基于宏基因組測序的稻蟹共作稻田根際土壤微生物群落功能分析

宋 宇,王 鵬,韋月平

(遼東學院,遼寧丹東 118003)

土壤微生物幾乎參與了土壤生態(tài)系統(tǒng)全部的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化過程[1],是土壤養(yǎng)分循環(huán)和植物對養(yǎng)分利用過程中重要參與者,對維持土壤肥力和植物的生長有重要的作用[2]。根際離根軸表面數(shù)毫米范圍之內(nèi),是土壤-根系-微生物相互作用的微區(qū)域。有研究發(fā)現(xiàn)根系分泌物的改變驅(qū)動了有益微生物在根際部位的富集,從而增加宿主吸收養(yǎng)分、增強宿主抵抗脅迫的能力[3]。農(nóng)作物可通過施用化肥達到增產(chǎn)的目的,但長期大量施用化肥造成土壤板結(jié)及破壞土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu),影響土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化[4]。水稻是世界上重要的糧食作物,現(xiàn)代人們通過在稻田中引入魚、鴨等生物進行復合種養(yǎng)達到了改善土壤環(huán)境和提高水稻產(chǎn)量的目的[5-6]。徐敏等[7]研究稻蟹共生系統(tǒng)不同水稻栽培模式土壤理化性狀和有效養(yǎng)分的變化規(guī)律,結(jié)果表明養(yǎng)蟹稻田可顯著提高土壤中有機質(zhì)、堿解氮、速效磷和有效鉀含量并能提高水稻產(chǎn)量。土壤微生物的早期研究大都基于平板菌落計數(shù)技術(shù)、PCR-DGGE、T-RFLP和焦磷酸測序等不可培養(yǎng)的分子分析,如今隨著基于Illumina Miseq和Illumina Novaseq測序平臺的高通量測序技術(shù)的發(fā)展,土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性和功能的研究得到不斷深入。宋宇等[8]探討了不同稻田共作模式對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響,初步揭示了河蟹的引入增加了稻田土壤細菌群落多樣性,豐富了細菌群落組成;又進一步研究了河蟹對水稻不同生育期根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果表明河蟹引入生物有機肥稻田后土壤細菌的群落結(jié)構(gòu)會隨著生育期發(fā)生一定變化,而這種變化和土壤理化因子密切相關(guān)[9]。目前對水稻根際微生物群落的研究多為基于Illumina Miseq平臺上的群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究[10-13],而對基于Illumina Novaseq宏基因組測序平臺上的的群落功能分析還少見。本文就是以生物有機肥稻田為對照,基于宏基因組測序來分析施入生物有機肥的稻蟹共作稻田根際土壤微生物群落功能差異來揭示河蟹的引入對生物有機肥稻田的水稻根際土壤微生物代謝功能的影響,為共作稻田的栽培模式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 田間試驗和土壤樣品采集

供試水稻是‘越光’大米,試驗地點是丹東東港市北井子鎮(zhèn)蓋家壩有機種植農(nóng)場(39°54′N, 123°50′E),東港市屬北溫帶濕潤地區(qū)大陸性季風氣候。受黃海影響,具有海洋性氣候特點。正常年全年平均氣溫8.4 ℃,降雨量888 mm。設(shè)置施入生物有機肥的稻蟹共作稻田和空白對照的施入生物有機肥稻田的水稻大田試驗,兩種樣地各占地約1 000 m2。對照組生物有機肥稻田的土壤樣品標記為YJTCS,該稻田施用日照益康有機農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的海藻生物有機肥(有機質(zhì)含量≥30%),其分別在3月份和7月份按 1.35 kg/hm2施用。稻蟹共作稻田的土壤樣品標記為HXTCS。該稻田在和對照組等時等量施入生物有機肥的同時又在4月末放入河蟹苗,按 0.5 kg/hm2投放,10月末收蟹。于2020年10月15日(水稻成熟期)在兩種稻田上各設(shè)置3個10 m×10 m的采樣區(qū)域,每個區(qū)域按照5點采樣法選取5個點采用破壞性取樣法將水稻整株挖出,勿傷害根系,抖落大塊土壤后用無菌菌刷刷取根際區(qū)域約1 mm緊密粘附在根表面的土壤,每5株為一個重復,混勻后裝入50 mL離心管中,在 -80 ℃冷凍保存后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行DNA提取和宏基因組測序。

1.2 土壤DNA提取和宏基因組測序

1.3 宏基因組測序分析

使用fastp[14](https://github.com/OpenGene/fastp,version 0.20.0)對reads 3′端和5′端的adapter序列進行質(zhì)量剪切;使用基于succinct de Bruijn graphs原理的拼接軟件MEGAHIT[15](https://github.com/voutcn/megahit,version 1.1.2)對優(yōu)化序列進行拼接組裝,在拼接結(jié)果中篩選≥300 bp的contigs作為最終的組裝結(jié)果;使用MetaGene[16](http://metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)對拼接結(jié)果中的contigs進行ORF預(yù)測。選擇核酸長度≥100 bp的基因,并將其翻譯為氨基酸序列;用CD-HIT[17](http://www.bioinformatics.org/cd-hit/,version 4.6.1)對所有樣品預(yù)測出來的基因序列進行聚類(參數(shù)為:90% identity、90% coverage),每類取最長的基因作為代表序列,構(gòu)建非冗余基因集;使用SOAPaligner[18]軟件(http://soap.genomics.org.cn/,version 2.21),分別將每個樣品的高質(zhì)量reads與非冗余基因集進行比對(95% identity),統(tǒng)計基因在對應(yīng)樣品中的豐度信息;使用Diamond[19](http://www.diamondsearch.org/index.php,version 0.8.35)將非冗余基因集的氨基酸序列與非冗余蛋白庫(Non-Redundant Protein Sequence Database) NR數(shù)據(jù)庫進行比對(BLASTP比對參數(shù)設(shè)置期望值e-value為1e-5),并通過 NR 庫對應(yīng)的分類學信息數(shù)據(jù)庫獲得物種注釋,然后使用物種對應(yīng)的基因豐度總和計算該物種的豐度。

1.4 功能注釋方法及數(shù)據(jù)庫

使用 DIAMOND(https://github.com/bbuchfink/diamond)將非冗余基因集序列與EggNOG數(shù)據(jù)庫進行比對(參數(shù):blastp;E-value ≤ 1e-5),獲得基因?qū)?yīng)的 COG(Clusters of orthologous groups of proteins,直系同源蛋白簇),然后使用 COG 對應(yīng)的基因豐度總和計算該 COG 的豐度。使用 DIAMOND(https://github.com/bbuchfink/diamond)將非冗余基因集序列與 KEGG的基因數(shù)據(jù)庫(GENES)進行比對(參數(shù):blastp;E-value ≤ 1e-5),根據(jù)KO、Pathway對應(yīng)的基因豐度總和計算該功能類別的豐度。使用 CAZy 數(shù)據(jù)庫的對應(yīng)工具 hmmscan 將非冗余基因集與 CAZy 數(shù)據(jù)庫進行比對,比對參數(shù)設(shè)置期望值 e-value 為 1e-5,獲得基因?qū)?yīng)的碳水化合物活性酶注釋信息,然后使用碳水化合物活性酶對應(yīng)的基因豐度總和計算該碳水化合物活性酶的豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物門水平群落組成分析

NR注釋結(jié)果顯示樣品中微生物以細菌為主,約占98.09%,其次為古菌約占1.76%,真菌及其他約占0.15%。由圖1所示,兩種土壤樣品在微生物門水平上共有10個主要菌群,分別是變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、Gemmatimonadetes_d_Bacteria、廣古菌門(Euryarchaeota)、Unclassified_d_Bacteria、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和疣微菌門(Verrucomicrobia)。其中變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)為優(yōu)勢菌門,共占比89.11%。稻蟹共作稻田(HXTCS)中的變形菌門、放線菌門和廣古菌門的相對豐度分別為39.82%、22.79%和 0.97%低于對照組(YJTCS)的42.26%、27.17%和1.98%。而綠彎菌門、酸桿菌門和疣微菌門的相對豐度分別為15.95%、10.15%和1.13%則高于YJTCS的12.93%、7.19%和0.73%。

圖1 微生物門水平群落組成

2.2 2種稻田根際土壤微生物群落的LEfSe分析

為了提供更多關(guān)于2種種養(yǎng)模式稻田的根際土壤微生物群落的信息,使用LEfSe來識別YJTCS和HXTCS中LDA得分高于4.0的從門到屬水平差異豐度分類群。LEfSe采用線性判別分析(LDA)來估算每個物種豐度對差異效果影響的大小。如圖2所示,對根際細菌群落的LEfSe分析表明2種稻田中有16個細菌類群存在顯著差異,只有4個在對照組(YJTCS)中富集,而稻蟹共作稻田(HXTCS)則主要富集綠彎菌門、酸桿菌門及隸屬于二者的相關(guān)目、科、屬等12個分類群。如圖3所示,對根際古菌群落的LEfSe分析表明2種稻田中有13個明顯豐富的分類群。對照組(YJTCS)中只富集3個而稻蟹共作稻田(HXTCS)則富集深古菌門、廣古菌門及隸屬于它們的相關(guān)綱、目、科及屬等10個分類群。如圖4所示,對根際真菌群落的LEfSe分析表明2種稻田中有11個明顯豐富的分類群,對照組(YJTCS)中富集6個,而稻蟹共作稻田(HXTCS)則富集5個分類群。通過2種稻田根際土壤微生物群落的LEfSe分析結(jié)果表明河蟹引入生物有機肥稻田后細菌和古菌群落會富集更多的差異分類群。

圖2 2種稻田根際土壤細菌群落的LEfSe分析結(jié)果

圖3 2種稻田根際土壤古菌群落的LEfSe分析結(jié)果

2.3 基于宏基因組土壤微生物功能注釋

2.3.1 CAZy功能基因注釋 CAZy(Carbohydrate-Active enzymes,碳水化合物活性酶)可分為6大蛋白功能模塊,即輔助氧化還原酶(AAs)、碳水化合物結(jié)合模塊(CBMs)、碳水化合物酯酶(CEs)、糖苷水解酶(GHs)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)和多糖裂解酶(PLs)。如表1所示,HXTCS在6大蛋白功能模塊基因的相對豐度均高于對照組YJTCS。其中GHs、GTs和PLs差異顯著(P<0.05)。

表1 碳水化合物活性酶相對豐度

2.3.2 COG功能基因注釋 將測序結(jié)果EggNOG數(shù)據(jù)庫進行對比(表2),COG(Clusters of Orthologous Groups,蛋白相鄰類的聚簇)將基因功能分為25個大類,包含于四大功能:細胞過程和信號(Cellular processes and signaling)、信息存儲和處理(Information storage and processing)、代謝(Metabolism)和未知的功能特征(Poverty characteristics)。功能注釋結(jié)果表明HXTCS在相對豐度排名前20的基因功能中有19個基因功能的相對豐度均高于對照組YJTCS。其中氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝基因的相對豐度在2種稻田中差異顯著 (P<0.05)。

表2 COG功能蛋白注釋豐度

2.3.3 碳代謝途徑基因注釋分析 宏基因組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種土壤樣品共有16個碳代謝相關(guān)途徑,如表3所示,HXTCS在所有碳代謝途徑的基因注釋的相對豐度均高于對照組YJTCS。其中丙酮酸代謝和原核微生物的碳固定途徑的相對豐度在2種稻田中差異顯著(P<0.05)。

表3 碳代謝途徑基因注釋豐度

2.3.4 氮代謝功能分析 氮代謝在土壤氮素循環(huán)中起到重要作用。本研究主要針對硝化作用、反硝化作用、固氮作用、硝酸鹽還原作用和谷氨酰胺合成等5個氮轉(zhuǎn)化過程(圖5)。宏基因組測序分析結(jié)果顯示硝化作用因相關(guān)酶基因缺失表現(xiàn)不完整。鐵氧還蛋白-硝酸還原酶(EC:1.7.7.2)、硝酸還原酶(醌)(EC:1.7.5.1)、硝酸還原酶(細胞色素)(EC:1.9.6.1)、亞硝酸還原酶(NO生成)(EC:1.7.2.1)、一氧化氮還原酶(細胞色素C)(EC:1.7.2.5)、氧化亞氮還原酶(EC:1.7.2.4)是反硝化過程的關(guān)鍵酶。固氮酶(EC:1.18.6.1)是固氮作用的關(guān)鍵酶。亞硝酸還原酶(EC:1.7.7.1)、亞硝酸還原酶(NADH)(EC:1.7.1.15)、亞硝酸還原酶(細胞色素,氨形成)(EC:1.7.2.2)是硝酸鹽還原作用的關(guān)鍵酶。谷氨酰胺合成酶(EC: 6.3.1.2)、谷氨酸合酶(NADPH)(EC:1.4.1.13)、谷氨酸合酶(NADH)(EC:1.4.1.14)、谷氨酸合酶(鐵氧還蛋白)(EC:1.4.7.1)、谷氨酸脫氫酶(EC:1.4.1.2)、谷氨酸脫氫酶[NAD(P)+] (EC:1.4.1.3)、谷氨酸脫氫酶[NADP+](EC:1.4.1.4)是谷氨酰胺合成作用的關(guān)鍵酶。

圖5 土壤氮素循環(huán)過程

如圖6所示,在反硝化作用中,硝酸還原酶(醌)基因narH和narY、鐵氧還蛋白-硝酸還原酶基因narB、硝酸還原酶(細胞色素)基因napY、亞硝酸還原酶(NO生成)基因nirS、一氧化氮還原酶(細胞色素C)基因norB和氧化亞氮還原酶基因nosZ在HXTCS的相對豐度均高于YJTCS。其中鐵氧還蛋白-硝酸還原酶基因narB和硝酸還原酶(細胞色素)基因napY在HXTCS中的相對豐度都顯著高于YJTCS(P<0.05)。在固氮作用中,固氮酶基nifD和nifK在HXTCS中的相對豐度略低于YJTCS。在硝酸鹽還原作用中,亞硝酸還原酶(NAD基因nirB和nirD在HXTCS中的相對豐度和YJTCS相當,而亞硝酸還原酶nirA基因和亞硝酸還原酶(細胞色素,氨形成)基因nrfA在HXTCS中的相對豐度要高于YJTCS。在谷氨酸合成作用中,谷氨酰胺合成酶基因glnA和GLUL、谷氨酸合酶(NADPH)基因gltB和gltD、谷氨酸合酶(NADH)基因GLT1、谷氨酸合酶(鐵氧還蛋白)基因GLU和gltS、谷氨酸脫氫酶基因gudB和rocG、谷氨酸脫氫酶 [NAD(P)+] 基因GLUD1-2、谷氨酸脫氫酶[NADP+]基因gdhA在HXTCS的相對豐度均高于YJTCS。因此,河蟹引入生物有機肥稻田后促進了根際土壤氮循環(huán)中的反硝化作用、硝酸鹽還原作用及谷氨酸的合成作用。

圖6 氮代謝途徑中主要酶基因的相對豐度

3 討論與結(jié)論

為進一步探討河蟹對生物有機肥稻田的水稻根際土壤微生物群落的影響,利用宏基因組測序技術(shù)對土壤微生物群落和功能進行研究。通過NR物種注釋發(fā)現(xiàn),微生物均以細菌為主,其次為古菌,真菌和病毒等占比很小。微生物群落門水平的組成分析表明河蟹有機肥稻田的綠彎菌門和酸桿菌門的相對豐度均高于對照組。研究證實,大多數(shù)綠彎菌門具有反硝化能力[20]。酸桿菌門具有降解植物殘體多聚物、參與鐵循環(huán)、具有光合能力和參與單碳水化合物代謝的功能[21]。2種稻田根際土壤微生物群落的LEfSe分析結(jié)果表明稻蟹共作稻田中富集更加豐富的深古菌門(Bathyarchaeota)和奇古菌門(Thaumarchaeota)及隸屬于它們的相關(guān)目、屬。深古菌門是地球上數(shù)量最多的古菌群之一,通過宏基因組學研究證實,它們的生理活動與蛋白質(zhì)和纖維素的降解及以二氧化碳的固定有關(guān)[22]。有研究報道奇古菌門菌門是一類可同時參與自然界C、N元素循環(huán)的古菌[23]。

河蟹引入生物有機肥稻田后,增加了碳水化合物活性酶基因的6大蛋白功能模塊即輔助氧化還原酶(AA)、碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)、碳水化合物酯酶(CE)、糖苷水解酶(GH)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)和多糖裂解酶(PL)的相對豐度。其中GH、GT和PL與對照組YJTCS的相對豐度差異顯著。糖苷水解酶(GH)包括大量參與淀粉、纖維素、木聚糖和幾丁質(zhì)等多糖代謝的酶。碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)可與多糖結(jié)合,提高糖苷水解酶(GH)降解復雜碳水化合物的催化效率。碳水化合物酯酶(CE)可降解植物纖維。糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)可裂解酸性多糖中的糖苷鍵。多糖裂解酶(PL)主要作用于陰離子多糖,通過β消除機制降解糖苷鍵。因此,河蟹的引入有助于增強水稻根際土壤微生物對碳水化合物和多糖類物質(zhì)的降解活性。COG功能注釋結(jié)果表明,河蟹的引入也增強了HXTCS在相對豐度排名前20的基因功能中的19個基因功能的相對豐度,尤其是增強了土壤氨基酸和脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運功能。

碳代謝途徑基因注釋分析結(jié)果顯示,HXTCS在宏基因組測序發(fā)現(xiàn)的16個碳代謝相關(guān)途徑的基因注釋的相對豐度均高于對照組。其中HXTCS在丙酮酸代謝和原核微生物的碳固定途徑中的相對豐度均顯著高于對照組。糖酵解是微生物對碳水化合物進行代謝的一種主要方式,是厭氧微生物獲取能量的主要方式[24]。三羧酸(TCA)循環(huán)是糖、脂肪酸和蛋白質(zhì)三大分解代謝的終極途徑,可產(chǎn)生大量的ATP供微生物生長。丙酮酸是糖代謝中具有關(guān)鍵作用的中間產(chǎn)物,可通過三羧酸循環(huán)實現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸間的互相轉(zhuǎn)化,因此,丙酮酸在三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程中起重要的樞紐作用。磷酸戊糖途徑是除了糖酵解之外的另一葡萄糖代謝途徑,不僅能產(chǎn)生大量能量,還可以產(chǎn)生核糖和赤蘚糖等中間產(chǎn)物用于脂肪酸等物質(zhì)的合成。由于CO2濃度升高導致的全球變暖及由此引發(fā)的一些列嚴重問題已引起各國政府的高度關(guān)注,各國都在探索有效的固碳減排途徑,現(xiàn)在已越來越重視農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)在碳固定中的作用[25]。農(nóng)田土壤是一個具有碳固定潛能的潛在碳庫,通過農(nóng)田土壤進行碳固定來緩解碳排放壓力是未來國民經(jīng)濟發(fā)展的一個重要的戰(zhàn)略選擇[26]。碳代謝途徑基因注釋分析結(jié)果表明,河蟹的引入能提升原核微生物的碳固定的能力。

氮代謝在土壤氮素循環(huán)中起到重要作用。氮代謝功能分析結(jié)果表明,河蟹引入生物有機肥稻田后促進了根際土壤氮循環(huán)中的反硝化作用、硝酸鹽還原作用及谷氨酸的合成作用。反硝化作用是將硝酸鹽還原為分子態(tài)氮的過程,是氮循環(huán)的關(guān)鍵一環(huán),在自然界有重要意義,可消除因硝酸積累對生物的毒害作用。硝酸鹽還原是一個耗能的過程,硝酸鹽可被還原為銨并能同化為氨基酸[27]。谷氨酸的合成是無機氮向有機氮轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié)。谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶是谷氨酰胺合成中重要的酶,其酶基因相對豐度高則有助于谷氨酸的合成。土壤中N2固定主要是通過固氮酶來實現(xiàn),HXTCS中固氮酶基因的相對豐度低于對照組,結(jié)果表明,河蟹的引入促進了土壤中反硝化和硝酸鹽還原作用及谷氨酸的合成但并未改善土壤微生物對N2的固定。

利用宏基因組測序技術(shù)分析稻蟹共作稻田根際土壤微生物群落的功能,結(jié)果說明河蟹引入生物有機肥稻田后,增強了根際土壤碳水化合物活性酶的活性和主要代謝通路的代謝活性,有助于碳代謝及促進根際土壤氮循環(huán)中的反硝化作用、硝酸鹽還原作用及谷氨酸的合成作用。但該技術(shù)只能證明微生物群落基因組中存在實現(xiàn)某項功能所需的基因,但基因的存在并不能證明基因一定會表達,因此還需通過宏轉(zhuǎn)錄組和宏蛋白組進一步深入研究探討。