

精密稱取5 g牛奶樣品，放入50 mL離心管中，加入陶瓷均質(zhì)子和8 mL Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液。使用旋渦振蕩儀對離心管渦旋處理1 min，再經(jīng)超聲處理后收集離心管中的上清液。在離心管剩余殘渣中加入8 mL磷酸鹽緩沖液，重復(fù)上述操作，再次提取上清液。將兩次提取到的上清液合并，混勻后，凈化提取液，收集洗脫液，氮吹至干。在吹干后的洗脫液中加入1.00 mL復(fù)溶液（水∶甲醇∶乙腈=8∶1∶1），渦旋處理1 min，離心處理5 min（14 000 r·min-1），經(jīng)微孔濾膜過濾后，上機測定該牛奶樣品待測液[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測量不確定度的來源分析

根據(jù)牛奶中四環(huán)素殘留量測定過程，可以得到牛奶中四環(huán)素殘留量的不確定度來自牛奶樣品稱量、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量和溶液配制、儀器檢測以及測量過程中的隨機效應(yīng)，分別計算對牛奶四環(huán)素殘留量檢測結(jié)果有影響的不確定度的分量，即牛奶樣品稱樣量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m）、牛奶樣品定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V）、牛奶樣品濃度測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（c）和樣品重復(fù)性實驗引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（ref），評定LC-MS/MS測定牛奶中四環(huán)素的不確定度。

2.2 不確定度分量的評定

2.2.1 牛奶樣品稱樣引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m）

精密稱取5 g牛奶樣品，按照均勻分布，k=，當(dāng)天平最大允許差為±0.5 mg時，牛奶樣品質(zhì)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

萬分之一的天平分辨率為0.1 mg時，牛奶樣品質(zhì)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則牛奶樣品稱取樣引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2 牛奶樣品定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V）

使用最大允許誤差為0.60%的艾本德1 mL移液槍定容樣品溶液，按照均勻分布，定容牛奶樣品體積V的引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

考慮到溫度效應(yīng)，假設(shè)在實驗室溫度（20±3） ℃下進行定容，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4 ℃-1，則水的膨脹系數(shù)引入的不確定度為

甲醇的膨脹系數(shù)為1.19×10-3 ℃-1，則甲醇的膨脹系數(shù)引入的不確定度為

乙腈的膨系數(shù)為1.37×10-3 ℃-1，則乙腈的膨脹系數(shù)引入的不確定度為

則定容牛奶樣品體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.3 牛奶樣品濃度測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（c）

（1）四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel1（c）。四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品一級儲備液制備引入的不確定度urel1（c1）。使用最大允許誤差為±0.05 mg的十萬分之一天平稱取四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)物10.84 mg。按照均勻分布，稱量四環(huán)素對照品引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

將上述稱量的對照品定容至10 mL A級容量瓶（最大允許誤差為±0.02 mL）。假設(shè)在實驗室溫度（20±5） ℃下進行定容，甲醇的膨脹系數(shù)為

1.19×10-3/℃-1，按照三角分布，k=，此時四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品一級儲備液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品一級儲備液稀釋引入的不確定度urel1（c2）。將一級標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，所用的器具為100 μL移液槍和100 mL A級容量瓶。使用100 mL A級容量瓶定容引入的不確定度為urel1（c2A）。100 mL A級容量瓶20 ℃時允許誤差為±0.10 mL，假設(shè)服從三角分布，體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

與校正時溫度不同引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則100 mL A級容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

使用100 μL移液槍移液引入的不確定度urel1（c2B）。100 μL移液槍20 ℃時允許誤差為±0.60%，假設(shè)服從均勻分布，體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

與校正時溫度不同引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則100 μL移液槍引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

因此，將四環(huán)素一級標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋成濃度為1.050 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)使用液過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定為

用10 mL A級容量瓶、艾本德100 μL移液槍和艾本德1 mL移液槍將1 050 ng·mL-1的工作溶液配制成濃度為21.00 ng·mL-1、52.50 ng·mL-1、105.00 ng·mL-1、210.00 ng·mL-1、420.00 ng·mL-1和630.00 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線制備過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel1（c3A）。使用10 mL A級容量瓶定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel1（c3A）。10 mL A級容量瓶20 ℃時允許誤差為±0.02 mL，假設(shè)服從三角分布，則體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

與校正時溫度不同引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

10 mL A級容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

使用100 μL移液槍移液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel1（c3B）。100 μL移液槍20 ℃時允許誤差為±0.60%，假設(shè)服從均勻分布，體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

與校正時溫度不同引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

100 μL移液槍引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

使用1 mL移液槍移液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel1（c3C）。1 mL移液槍20 ℃時允許誤差為±0.60%，假設(shè)服從均勻分布，體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

與校正時溫度不同引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

1 mL移液槍引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

故四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線制備過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel2（c）。四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時引入的樣品溶液中四環(huán)素濃度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2（c）為

式中：Sy為標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)點的測量次數(shù)；a為校準(zhǔn)曲線的斜率；b為校準(zhǔn)曲線的截距；Ai為第i次測量時標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積；ci為第i次測量時標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，ng·mL-1。

則四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程及其擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

c為四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點的平均濃度，

則牛奶樣品濃度測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定為

2.2.4 樣品重復(fù)性實驗引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（ref ）

取空白牛奶樣品加標(biāo)，加標(biāo)含量為45 μg·kg-1，經(jīng)提取處理后上機，用標(biāo)準(zhǔn)曲線重復(fù)測試加標(biāo)樣品6次，通過計算得到樣品重復(fù)性測定引入的相對不確定度。

標(biāo)準(zhǔn)偏差的計算公式為

式中：x為牛奶樣品四環(huán)素含量6次檢測的平均值，x=41.58 μg·kg-1；n為檢測次數(shù)，n=6；xi為重復(fù)性實驗中的單次測定值，μg·kg-1。

樣品重復(fù)性實驗引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

樣品重復(fù)性實驗引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 合成不確定度urel（X ）

牛奶中四環(huán)素含量測定不確定度的來源如表1所示。

牛奶中四環(huán)素檢測結(jié)果的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

通過計算得到牛奶樣品的平均值為41.58 μg·kg-1，因此合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4 牛奶四環(huán)素殘留量測量結(jié)果及不確定度評定報告

置信概率取95%時，包含因子k=2，則擴展不確定度為Up=u（X）×k=0.598 7×2=1.197 4 μg·kg-1。則稱取5 g牛奶樣品時，牛奶中的四環(huán)素含量為（41.58±1.197 4） μg·kg-1（k=2）。

3 結(jié)論

結(jié)果表明，牛奶樣品濃度測量是影響實驗結(jié)果的最大因素，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度等都會對不確定度評定產(chǎn)生大的影響，因此可以采取以下措施降低不確定度，如使用純度更高的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，減少四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)使用液的稀釋步驟，使用適合量程的移液設(shè)備，通過增加質(zhì)量控制、人員比對等方式降低隨機誤差，增強檢測人員的專業(yè)技能水平，提升儀器設(shè)備的精確性，最終把控影響檢驗結(jié)果的關(guān)鍵因子，降低隨機誤差以及測量不確定度，確保檢驗檢測過程及結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[6]。

參考文獻

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