大豆GmNCED1-2的非生物脅迫誘導(dǎo)表達及其轉(zhuǎn)基因煙草鑒定

于海偉, 李銘楊, 張 軍, 李珊珊, 張梅娟, 馬天意, 趙 艷, 蘭紅宇, 翟 瑩

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006; 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院,黑龍江 齊齊哈爾 161005; 3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院齊齊哈爾分院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

脫落酸(Abscisic acid,ABA)是以異戊二烯為基本單位的半萜烯化合物。作為植物的重要激素,ABA不僅具有促進種子休眠、影響根系結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉、促使葉片衰老脫落等多種生理作用[1],還參與逆境條件下植物的適應(yīng)過程[2]。在ABA合成路徑中,9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)是一種關(guān)鍵的限速酶[3],該酶由NCED基因編碼。因此,NCED基因的表達量直接影響植物體內(nèi)ABA的含量。

第1個NCED基因是從玉米中克隆而來[4]。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)NCED基因在植物中常以多基因家族的形式出現(xiàn)。擬南芥NCED基因家族包括9個成員,其中5個成員(AtNCED2、AtNCED3、AtNCED5、AtNCED6、AtNCED9)的編碼產(chǎn)物具有NCED酶活性,參與ABA的合成[5]。AtNCED3與擬南芥的抗旱性相關(guān),過表達AtNCED3的轉(zhuǎn)基因植株抗旱性得到提高[6-7]。AtNCED6和AtNCED9與種子萌發(fā)過程中的ABA合成相關(guān)[5]。此外,AtNCED9還參與高溫脅迫下ABA的合成和種子萌發(fā)的抑制[8]。AtNCED5與AtNCED3共同參與水分脅迫下的ABA合成,AtNCED5與AtNCED6和AtNCED9則共同調(diào)控種子的休眠[9]。NCED基因在植物基因工程中的應(yīng)用也在逐漸開展。在擬南芥中異位表達甘藍型油菜BnNCED3促進了擬南芥種子休眠,使開花期提前,植株的抗逆性也得到提高[10]。番茄LeNCED1能夠使轉(zhuǎn)基因白三葉植株的ABA含量顯著提高,蒸騰速率顯著下降,從而使長期水分利用效率提高[11]。水稻OsNCED4在擬南芥中的異源表達改變了轉(zhuǎn)基因植株大小和葉片形狀,延緩了種子萌發(fā)并導(dǎo)致萌發(fā)后的植株生長對糖超敏感,增強了對干旱脅迫的耐受性[12]。過表達野海棠MhNCED3的轉(zhuǎn)基因擬南芥對滲透和鎘脅迫的耐受性增強[13]。AtNCED3的過表達則能夠提高溫室和大田條件下轉(zhuǎn)基因大豆的抗旱性[14]。

作為一種重要的油料作物,人們對大豆的功能基因研究始終熱度不減。前人已從大豆中鑒定出一個能夠應(yīng)答非生物脅迫和外源ABA的NCED基因(GmNCED1),其過表達可以提高轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性和抗旱性[15-16]。本研究對大豆中的另一個NCED基因GmNCED1-2進行克隆及功能初探,為其后續(xù)功能研究及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用大豆品種北豆9號、煙草品種NC89、菌種大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌EHA105由本實驗室保存和提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆幼苗非生物脅迫處理 使用Hoagland營養(yǎng)液,參照李銘楊等的方法水培大豆幼苗[17]。播種14 d后,幼苗的第一片三出復(fù)葉已經(jīng)完全展開,此時進行非生脅迫處理。將幼苗移至含有200 μmol/L ABA的Hoagland營養(yǎng)液中處理培養(yǎng)。干旱、高鹽、高溫和低溫處理均參照李銘楊等的方法[17]。在ABA、干旱、高鹽、高溫和低溫處理不同時間點(0 h、1 h、2 h、5 h、10 h和24 h)取幼苗的三出復(fù)葉0.1 g,同時取未經(jīng)處理的幼苗葉片、根和莖各0.1 g,所有取樣均重復(fù)3次,于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實時熒光定量PCR(qPCR) 使用TaKaRa公司RNAiso Plus試劑提取大豆葉片mRNA并反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA(cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Innovagene公司)。以第一鏈cDNA為模板,通過qPCR檢測GmNCED1-2的表達量。20.0 μl qPCR反應(yīng)體系包括cDNA 2.0 μl、上下游引物各0.8 μl、2×TaqSYBR Green qPCR Premix(購自Innovagene公司)10.0 μl,ddH2O補至20.0 μl。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中GmNCED1-2的mRNA序列設(shè)計qPCR引物,上游引物5′-ACGTCGTCCAGAAGCCTTAC-3′,下游引物5′-ATCGTGCATCATGGTGGGTT-3′。內(nèi)參基因為Gmβ-Tubulin,上游引物5′-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3′,下游引物5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′[18]。在BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR儀上設(shè)置參數(shù)如下:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,58 ℃ 30 s,共循環(huán)40次。所有樣品重復(fù)3次計算基因表達量。使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

1.2.3 基因克隆及生物信息學(xué)分析 根據(jù)GmNCED1-2的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)序列設(shè)計PCR擴增引物,上游引物5′-GGAATTCCATATGATGGCATCATCAGCAGCAGC-3′,下劃線代表NdeI酶切位點;下游引物5′-GGAATTCTCAAGCTTGTTTCCTCAAATCATT-3′,下劃線代表EcoRⅠ酶切位點。以大豆cDNA為模板,PCR擴增GmNCED1-2完整ORF序列,PCR退火溫度設(shè)為60 ℃。PCR擴增產(chǎn)物回收后與pMD18-T克隆載體(購自TaKaRa公司)連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒通過雙酶切驗證。菌液寄送生工生物工程有限公司進行測序。GmNCED1-2蛋白相對分子質(zhì)量及等電點的預(yù)測使用在線網(wǎng)址https://web.expasy.org/compute_pi/。GmNCED1-2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測使用在線網(wǎng)址http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1。GmNCED1-2蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測分析使用在線網(wǎng)址https://www.genscript.com/wolf-psort.html?src=leftbar。使用MEGA軟件構(gòu)建NCED蛋白的系統(tǒng)進化樹。GmNCED1-2啟動子序列的獲取使用在線數(shù)據(jù)庫http://www.plantgdb.org/GmGDB/。啟動子順式作用元件的預(yù)測分析使用在線網(wǎng)址http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/。

1.2.4 植物表達載體構(gòu)建及煙草遺傳轉(zhuǎn)化 使用DNA Ligation Kit(購自TaKaRa公司)將GmNCED1-2與植物表達載體pRI101(購自TaKaRa公司)連接,所用限制性內(nèi)切酶為NdeⅠ和EcoRⅠ。重組載體質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗證后,熱激轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞。煙草的遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌侵染煙草葉盤法[19]。在MS培養(yǎng)基中添加50 mg/L卡那霉素篩選T0代和T1代轉(zhuǎn)基因煙草。使用基因組DNA提取試劑盒(購自TaKaRa公司)提取煙草葉片基因組DNA,通過PCR檢測GmNCED1-2是否整合進入煙草基因組中。通過qPCR檢測GmNCED1-2在T0代轉(zhuǎn)基因煙草中的表達量,檢測方法參照方法1.2.2,退火溫度改為56 ℃,內(nèi)參基因換為煙草Ntα-Tubulin基因,上游引物5′-ATGAGAGAGTGCATATCGAT-3′,下游引物5′-TTCACTGAAGAAGGTGTTGAA-3′[18]。通過SPSS軟件分析數(shù)據(jù)差異顯著性。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草根長及生物量測定 對MS培養(yǎng)基上生長18 d的野生型(Wild type,WT)煙草和T1代轉(zhuǎn)基因煙草的根長和生物量進行測量。通過SPSS軟件分析數(shù)據(jù)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmNCED1-2的克隆及序列分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取一個大豆NCED基因GmNCED1,GenBank登錄號XM014768319,其功能尚未被鑒定。通過PCR從大豆葉片cDNA中克隆獲得基因的完整ORF序列,測序結(jié)果顯示所獲得的序列與GenBank中公布的序列相符。由于大豆中已經(jīng)鑒定出1個GmNCED1基因[15-16],故將本研究中克隆的基因命名為GmNCED1-2。GmNCED1-2位于大豆基因組15號染色體上。GmNCED1-2的核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如圖1所示,GmNCED1-2基因ORF全長1 818 bp,編碼605個氨基酸,預(yù)測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量6.693×104,理論等電點8.00。GmNCED1-2蛋白含有1個RPE65超家族結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列第134位至597位),還含有2個保守序列MIAHPKxDP和HDFAITE及4個保守的組氨酸殘基,這些均屬于NCED蛋白家族特征。GmNCED1-2蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示其位于葉綠體中。

下劃線表示保守的4個組氨酸殘基;陰影部分表示保守序列MIAHPKxDP和HDFAITE;*表示終止密碼子。圖1 GmNCED1-2的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of GmNCED1-2

2.2 NCED蛋白系統(tǒng)進化分析

將功能已經(jīng)得到鑒定的13個植物NCED蛋白與GmNCED1-2蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。進化分析結(jié)果(圖2)表明,GmNCED1-2蛋白與柑橘CrNCED1蛋白和野海棠MhNCED3蛋白的親緣關(guān)系較近,與大豆中的另一個GmNCED1蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

括號里列出的是蛋白質(zhì)GenBank登錄號。圖2 植物NCED蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of plant NCED proteins

2.3 GmNCED1-2表達模式分析

通過qPCR對GmNCED1-2在根、莖、葉中的表達量進行檢測。如圖3所示,GmNCED1-2在葉中的表達量最高,是根中表達量的28.5倍;在莖中的表達量約是根中表達量的4.4倍。通過qPCR對GmNCED1-2在ABA、干旱、高鹽、高溫和低溫處理24 h內(nèi)葉片中的表達動態(tài)進行檢測。如圖3所示,脅迫處理后,GmNCED1-2的表達量均存在升高趨勢。ABA處理后,GmNCED1-2的表達量在1 h和24 h出現(xiàn)2次峰值;干旱處理后GmNCED1-2的表達量升高最明顯,在24 h的表達量是未處理對照(0 h)的455.8倍;高鹽、高溫和低溫處理后,GmNCED1-2表達量峰值分別出現(xiàn)在10 h、5 h和24 h。

圖柱上不同小寫字母表示不同組織間或不同處理時間間差異顯著(P<0.05)。圖3 GmNCED1-2的表達分析Fig.3 Expression analysis of GmNCED1-2

2.4 GmNCED1-2啟動子順式作用元件預(yù)測分析

對GmNCED1-2基因起始密碼子上游2 000 bp的啟動子區(qū)域進行預(yù)測分析,發(fā)現(xiàn)其含有4種逆境及激素響應(yīng)相關(guān)順式作用元件(表1),包括2個脫落酸響應(yīng)元件(ABRE),3個厭氧誘導(dǎo)元件(ARE),1個防御和脅迫響應(yīng)元件(TC-rich repeats)和1個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(TGACG-motif)。這些順式作用元件的存在,與GmNCED1-2能夠應(yīng)答ABA和非生物脅迫的結(jié)果相符合。

表1 GmNCED1-2啟動子順式作用元件預(yù)測

2.5 GmNCED1-2轉(zhuǎn)基因煙草遺傳轉(zhuǎn)化及鑒定

煙草葉片基因組DNA PCR檢測結(jié)果(圖4A)顯示,共獲得3棵GmNCED1-2轉(zhuǎn)基因煙草植株,分別命名為OE1、OE2和OE3。GmNCED1-2在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達量為OE1>OE3>OE2(圖4B)。

A:煙草基因組DNA PCR 檢測;B:GmNCED1-2在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達量;M:Marker(基因大小標(biāo)記);WT:野生型煙草植株;+:pRI101-GmNCED1-2陽性質(zhì)粒;OE1～OE3:T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株。圖柱上不同小寫字母表示不同煙草植株間GmNCED1-2相對表達量差異顯著(P<0.05)。圖4 GmNCED1-2轉(zhuǎn)基因煙草鑒定Fig.4 Identification of GmNCED1-2 transgenic tobacco

2.6 T1代GmNCED1-2轉(zhuǎn)基因煙草根長和生物量分析

對生長18 d的野生型(WT)煙草和GmNCED1-2轉(zhuǎn)基因煙草的根長和生物量進行測定。根長測定結(jié)果(圖5)顯示,WT煙草的根長顯著長于轉(zhuǎn)基因煙草。生物量測定結(jié)果(圖5)顯示,WT煙草的生物量顯著高于轉(zhuǎn)基因煙草。以上結(jié)果表明GmNCED1-2的過表達抑制了轉(zhuǎn)基因煙草根的伸長及植株的生長。

WT:野生型煙草;OE1～OE3:T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株。圖柱上不同小寫字母表示不同煙草植株間差異顯著(P<0.05)。圖5 WT煙草和GmNCED1-2轉(zhuǎn)基因煙草根長和生物量Fig.5 Root length and biomass of WT tobacco and GmNCED1-2 transgenic tobacco

3 討 論

ABA在植物生長發(fā)育及應(yīng)對逆境脅迫過程中的生物合成受NCED基因表達水平的調(diào)控,這一點已經(jīng)得到了廣泛的證實。因此,對NCED基因進行遺傳操作可以提高植物體內(nèi)ABA水平,調(diào)控植物生長發(fā)育并增強其脅迫耐受性[20-21]。盡管從大豆中已經(jīng)鑒定出一個具有非生物脅迫抗性的GmNCED1[15-16],但由于NCED基因為多基因家族基因,且各基因之間存在一定的分工[5-9],因此有必要對大豆中其他NCED基因的功能進行探索。本研究克隆的GmNCED1-2所編碼的蛋白質(zhì)含有一個類胡蘿素裂解酶均有的RPE65結(jié)構(gòu)域,還含有4個保守的組氨酸殘基,這些殘基負(fù)責(zé)與鐵輔因子相結(jié)合[22-24]。以往研究結(jié)果表明,NCED蛋白大多定位于葉綠體中[25-26],因為它們的作用底物位于質(zhì)體中[23]。本試驗也預(yù)測GmNCED1-2蛋白定位在葉綠體中。GmNCED1-2蛋白與CrNCED1蛋白和MhNCED3蛋白的親緣關(guān)系較近,它們可能在功能上存在相似性。MhNCED3可以被干旱、低溫、鹽和鎘脅迫誘導(dǎo)表達,其過表達提高了轉(zhuǎn)基因植株對滲透和鎘脅迫的耐受性[13]。CrNCED1可以被干旱、低溫脅迫和ABA誘導(dǎo)表達[27],這些也為后續(xù)GmNCED1-2的功能鑒定提供了參考。

GmNCED1-2在葉中的表達量最高,在根中的表達量最低,這一結(jié)果與CrNCED1的組織定量結(jié)果一致,意味它們具有組織特異性表達的特點[27]。以往研究結(jié)果也表明,NCED基因可以在不同組織中表達并調(diào)節(jié)ABA的生物合成,包括根、莖和葉,但在根部的表達量往往最低[28]。因此后續(xù)選擇大豆幼苗葉片作為試驗材料,分析GmNCED1-2對非生物脅迫的應(yīng)答情況。GmNCED1-2在不同的脅迫處理下表現(xiàn)出不同的表達模式,這表明存在不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制控制著GmNCED1-2的轉(zhuǎn)錄。GmNCED1-2對干旱脅迫的應(yīng)答最為明顯,其次是高鹽脅迫,但在高溫或低溫脅迫下其表達量的變化不超過10倍。不同NCED基因?qū)Σ煌巧锩{迫的應(yīng)答也不盡相同,例如VuNCED1的表達能夠被干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo),但對ABA和高溫或低溫脅迫無響應(yīng)[29];TaNCED3能夠被ABA誘導(dǎo)表達,但對高鹽和低溫脅迫無響應(yīng)[30];而FvNCED3的表達則被ABA、干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo),但在高溫和低溫脅迫下表達量卻下降[31]。

ABRE是響應(yīng)ABA的主要順式作用元件,常位于脅迫誘導(dǎo)基因的啟動子中[26]。GmNCED2-1啟動子中含有2個ABRE,qPCR結(jié)果也證實ABA可以誘導(dǎo)GmNCED2-1的表達。而TGACG-motif則是響應(yīng)茉莉酸的順式作用元件,茉莉酸信號也參與植物的抗逆機制調(diào)控[32]。此外,GmNCED2-1啟動子中還含有3個厭氧誘導(dǎo)元件和1個防御和脅迫響應(yīng)元件,這些元件的存在表明GmNCED1-2可能受復(fù)雜調(diào)控機制的調(diào)控,是其能夠響應(yīng)多種逆境脅迫的重要原因。

研究結(jié)果表明,用ABA處理擬南芥幼苗,可以抑制主根伸長,濃度過高時會導(dǎo)致幼苗子葉無法張開,不能長出真葉[33]。NCED基因通過控制ABA的合成可以調(diào)控種子萌發(fā)和根系生長等植物生長發(fā)育過程。GmNCED1-2在煙草中的過表達抑制了轉(zhuǎn)基因煙草根的伸長和植株的生長,這應(yīng)該與GmNCED1-2過表達后導(dǎo)致煙草中ABA含量升高相關(guān)。在其他NCED過表達的轉(zhuǎn)基因植物中也存在類似現(xiàn)象。例如,BnNCED3轉(zhuǎn)化擬南芥后促進了擬南芥種子休眠,抑制側(cè)根生長,并使轉(zhuǎn)基因擬南芥提前開花[10]。CrNCED1轉(zhuǎn)基因煙草的根生長速度慢于野生型,但在含ABA的培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)基因煙草的根生長速度則快于野生型,表明ABA對轉(zhuǎn)基因煙草根的生長抑制作用較小[27]。另有文獻報道,干擾NtNCED3-2的表達會抑制煙草初生根的發(fā)育,出現(xiàn)發(fā)育遲緩和葉片腺毛數(shù)量減少的現(xiàn)象[34]。綜上,大豆GmNCED1-2作為NCED基因家族成員能夠響應(yīng)非生物脅迫,其過表達抑制了轉(zhuǎn)基因煙草根的伸長和植株的生長。