一株雞源致病性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性檢測

陶宏衛(wèi)，杜榮雪，郭廣富，練國俊

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.晟寵國際動物醫(yī)院，北京朝陽 100020）

大腸埃希菌（E.coli）俗稱大腸桿菌，為埃希菌屬的代表菌。 大腸桿菌在腸道菌鑒別培養(yǎng)基，如麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長，因發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使指示劑變紅，形成紅色菌落。 大腸桿菌對多種消毒藥敏感，對各種廣譜抗菌藥也敏感，但易產(chǎn)生耐藥性。 多數(shù)大腸桿菌為人和動物腸道內(nèi)的正常菌群成員之一，少數(shù)為致病性細(xì)菌。 致病性大腸桿菌對動物具有致病性， 能引發(fā)人和動物的敗血癥、腹瀉、肺炎、心內(nèi)膜炎、泌尿道感染、幼畜或幼兒腹膜炎、腦炎等。 筆者在學(xué)校獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定了一株致病性雞源大腸桿菌，并進(jìn)行耐藥性檢測，現(xiàn)予以介紹。

1 材料與方法

1.1 材料

普通營養(yǎng)肉湯、 伊紅美藍(lán)瓊脂和藥敏試驗(yàn)的藥敏紙片中的環(huán)丙沙星均購自于杭州天和微生物試劑有限公司； 營養(yǎng)瓊脂和藥敏試驗(yàn)的藥敏紙片中的青霉素G、 氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢噻肟、林可霉素、慶大霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素（多西環(huán)素）、紅霉素、多黏菌素B、復(fù)方新諾明均購自于杭州濱和微生物試劑有限公司；麥康凱瓊脂、氧化酶試驗(yàn)試劑、生化試驗(yàn)?zāi)c桿菌科細(xì)菌生化鑒定管（11 種×10 支）和其配套試劑（補(bǔ)充試劑）、藥敏試驗(yàn)的藥敏紙片中的阿莫西林、鏈霉素均購自于杭州微生物試劑有限公司。 試驗(yàn)動物選用的健康小白鼠由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物房提供； 病料來自于泰州某雞場一病死雞的肝臟。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備及細(xì)菌分離

按說明書完成麥康凱培養(yǎng)基、 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯及伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基的制備。 用滅菌的接種環(huán)取病料， 采用三線分區(qū)畫法接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上， 倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 小時(shí)后取符合大腸桿菌培養(yǎng)特性的紅色菌落，接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基予以純培養(yǎng)。

1.2.2 染色及生化試驗(yàn)

1.2.2.1 革蘭染色

采集菌落， 制備細(xì)菌標(biāo)本片， 進(jìn)行革蘭染色。 染色方法：（1）初染：草酸銨結(jié)晶紫，1～3 分鐘，水洗；（2）媒染：革蘭氏碘液，1～3 分鐘，水洗；（3）脫色：95%酒精，30 秒，水洗；（4）復(fù)染：復(fù)紅染液，1～3 分鐘，水洗，顯微鏡油鏡觀察。

1.2.2.2 氧化酶試驗(yàn)

將析濾紙剪成三角形，沾取菌落后，滴加一滴氧化酶試驗(yàn)試劑，10 秒后觀察結(jié)果。

1.2.2.3 腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管試驗(yàn)

將生化試驗(yàn)?zāi)c桿菌科細(xì)菌生化鑒定管（11種×10 支）和其配套試劑（補(bǔ)充試劑）、37℃恒溫箱已培養(yǎng)24 小時(shí)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和接種針等置于超凈臺。 將腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管用磨砂輪打開，接種針滅菌后，打開營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基沾取菌落，接種于鑒定管中，接種完成后，將鑒定管整齊放在滅菌后平皿中，37℃恒溫箱24小時(shí)后觀察結(jié)果。

1.2.3 動物致病性試驗(yàn)

取營養(yǎng)瓊脂純培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18 小時(shí)后接種小白鼠， 腹腔注射0.2毫升/只；對照組予以腹腔注射無菌生理鹽水，劑量相同。 在12～36 小時(shí)內(nèi)觀察對照組和實(shí)驗(yàn)組小白鼠的發(fā)病情況。 若有小白鼠發(fā)病或死亡，則解剖取其肝臟， 接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基進(jìn)行菌種回收試驗(yàn)，其培養(yǎng)出菌落的特性、形態(tài)和染色反應(yīng)都符合大腸桿菌時(shí)， 判定為致病性大腸桿菌。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

先在玻璃板背后標(biāo)上數(shù)字， 將菌液接種到培養(yǎng)基上，均勻涂開后，按對應(yīng)數(shù)字用小鑷子夾出藥敏試驗(yàn)紙片貼與培養(yǎng)基上， 貼完后放置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 小時(shí)后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 小時(shí)后， 在麥康凱培養(yǎng)基上可見符合大腸桿菌培養(yǎng)特性的紅色菌落（見圖1）。

圖1 麥康凱培養(yǎng)基分離結(jié)果

2.2 染色及生化試驗(yàn)

2.2.1 革蘭氏染色

將分離菌株進(jìn)行涂片、 革蘭氏染色及油鏡觀察，結(jié)果顯示革蘭陰性中等大小的桿菌。

2.2.2 氧化酶試驗(yàn)

由圖2 可看出， 氧化酶試驗(yàn)的結(jié)果呈現(xiàn)陽性。

圖2 氧化酶試驗(yàn)試劑結(jié)果

2.2.3 腸桿菌科生化鑒定

分離菌株接種腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管，獲得該菌株生化鑒定結(jié)果（見表），編號為A632，在編碼鑒定表中查到答案為：大腸埃希氏菌。

2.3 動物致病性試驗(yàn)

大腸桿菌分離株肉湯培養(yǎng)物腹腔接種小白鼠后，在24 小時(shí)左右發(fā)病死亡。 剖檢死亡小白鼠， 取其臟器， 用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離， 結(jié)果培養(yǎng)基上呈現(xiàn)黑色、 有金屬光澤的菌落，符合大腸桿菌生物學(xué)特性的菌落，革蘭氏染色結(jié)果也一致。

根據(jù)以上試驗(yàn)的結(jié)果， 判定為該分離菌為雞源致病性大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)CLSI 標(biāo)準(zhǔn), 對抑菌圈直徑按照 “耐藥”、“敏感”、“中度”的判斷。 藥敏結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)：＜10 毫米為低度敏感，10～20 毫米為中度敏感，＞20 毫米為高度敏感。 結(jié)果顯示分離菌株對多種抗生素均有不同程度的耐藥， 其中對頭孢噻肟高度敏感，對慶大霉素、頭孢曲松和多粘菌素B 均中度敏感， 對其他藥物呈現(xiàn)低度敏感或者無敏感性。

3 分析與討論

麥康凱培養(yǎng)基或伊紅美藍(lán)平板培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)室常用于大腸桿菌的分離。 本次試驗(yàn)首先使用麥康凱培養(yǎng)基從病死雞的肝臟中分離到符合大腸桿菌生長特性及形態(tài)染色特點(diǎn)的細(xì)菌，然后借助生化試驗(yàn)完成大腸桿菌的鑒定。 對致病性試驗(yàn)發(fā)病的小白鼠取肝臟， 接種于伊紅美藍(lán)平板培養(yǎng)基進(jìn)行菌種回收試驗(yàn)， 獲得了較好結(jié)果。

當(dāng)前家禽養(yǎng)殖業(yè)大腸桿菌存在一定程度的耐藥情況。 林安等報(bào)道，某鴨場分離的大腸桿菌呈四重耐藥；劉萍等報(bào)道，某雞場分離的大腸桿菌對氨芐青霉素、四環(huán)素和氧氟沙星等10 種以上藥物具有耐藥；白茹等報(bào)道，一雞群大腸桿桿菌分離株對大部分藥物的敏感性較低， 表現(xiàn)為多重耐藥。 本次試驗(yàn)對分離到大腸桿菌菌株進(jìn)行14 種藥物的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果：對青霉素G、氨芐西林、 阿莫西林等7 種藥物耐藥， 且對四環(huán)素、 頭孢曲松、 慶大霉素等6 種藥物敏感度很低，僅對頭孢噻肟高度敏感。 這可能與臨床上藥物使用種類繁多、藥物濫用等因素有關(guān)。

分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果

從整體來看， 大腸桿菌的多重耐藥性十分嚴(yán)重，有實(shí)驗(yàn)證明，飼養(yǎng)場內(nèi)多重耐藥的大腸桿菌在人體與動物之間傳播， 有擴(kuò)散的現(xiàn)象。 因此，建議臨床上使用抗生素時(shí)，采用聯(lián)合用藥、輪換用藥和科學(xué)給藥等措施， 降低耐藥性的產(chǎn)生。 另外，根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，合理選擇藥物，有利于獲得良好的治療或預(yù)防效果， 也避免因使用耐藥性的抗生素而增加養(yǎng)殖的成本。 根據(jù)結(jié)果選擇抗菌性高的藥物， 嚴(yán)格控制藥物劑量和使用時(shí)間， 也能在一定程度上減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。