靈芝三萜類物質(zhì)液態(tài)發(fā)酵研究進(jìn)展

馮 杰,劉艷芳,蘇曉薇,唐傳紅,李娥賢,李樹紅,周 帥,張勁松*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,國家食用菌工程技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方食用菌資源利用重點實驗室,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室,上海 201403;2 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所,昆明 650223)

靈芝為多孔菌目靈芝科靈芝屬真菌,日常生活中所說的靈芝都是指靈芝子實體,其是我國最受重視的傳統(tǒng)中藥之一,可藥食兩用[1]。 研究表明:由于靈芝的化學(xué)成分復(fù)雜,使其含有多樣的活性成分[2]。 靈芝已被證明具有治療癌癥、糖尿病和人類免疫缺陷病毒(HIV)病的作用[3],從靈芝中分離出來的主要活性成分有三萜類、多糖類、生物堿類、氨基酸類、油脂類及微量元素等。 靈芝三萜類物質(zhì)因具有抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)血脂和降血糖、抗真菌、抗炎和延緩衰老等作用而日益受到國內(nèi)外研究人員的重視[4-5]。

根據(jù)異戊二烯定則,多數(shù)三萜被認(rèn)為是由6 個異戊二烯縮合而成的。 靈芝三萜是羊毛甾烷類衍生物[6],羊毛甾醇是其前體物,羊毛甾烷型靈芝三萜按結(jié)構(gòu)可分為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜,按碳原子數(shù)可分為C24、C27 和C30[7]。 根據(jù)官能團(tuán)和側(cè)鏈的不同,可將其分為靈芝酸、靈芝醇、靈芝醛和靈芝內(nèi)酯等,以靈芝酸和靈芝醇類為主[8]。

靈芝三萜類物質(zhì)主要存在于野生采摘和人工栽培的子實體或孢子粉以及液態(tài)深層發(fā)酵的菌絲體中。人工栽培主要分為原木栽培和代料栽培[9],原木栽培主要是椴木栽培,選擇以闊葉樹木為主的木頭栽培[10];代料栽培中代料指將樹木的下腳料和其他輔料如木屑、棉籽殼、麩皮等物質(zhì)混合制成的培養(yǎng)基,可分為瓶栽和袋栽,目前袋栽應(yīng)用較為廣泛[11]。 液態(tài)發(fā)酵是在富含必需營養(yǎng)成分的液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)靈芝菌絲體,所獲得的菌絲體具有較高的生物活性,目前主要利用搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng),前者主要進(jìn)行菌種的選育和培養(yǎng)工藝的優(yōu)化,后者則應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[12]。

目前,野生靈芝較為稀少而較難獲取,人工栽培技術(shù)不穩(wěn)定且生長周期較長、成本較高、存在連作障礙,而液態(tài)發(fā)酵技術(shù)有發(fā)酵周期短、培養(yǎng)條件易控、不受環(huán)境影響、生產(chǎn)效益高、可應(yīng)用于工業(yè)化等優(yōu)點[13-15],通過液態(tài)發(fā)酵可獲得高得率的菌絲體及高活性的靈芝三萜。

本文從靈芝三萜生物合成途徑、液態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)靈芝三萜的培養(yǎng)條件調(diào)控、外源物對液態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)靈芝三萜的影響等方面重點闡述靈芝三萜類物質(zhì)液態(tài)發(fā)酵的進(jìn)展,并通過總結(jié)代謝通量方法在微生物發(fā)酵領(lǐng)域的研究進(jìn)展,討論代謝通量在靈芝三萜類物質(zhì)液態(tài)發(fā)酵合成方面的應(yīng)用前景。

1 靈芝三萜類物質(zhì)生物合成途徑

1.1 萜類物質(zhì)生物合成途徑

植物萜類合成主要為質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑和細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸(MVA)途徑。 有研究表明,MEP 途徑合成單萜、二萜和類胡蘿卜素,而MVA 途徑主要合成倍半萜和三萜[16]。 MEP 途徑和MVA 途徑都可以生成前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP),且IPP 可以在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體之間穿梭[17],說明MEP 途徑和MVA 途徑并非獨立存在。 不同數(shù)量的IPP 與DMAPP 結(jié)合生成香葉基二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)、香葉基香葉基二磷酸(GGPP)。GPP、FPP 和GGPP 在萜烯合酶(TPS)的作用下生成不同類型的萜烯[18]。 各類烯丙基焦磷酸酯經(jīng)特異性萜類合酶作用可產(chǎn)生各種萜類的碳骨架,如植烯、鯊烯等[19]。

MEP 途徑主要是以丙酮酸和3-磷酸甘油醛(GAP)通過1-脫氧-5-磷酸-D-木酮糖合成酶(DXS)轉(zhuǎn)化成1-脫氧-木酮糖-5-磷酸(DXP),經(jīng)過多步反應(yīng),最后生成IPP 和DMAPP[18,20](圖1)。 DXS 及DXR 是MEP途徑的兩個關(guān)鍵酶,其活性直接影響下游萜類化合物的合成[16]。

圖1 植物萜類物質(zhì)合成的MEP 途徑Fig.1 MEP pathway for the synthesis of plant terpenoids

MVA 途徑是由乙酰輔酶A(Ac-CoA)經(jīng)過乙酰輔酶A 硫解酶(AACT)和β-羥基-β甲基戊二酰-CoA 合成酶(HMGS)催化、縮合生成羥甲基戊二酰CoA(HMG-CoA),再由3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶(HMGR)催化生成MVA,MVA 經(jīng)過多步反應(yīng)后在甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶(MDD)的作用下生成IPP[21](圖2)。 HMGR 是MVA 途徑的第一個關(guān)鍵限速酶,其活性直接影響下游產(chǎn)物的合成[17]。

圖2 植物萜類物質(zhì)合成的MVA 途徑Fig.2 MVA pathway for the synthesis of plant terpenoids

1.2 靈芝三萜生物合成途徑

靈芝三萜類化合物主要是一類高度氧化的羊毛甾烷衍生物,靈芝酸是靈芝三萜中的一類,主要是通過甲羥戊酸途徑進(jìn)行生物合成。 甲羥戊酸途徑經(jīng)過多步反應(yīng)生成三萜的前體物質(zhì):IPP 和DMAPP,在萜類合酶的作用下生成法呢基焦磷酸(FPP),后在鯊烯合酶(SQS)的作用下產(chǎn)生鯊烯(SQ),經(jīng)多步反應(yīng)合成羊毛甾醇(LS)。 合成途徑的下游部分是羊毛甾醇,羊毛甾醇在合成靈芝酸的同時還會產(chǎn)生麥角甾醇和酵母甾醇[22](圖3)。 目前羊毛甾醇合成靈芝酸的途徑仍然未知,有研究表明[23],細(xì)胞色素P450(CYP450)單加氧酶參與了合成途徑,并且發(fā)現(xiàn)CYP450 對應(yīng)的基因在修飾羊毛甾醇骨架、催化羊毛甾醇合成靈芝酸具有重要作用。 Zhang 等[24]經(jīng)過多次篩選不同培養(yǎng)條件下與類固醇結(jié)合的P450 基因,在靈芝中過表達(dá)后發(fā)現(xiàn)CYP512v2 表達(dá)與靈芝酸T 的積累顯著相關(guān)。 Yang 等[25]研究發(fā)現(xiàn),CYP450 基因中的CYP512U6 可以促進(jìn)靈芝酸DM 和靈芝酸TR 生成靈芝酸Jc,利用釀酒酵母的甾醇還原酶還能夠羥基化改性靈芝酸DM,而CYP505D13 配合生成環(huán)狀靈芝三萜[26]。 從羊毛甾醇到靈芝三萜中的CYP450 基因方面的研究較復(fù)雜,且羊毛甾醇合成的靈芝三萜化合物種類較多,而CYP450 基因的相關(guān)研究成果只是“冰山一角”,所以羊毛甾醇合成靈芝酸這一未知途徑仍需繼續(xù)深入研究[27]。

圖3 靈芝三萜合成途徑Fig.3 Synthesis pathway of Ganoderma triterpenes

2 液態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)靈芝三萜的培養(yǎng)條件調(diào)控

2.1 培養(yǎng)基因素調(diào)控

靈芝液態(tài)深層發(fā)酵的主要發(fā)酵過程與抗生素發(fā)酵過程較為類似,其培養(yǎng)基主要由碳源、氮源、無機(jī)鹽和微量元素、生長因子等組成。 通過對培養(yǎng)基的優(yōu)化,可以直接影響靈芝三萜的產(chǎn)生。 王謙等[28]研究發(fā)現(xiàn),玉米粉和葡萄糖較適合靈芝生長,發(fā)酵獲得的濕菌絲體產(chǎn)量達(dá)到35 g∕(100 mL);楊德等[29]研究表明,玉米粉可以提高靈芝菌絲體生物量至2.05 g∕(100 mL)。 金德寬[30]通過使用不同的碳源、氮源、無機(jī)鹽研究培養(yǎng)基組成對靈芝酸的影響,得到最佳發(fā)酵工藝條件為蔗糖40 g∕L、豆餅粉1.5 g∕L、KH2PO41.5 g∕L、MgSO41.5 g∕L,生物量和靈芝三萜產(chǎn)量分別為9.15 g∕L 和0.441 g∕L。 馮杰等[31]研究發(fā)現(xiàn),在‘滬農(nóng)靈芝1 號’培養(yǎng)過程中添加N-10 酵母自溶粉比對照的靈芝三萜產(chǎn)量提高了6.22%。 翟雙星等[32]在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中使用不同酵母粉進(jìn)行有機(jī)氮源復(fù)配試驗,發(fā)現(xiàn)將酵母粉N-1 與N-2 復(fù)配添加時,靈芝三萜產(chǎn)量可達(dá)0.478 g∕L,比單一添加酵母粉N-1 和N-2 分別提高了21%和139%。 當(dāng)酵母粉N-1、N-2、N-3 混合添加時,靈芝三萜產(chǎn)量可達(dá)0.514 g∕L,比3 種氮源的對照組分別提高了30%、157%和74%。 Wei 等[33]通過葡萄糖蔗糖混合分批補(bǔ)料方式對靈芝進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵,靈芝三萜產(chǎn)量比對照提高了40%。

2.2 培養(yǎng)環(huán)境因素調(diào)控

除了培養(yǎng)基因素調(diào)控,發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速、pH 等培養(yǎng)條件對靈芝三萜產(chǎn)量的影響也有相關(guān)研究。 溫度對靈芝消耗葡萄糖的速率有一定影響,促使胞內(nèi)發(fā)生各種生化反應(yīng),進(jìn)而影響菌絲體的生長以及代謝物質(zhì)的生成。 汪金萍等[34]研究發(fā)現(xiàn),28 ℃為靈芝菌絲體最適生長溫度。 Wang 等[35]在靈芝液態(tài)發(fā)酵過程中對發(fā)酵溫度和初始pH 進(jìn)行調(diào)控,發(fā)現(xiàn)溫度為28.6 ℃、初始pH 為5.9 時,胞內(nèi)三萜產(chǎn)量可達(dá)到308.1 mg∕L。 Feng 等[36]研究了不同發(fā)酵時間段的溫度對靈芝液態(tài)發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)在0—61 h 時,32 ℃的發(fā)酵溫度促進(jìn)菌絲體生長;在62—127 h 時,溫度從31 ℃降到30 ℃,保持菌絲體生長的同時促進(jìn)靈芝三萜的合成;在128 h 后,溫度維持在29 ℃,穩(wěn)定靈芝三萜的合成,使得產(chǎn)量達(dá)到0.269 g∕L。 發(fā)酵時間的長短會影響菌絲體的生長及靈芝三萜的生成。 Liu 等[37]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖為44.4 g∕L、蛋白胨為5.0 g∕L、發(fā)酵時間為437.1 h 時,可得到菌絲體干重11.3 g∕L,靈芝酸Me 產(chǎn)量4.8 mg∕L。

靈芝液態(tài)深層發(fā)酵的過程需要氧氣促進(jìn)菌絲體生長以及在發(fā)酵中后期促進(jìn)靈芝三萜的合成。 有研究表明,較高的氧濃度可以促進(jìn)菌絲體生長,而較低的氧濃度可以促使靈芝三萜的產(chǎn)生。 通氣量與培養(yǎng)環(huán)境下的溶氧直接相關(guān)。 Zhang 等[38]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)溶氧量達(dá)到80%時,靈芝三萜產(chǎn)量可達(dá)到1.43 g∕L。馮杰等[39]采用5 L 發(fā)酵罐研究通氣量對靈芝液態(tài)發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)通氣量為8 L∕min 時,靈芝三萜得率為0.204 g∕L,最大菌絲體得率達(dá)到8.77 g∕L。 攪拌轉(zhuǎn)速也會通過影響溶氧量和剪切力的變化而影響靈芝液態(tài)發(fā)酵。 馮杰等[40]發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵40 h 前,將轉(zhuǎn)速調(diào)整為150 r∕min,40 h 后調(diào)整至100 r∕min,可得到三萜含量0.720 mg∕(100 mg)。

pH 會影響靈芝細(xì)胞膜通透性,進(jìn)而影響營養(yǎng)物質(zhì)吸收、產(chǎn)物分泌以及三萜酸合成相關(guān)酶的活性[41]。Wang 等[42]在靈芝的液態(tài)發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn),pH 6.0 是產(chǎn)生靈芝酸的關(guān)鍵培養(yǎng)條件之一。 潘江安等[43]在靈芝的液態(tài)發(fā)酵中提出了四階段pH 控制策略,在0—26 h 時pH 自然,26—36 h 時pH 為4.0,36—81 h 時pH 為4.5,81—168 h 時pH 為5.0,得到菌絲體干重為14.18 g∕L,三萜產(chǎn)量為279.59 mg∕L。 Tang 等[44]運用多階段調(diào)節(jié)pH 結(jié)合溶氧量控制的方法對靈芝液態(tài)發(fā)酵進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)初始自然pH、在4 d 時pH 控制在3.0、在6 d 時pH 調(diào)為4.5,溶氧量在0—6 d 為25%、6 d 后為10%,靈芝三萜產(chǎn)量可達(dá)到754.6 mg∕L。

3 外源物對液態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)靈芝三萜的影響

近年來,靈芝液態(tài)發(fā)酵過程中添加外源物質(zhì)促進(jìn)目的產(chǎn)物的增加已成為一種新的調(diào)控手段。 外源添加物可以提高菌絲體生物量和靈芝三萜產(chǎn)量,降低培養(yǎng)基原材料的成本、控制環(huán)境條件的耗能。 外源物通過調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶活性、誘導(dǎo)特定酶的基因表達(dá)、改變細(xì)胞通透性來最大限度地積累目的產(chǎn)物[45]。

3.1 細(xì)胞色素P450 誘導(dǎo)劑和抑制劑

在靈芝三萜生物合成的下游途徑中,細(xì)胞色素P450 是從羊毛甾醇到靈芝三萜生成途徑中一個關(guān)鍵的影響因素。 Wang 等[46]通過轉(zhuǎn)錄組動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn),cyp5150L8 是調(diào)節(jié)羊毛甾醇的關(guān)鍵基因。 Xu 等[47]通過透明顫菌血紅蛋白表達(dá)提高靈芝酸的研究發(fā)現(xiàn),cyp512a2、cyp512v2 和cyp512a13 轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),推測這些P450 基因與靈芝酸生成有關(guān)。

Liang 等[48]研究表明,靈芝液態(tài)發(fā)酵中在靜置培養(yǎng)的第5 天添加100 μmol∕L 的細(xì)胞色素P450 誘導(dǎo)劑苯巴比妥,總靈芝酸含量、靈芝酸Mk、S、T 和Me 含量都增加,HMGR、SQS 和LS 的轉(zhuǎn)錄水平均有提高,說明苯巴比妥對靈芝酸合成的誘導(dǎo)作用可能歸因于其對代謝流的促進(jìn)。 梁翠霞[49]研究發(fā)現(xiàn),在第7 天添加10 μmol∕L 的麥角固醇合成抑制劑咪康唑抑制了麥角固醇合成,促進(jìn)了羊毛甾醇積累,提高了靈芝酸產(chǎn)量,推測咪康唑?qū)`芝酸合成的促進(jìn)作用機(jī)制可能是通過基因以外的方式實現(xiàn)的。 Nojokiden 等[50]在靈芝液態(tài)發(fā)酵的第9 天添加100 μmol∕L 細(xì)胞色素P450 誘導(dǎo)劑利福平,靈芝酸產(chǎn)量達(dá)到18.6 mg∕g,并發(fā)現(xiàn)利福平雖然能夠提高靈芝酸產(chǎn)量,但同時也抑制了菌絲體的生成。

靈芝酸的生成也可能建立在細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上,You 等[51]使用阿司匹林誘發(fā)ROS 增加,促使細(xì)胞凋亡、靈芝酸生成,角鯊烯合酶和羊毛甾醇的表達(dá)合酶編碼基因也有所下調(diào)。

3.2 植物激素

植物激素是指植物生長過程中產(chǎn)生的微量但能響應(yīng)環(huán)境脅迫調(diào)節(jié)自身生理過程的有機(jī)化合物,在植物的生長過程中可以調(diào)節(jié)植物生長、影響次級代謝、激發(fā)免疫防御系統(tǒng)等[52-53]。 植物激素作為信號分子可通過激活特定代謝途徑來提高目的代謝產(chǎn)物。 近年來,關(guān)于植物激素誘導(dǎo)靈芝酸生成的研究以茉莉酸甲酯(MeJA)和水楊酸(SA)為主。

辛燕花等[54]在研究MeJA 對靈芝液態(tài)深層發(fā)酵的影響時發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵的第4 天添加100 μmol∕L MeJA,靈芝菌絲體中靈芝酸含量積累到最大50.02 mg∕g。 任昂[55]以吐溫-20 為助劑,研究MeJA 對靈芝液態(tài)深層發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)在第6 天加入254 μmol∕L MeJA,靈芝三萜含量可達(dá)到4.52 mg∕(100 mg)干菌絲體,比對照提高了45.3%。 考察MeJA 對關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響時發(fā)現(xiàn),不同濃度MeJA 在不同時間的誘導(dǎo)下,每個基因響應(yīng)MeJA 誘導(dǎo)的變化情況各不相同,但靈芝三萜生物合成途徑中的羥甲基戊二酰CoA 還原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶(FPPS)和羊毛甾醇合成酶(OSC)基因被MeJA 上調(diào)最為顯著。Cao 等[56]研究發(fā)現(xiàn),SA 能夠誘導(dǎo)靈芝三萜合成,HMGR、SQS 基因的轉(zhuǎn)錄水平也顯著提高。 Liu 等[57]研究發(fā)現(xiàn),SA 信號可以通過抑制線粒體復(fù)合物Ⅲ調(diào)節(jié)胞內(nèi)ROS 水平,參與調(diào)控靈芝的次級代謝合成。 Ye等[58]研究發(fā)現(xiàn),單獨添加150 μmol∕L SA 誘導(dǎo)靈芝液態(tài)發(fā)酵時可以提高37.19%的三萜含量,上調(diào)法呢基焦磷酸合酶(FPPS)、鯊烯合酶(SQS)和羊毛甾醇合酶(LS)基因的表達(dá),將鈣離子和SA 結(jié)合添加可以提高46.9%的三萜含量,上調(diào)6 種基因表達(dá),推測SQS 是該途徑的關(guān)鍵酶。 褪黑素是一種植物生長促進(jìn)劑,鮑銳等[59]研究表明,褪黑素可以提高靈芝生物量和促進(jìn)靈芝酸產(chǎn)生,并推測作用機(jī)理可能與SA 誘導(dǎo)靈芝酸生物合成相關(guān)酶的基因表達(dá)、促進(jìn)靈芝酸的生物合成相似。 Zhang 等[60]研究表明,靈芝液態(tài)發(fā)酵中添加乙烯可以提高靈芝酸產(chǎn)量,達(dá)到33 mg∕g 干菌絲體,比對照提高了90%,同時羊毛甾醇和鯊烯含量增加。

3.3 油脂物質(zhì)

油脂物質(zhì)通過改變真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和通透性或直接影響代謝途徑中某些重要的酶活性以促進(jìn)真菌的次生代謝產(chǎn)物合成。 朱會霞[61]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)添加油酸、α-萘乙酸、L-谷氨酸時,油酸是影響靈芝酸生成的最顯著因素。 姚強(qiáng)等[62]使用不同的脂肪酸作為外源添加物進(jìn)行靈芝液態(tài)發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)硬脂酸、亞油酸和棕櫚酸對生物量有促進(jìn)生長,僅亞油酸對胞內(nèi)三萜表現(xiàn)出較強(qiáng)的促進(jìn)作用,其他兩者均呈現(xiàn)抑制作用,說明不同脂肪酸對靈芝三萜的產(chǎn)生表現(xiàn)出不同的效果,可能與其鏈的長短以及飽和度的差異有關(guān)。

Feng 等[63]考察了6 種外源添加劑油酸、大豆油、正己烷、正十二烷、乙酸乙酯和吐溫-80 對靈芝液態(tài)發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)油酸為主要外源添加劑時,得到最大菌絲干重為12.15 g∕L、三萜產(chǎn)量為0.776 g∕L,說明培養(yǎng)基中加入油酸是最有效的。 孫冰沁等[64]考察油酸對靈芝三萜生物合成途徑中關(guān)鍵酶編碼基因的影響時發(fā)現(xiàn),油酸可以上調(diào)SQS 和CYP51 基因表達(dá),抑制14α-LDM 酶基因表達(dá),但達(dá)到最高靈芝三萜產(chǎn)量時,SQS、CYP51 基因表達(dá)上調(diào)并不是最高,14α-LDM 基因表達(dá)也沒有下調(diào)到最低,推測油酸誘導(dǎo)產(chǎn)生靈芝三萜的機(jī)理可能是改變細(xì)胞膜的通透性或靈芝的基礎(chǔ)代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。

薏苡仁油是主要成分含9.26%油酸、17.83%棕櫚酸、31.94%亞油酸的油脂類物質(zhì)[65]。 黎李平[65]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)初始pH 為6.9,發(fā)酵第2 天添加3%的薏苡仁油時,菌絲體內(nèi)的靈芝三萜得率為44.01 mg∕g。Yang 等[66]研究發(fā)現(xiàn),與玉米油、紅花油、橄欖油相比,薏苡仁油可以更好地促進(jìn)菌絲體和靈芝三萜的生長,在第0 天添加薏苡仁油后,菌絲體生物量是對照的3.34 倍,靈芝三萜產(chǎn)量是對照的2.76 倍。 畢澎洋[67]在靈芝液態(tài)發(fā)酵的第48 小時添加2%薏苡仁油,菌絲體生物量可達(dá)到11.44 g∕L,是對照的3.58 倍;在發(fā)酵過程的第24 小時添加,靈芝酸產(chǎn)量可達(dá)到130.4 mg∕L,是對照的4.04 倍。 Liu 等[68]研究表明,薏苡仁油誘發(fā)NO、H2O2的增加,NO 和H2O2參與了薏苡仁油誘導(dǎo)靈芝三萜合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,從而促進(jìn)靈芝三萜含量的提高。 張容容[69]研究發(fā)現(xiàn),在第0 天添加1.5 g∕L 薏苡仁油不僅可以顯著提高靈芝液態(tài)發(fā)酵的生物量和三萜產(chǎn)量,而且菌絲體細(xì)胞在指數(shù)生長末期到穩(wěn)定期間對誘導(dǎo)作用表現(xiàn)最為敏感,說明薏苡仁油可在較長時間內(nèi)誘導(dǎo)靈芝菌絲體產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NO 和H2O2作為信號分子在薏苡仁油的誘導(dǎo)過程中具有協(xié)同作用。 Zhou 等[70]研究發(fā)現(xiàn),添加0.2%薏苡仁酯可以促進(jìn)靈芝液態(tài)發(fā)酵的菌絲體生長,推測薏苡仁酯可作為促進(jìn)因子影響靈芝液態(tài)發(fā)酵。

4 代謝通量方法在微生物發(fā)酵領(lǐng)域的研究進(jìn)展

通過靈芝三萜合成途徑可以看出,從羊毛甾醇到靈芝三萜生成的中間反應(yīng)是未知的,無法通過信號通路和基因表達(dá)解釋,但也無法規(guī)避該反應(yīng),所以尋找一種新方法研究靈芝三萜合成途徑的機(jī)理是有必要的。 代謝通量方法是代謝途徑中一種常用的研究菌種調(diào)控生成代謝產(chǎn)物機(jī)理的方法,可以圍繞次生代謝產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵中間前體進(jìn)行定量分析,發(fā)現(xiàn)是否有同一前體的非目標(biāo)產(chǎn)物的通量生成,從而進(jìn)一步深入研究。 代謝通量方法可以直接應(yīng)用于菌種的初級代謝產(chǎn)物,也可以控制初級代謝產(chǎn)物的通量[71]。

4.1 代謝通量方法在細(xì)菌代謝合成目的產(chǎn)物方面的應(yīng)用

朱文澤等[72]建立了谷氨酸棒桿菌合成L-組氨酸的代謝網(wǎng)絡(luò)模型,發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵初期添加檸檬酸鈉能夠改變L-組氨酸生物合成途徑的關(guān)鍵節(jié)點6-磷酸葡萄糖、丙酮酸及乙酰輔酶A 的代謝流分布,維持糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑與三羧酸循環(huán)之間的代謝流量平衡,有利于提高L-組氨酸生物合成途徑的代謝流量,最終使L-組氨酸的代謝流增加了7.86%。 張克旭等[73]應(yīng)用黃色短桿菌發(fā)酵合成L-纈氨酸,通過物料衡算和MATLAB 線性規(guī)劃方法,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵中后期L-纈氨酸合成過程中的代謝流量分步主要通過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑,再進(jìn)入三羧酸循環(huán)途徑,找到關(guān)鍵節(jié)點6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇丙酮酸以及丙酮酸節(jié)點,得出降低三羧酸循環(huán)的代謝流量,增大糖酵解途徑的流量可以使L-纈氨酸產(chǎn)量增加。

黃金等[74]建立了不同溶氧條件下大腸桿菌合成L-蘇氨酸的代謝網(wǎng)絡(luò)模型,對關(guān)鍵節(jié)點6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇丙酮酸以及α-酮戊二酸進(jìn)行代謝通量分析發(fā)現(xiàn),增加磷酸戊糖途徑代謝流量,減少糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)代謝流量,可以大幅降低碳物質(zhì)的流失;確定溶氧是發(fā)酵中后期的關(guān)鍵因素,增加溶氧有利于L-蘇氨酸的生成,抑制副產(chǎn)物生成。 Niu 等[75]建立了大腸桿菌發(fā)酵促使甘油生成L-蛋氨酸的代謝網(wǎng)絡(luò)模型,發(fā)現(xiàn)L-蛋氨酸主要來源于磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的途徑,增強(qiáng)磷酸戊糖途徑可提供大量NADPH,增加溶氧水平促使目的產(chǎn)物合成。 Yao 等[76]建立了大腸桿菌產(chǎn)乙醇的代謝模型,對菌株HJ06PN 的產(chǎn)醇通量分布分析發(fā)現(xiàn),磷酸二羥丙酮節(jié)點的碳分配將更多的碳從較低的糖酵解途徑逐漸引導(dǎo)到乙醇的生物合成途徑,三羧酸循環(huán)減少了乙酸的生成,NADH 轉(zhuǎn)化為NADPH 的轉(zhuǎn)氫化通量不斷增大。 Hong 等[77]建立了兩種大腸桿菌菌株高產(chǎn)白藜蘆醇模型,第一株菌株以酪氨酸為前體,通過磷酸戊糖途徑合成對香豆酸,第二株菌株結(jié)合第一株菌株產(chǎn)生的對香豆酸和糖酵解途徑合成的乙酰輔酶A 合成丙二酰輔酶A 生成白藜蘆醇,以20 g∕L 葡萄糖為底物可獲得55.7 mg∕L 的白藜蘆醇。 通過代謝通量分析表明,檸檬酸循環(huán)和丙二酰輔酶A 供應(yīng)節(jié)點之間的平衡是白藜蘆醇產(chǎn)生的關(guān)鍵點。

王澤建等[78]建立了糞產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵合成凝膠多糖的代謝網(wǎng)絡(luò)模型,通過分析葡萄糖和麥芽糖作為底物對凝膠多糖代謝通量的影響,發(fā)現(xiàn)麥芽糖比葡萄糖的凝膠多糖得率高出45.8%,原因是以麥芽糖為碳源時磷酸戊糖途徑的絕對代謝通量提升了40%以上。 磷酸二羥丙酮途徑通量的增加提升了NADPH 還原力供給速率,加快了碳源作為底物向產(chǎn)物的摩爾轉(zhuǎn)化速率。

林美君[79]使用代謝通量方法構(gòu)建了4 種乳酸菌中央碳代謝網(wǎng)絡(luò)模型,找出關(guān)鍵節(jié)點為6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、草酰乙酸和α-酮戊二酸,并對乳酸產(chǎn)量和乳酸菌OD 值的相關(guān)性進(jìn)行了研究。

4.2 代謝通量方法在真菌代謝合成目的產(chǎn)物方面的應(yīng)用

Zhang 等[80]通過代謝通量方法探討了不同氮源對糖多孢紅霉菌8 號產(chǎn)紅霉素的影響,發(fā)現(xiàn)在氮源優(yōu)化條件下,磷酸戊糖途徑為紅霉素合成提供了更多的NADPH。 較高的正丙醇比消耗率促進(jìn)紅霉素合成,正丙醇通過甲基丙二酰輔酶A 節(jié)點流入中樞碳代謝。

Li 等[81]建立了熱帶念珠菌CICC1779 利用葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇的代謝模型,發(fā)現(xiàn)溶氧量是高產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵節(jié)點,誘變菌株產(chǎn)生的乙醇為24.85 g∕L,是野生菌株的1.41 倍,溶氧量增加后可以達(dá)到26.56 g∕L,且突變株的木糖還原酶和木糖脫氫酶活性均高于原株,表明誘變株可以有效利用木糖促進(jìn)目的產(chǎn)物代謝。

Tomàs-Gamisans 等[82]研究發(fā)現(xiàn),以甘油為碳源可以促進(jìn)畢赤酵母產(chǎn)氨基酸。 Hayakawa 等[83]建立了添加乙醇促進(jìn)釀酒酵母產(chǎn)腺苷蛋氨酸的代謝模型,發(fā)現(xiàn)乙醇培養(yǎng)中三羧酸循環(huán)和乙醛酸分流的代謝通量水平顯著高于葡萄糖培養(yǎng),更多的ATP 是由乙醇通過氧化磷酸化產(chǎn)生的。 沈?qū)幯嗟萚84-85]對法夫酵母發(fā)酵生成蝦青素的前中后期進(jìn)行代謝通量分析,并對關(guān)鍵節(jié)點乙酰輔酶A、α-酮戊二酸以及5-磷酸核酮糖進(jìn)行研究,得出在發(fā)酵前期,法夫酵母JMU-VDL668 的糖酵解途徑通量增大,為合成新細(xì)胞提供前體物和能量;在發(fā)酵中后期,三羧酸循環(huán)及磷酸戊糖途徑的通量都增大,為細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的合成提供NADPH和ATP。

4.3 代謝通量方法在其他方面的應(yīng)用

王景川等[86]建立了螺旋藻合成β-胡蘿卜素的代謝網(wǎng)絡(luò)模型,研究了不同溫度對β-胡蘿卜素代謝通量的影響。 Cheah 等[87]研究了長球藻PCC 7942 產(chǎn)醛的代謝通量,發(fā)現(xiàn)丙酮酸是其產(chǎn)醛的關(guān)鍵節(jié)點,在該節(jié)點上丙酮酸激酶(PK)和乙酰烯烴合成酶(ALS)與醛產(chǎn)量直接相關(guān),而丙酮酸脫氫酶(PDH)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)的通量隨著醛產(chǎn)量的增加而變化。

5 討論

靈芝是我國著名的藥用真菌,其含有多種活性成分,目前的研究以靈芝多糖和靈芝三萜較多。 靈芝三萜是羊毛甾烷型萜類物質(zhì),其具有廣泛的藥理活性,主要來源是子實體和孢子粉以及液態(tài)發(fā)酵的菌絲體和胞外液,液態(tài)發(fā)酵以發(fā)酵周期短、條件易控制、目的產(chǎn)物較穩(wěn)定等優(yōu)點成為獲得靈芝三萜的主要手段之一。

通過培養(yǎng)基組成、pH、攪拌速度、溫度、溶氧量等方面的工藝條件優(yōu)化可以使靈芝的生物量以及菌絲體三萜含量增加,但單從以上方面進(jìn)行工藝優(yōu)化可能需要較高成本,且并不能較大幅度提高單體靈芝酸產(chǎn)量。 通過添加外源物可以從調(diào)控靈芝次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶活性、關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平以及細(xì)胞通透性等方面促進(jìn)靈芝生物量和菌絲體靈芝三萜含量增長,可以避免工業(yè)上的成本浪費,降低環(huán)境污染等。

目前,外源添加物主要通過活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)等信號通路方向進(jìn)行研究。 通過靈芝三萜合成途徑來看,從羊毛甾醇到靈芝三萜生成的中間反應(yīng)是未知的,無法通過信號通路方面的研究進(jìn)行解釋,尋找一種新的方法對靈芝三萜合成途徑進(jìn)行研究進(jìn)而揭秘其合成機(jī)理是有必要的。 另外,目前圍繞靈芝三萜生物合成途徑的研究大多集中在基因方面,可對關(guān)鍵酶的基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測。 由于靈芝三萜合成下游過程中碳環(huán)骨架的復(fù)雜修飾,從羊毛甾醇到靈芝三萜生成的中間途徑較為復(fù)雜,目前主要聚焦在P450 家族基因的研究。 代謝通量方法可以圍繞次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵中間前體進(jìn)行定量分析,作為代謝途徑中的一種研究菌種調(diào)控生成代謝產(chǎn)物機(jī)理的常用方法還未曾在藥用真菌的研究中出現(xiàn)過。 筆者通過國家自然科學(xué)基金青年基金項目的實施已建立了靈芝三萜代謝網(wǎng)絡(luò)模型,項目通過靈芝三萜代謝通量分析,強(qiáng)化靈芝三萜類物質(zhì)合成的代謝流向,為提高靈芝三萜的產(chǎn)量奠定了一定基礎(chǔ)。