牦牛VEGFA雙熒光素酶載體構(gòu)建及與miR-200b的靶向驗證

謝建鵬 陳平 王斐 何振富

摘要：為探究微小RNA（miR-200b）與血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）基因之間的靶向關(guān)系，采用miRanda和Targetscan軟件預(yù)測牦牛miR-200b與VEGFA可能存在結(jié)合位點，構(gòu)建了VEGFA基因3′UTR區(qū)的野生型和突變型雙熒光素酶載體。利用與目的miRNA靶種子序列相結(jié)合基因的突變序列，構(gòu)建該靶基因的突變型重組質(zhì)粒（pGL3-promoter-mut VEGFA），再進行重組質(zhì)粒和目的miRNA的miRNA mimic的共轉(zhuǎn)染實驗。結(jié)果表明，預(yù)測到的miR-200b與VEGFA基因的3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點。PCR進行擴增和測序之后，VEGFA基因3′UTR區(qū)的野生型、突變型載體構(gòu)建成功。共轉(zhuǎn)染VEGFA野生型載體和miR-200b mimic的雙熒光素酶活性極顯著低于對照組（P < 0.05），VEGFA突變型載體和miR-200b mimic共轉(zhuǎn)染的雙熒光素酶活性與對照組無顯著差異（P ＞ 0.05）。說明VEGFA基因的3′UTR區(qū)能與miR-200b結(jié)合并抑制雙熒光素酶活性，驗證了VEGFA是miR-200b的靶基因。

關(guān)鍵詞：牦牛；載體構(gòu)建；雙熒光素酶；VEGFA基因；miR-200b

中圖分類號：S823.8? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2023）08-0745-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.08.012

Construction of Yak VEGFA Double Luciferase Vectors and

Their Targeting against miR-200b

XIE Jianpeng， CHEN Ping， WANG Fei， HE Zhenfu

（Institute of Animal Husbandry， Pasture and Green Agriculture， Gansu Academy of Agricultural Sciences，

Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： In order to investigate the targeting relationship between miR-200b related to yak reproduction and vascular endothelial growth factor A（VEGFA） gene， miRanda and Targetscan were used to predict the possible binding site between miR-200b and VEGFA in yak. The wild-type and mutant dual-luciferase vectors of VEGFA 3′UTR region was constructed. The mutant plasmid pGL3-Promoter-mut VEGFA of the target gene was constructed by using the mutant sequence of the target gene and the target seed sequence of the target miRNA. Then the co-transfection experiment of the target miRNA mimic and the recombinant plasmid was carried out. The results showed that the predicted binding site between miR-200b and the 3′UTR region of VEGFA gene existed. After PCR amplification and sequencing， the results showed that the wild-type and mutant vectors of VEGFA 3′UTR region were successfully constructed. The double luciferase activity of co-transfected VEGFA wild-type vector and miR-200b mimic was significantly lower than that of the control group （P < 0.01）， while the double luciferase activity of co-transfected VEGFA mutant vector and miR-200b mimic was not significantly different from that of the control group（P > 0.05）. These results indicated that the? 3′UTR region of VEGFA gene could bind to miR-200b and inhibit dual luciferase activity， which verified that VEGFA was a target gene of miR-200b.

Key words： Yak; Vector construction; Dual-luciferase; VEGFA gene; miR-200b

收稿日期：2022 - 10 - 09；? 修訂日期：2023 - 06 - 20

基金項目：甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研條件建設(shè)及成果轉(zhuǎn)化項目（2021GAAS51）。

作者簡介：謝建鵬（1990 — ），男， 甘肅會寧人，助理研究員，博士，研究方向為動物營養(yǎng)及繁殖。Email：18709480641@163.com。

作者簡介：何振富（1985 — ），男，甘肅會寧人，副研究員，碩士，研究方向為動物營養(yǎng)及繁殖。Email：gshezhenfu.163.com。

RNA干擾（RNAi）其中包括miRNA mimics（即運用化學(xué)合成的方法，模擬生物體內(nèi)源的miRNA，特異性增強內(nèi)源型miRNA的功能）技術(shù)，是小片段RNA與目的基因mRNA的特定區(qū)域發(fā)生特異性結(jié)合，進而使得靶mRNA的降解加劇，從而出現(xiàn)失活現(xiàn)象，這一技術(shù)已廣泛運用于分子生物學(xué)研究領(lǐng)域［1 ］。而現(xiàn)有方法包括qRT-PCR、GFP蛋白融合及Western Bolt等，在檢測RNA干擾對相應(yīng)靶基因調(diào)控的驗證技術(shù)中，這些方法操作繁雜，并且對高通量選擇的需要無法滿足［2 - 3 ］。miRNA mimics 技術(shù)已有許多報道，如劉鴻艷等［4 ］通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)探究了豬E2F3基因3′UTR區(qū)與miR-10a-5p的靶向關(guān)系，表明豬E2F3基因與miR-10a-5p之間存在靶向關(guān)系；張鳳等［5 ］鑒定了miR-25與肉牛DKK3 3′UTR區(qū)存在靶向關(guān)系。牦牛（Bos grunniens）主要分布在青藏高原及其毗鄰高海拔地區(qū)，是當(dāng)?shù)啬撩裰匾纳a(chǎn)和生活資料，但由于飼草料資源匱乏，嚴重制約著牦牛生產(chǎn)水平的提高。牦牛的生產(chǎn)水平與其繁殖力關(guān)系緊密，結(jié)合遺傳學(xué)方法從遺傳本質(zhì)上提高牦牛的繁殖效率，可明顯提高牦牛的生產(chǎn)水平。謝建鵬［6 ］的研究表明，在冷季補充混合飼料，通過提高牦牛的營養(yǎng)水平進而提高了其繁殖效率。通過高通量測序技術(shù)對牦牛的卵巢組織進行Small RNA測序，獲取差異表達miRNA，預(yù)測差異表達miRNA靶基因，并進行GO功能和KEGG信號通路富集分析，篩選牦牛通過營養(yǎng)水平與繁殖力相關(guān)的miRNA。實時熒光定量（qRT-PCR）驗證發(fā)現(xiàn)，miR-200b表達顯著下調(diào)，VEGFA表達上調(diào)，這與miRNA調(diào)控靶基因的特點一致，提示miRNA可能通過靶向調(diào)控基因參與牦牛的繁殖過程。我們通過miRanda和Targetscan預(yù)測VEGFA和miR-200b的結(jié)合位點，隨后構(gòu)建雙熒光素酶載體并進行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒则炞CmiR-200b對VEGFA的靶向調(diào)控作用。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

TransStart FastPfu Fly DNA聚合酶，購自天根生化科技有限公司；Trans2K Plus II DNA標記，購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶（Kpn I；Bgl II；XhoI），購自北京全式金生物有限公司；EasyPure快速凝膠提取試劑盒，購自凱基生物有限公司；T4 DNA連接酶，購自博士德生物有限公司；Trans1-T1噬菌體抗性化學(xué)感受態(tài)細胞，購自北京全式金生物有限公司；TransCultTM LB瓊脂平板，購自天根生化科技有限公司；EasyPure Hipure Plasmid MaxiPrep試劑盒，購自北京全式金生物有限公司；TransSerum EQ胎牛血清，購自文淵閣生物科技有限公司；TransDetect雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，購自北京全式金生物有限公司。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ? miRNA的靶基因預(yù)測? ? 利用Targetscan和miRanda靶基因軟件對miR-200b的靶基因進行預(yù)測。目標靶基因的選取通過取交集確定，再結(jié)合KEGG通路篩選，進而獲得較為可信的靶位點。

1.2.2? ? 靶序列野生型pGL3-Promoter載體構(gòu)建? ? 候選靶基因cDNA的序列通過NCBI網(wǎng)站查找，依據(jù)miRNA與其對應(yīng)靶基因的結(jié)合位點位置進行常規(guī)合成，以含有結(jié)合位點的VEGFA基因3′UTR區(qū)構(gòu)建野生型載體。將以上基因合成產(chǎn)物和pGL3-Promoter載體進行酶切和鏈接，圖譜信息和原理見圖1。

1.2.3? ? 突變型pGL3-Promoter載體構(gòu)建? ? 在靶序列兩端設(shè)計點突變引物，引物序列見表1。利用Fast Mutagenesis System 點突變試劑盒將預(yù)測的靶基因進行缺失。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1.0 μL，cDNA 模板 2 μL，ddH2O 補至 20μL。PCR 擴增反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，共 31 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。取 5 μL PCR 產(chǎn)物進行 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

按T4 DNA Ligase說明書將線性化質(zhì)粒用T4 DNA連接酶連接，每個平板挑取3個單克隆測序。將凍存的293T細胞復(fù)蘇，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。

1.2.4? ? 雙熒光素酶報告基因檢測? ? 按體積比1∶4將5×Cell Lysis Buffer 同ddH2O混合后備用。將細胞培養(yǎng)基去除，用PBS小心潤洗，潤洗2次之后加入100 μL 1×Cell Lysis Buffer，室溫下充分裂解，時間為10 min。將細胞掛取到1.5 mL離心管中離心，取上清備用。將100 μL平衡至室溫的Luciferase Reaction Reagent加入試管中，吸取20 μL細胞裂解物加至試管，混勻，于化學(xué)發(fā)光儀中檢測，觀察螢火蟲熒光素酶報告基因的活性。之后吸取100 μL平衡至室溫的Luciferase Reaction Reagent II，加入上述反應(yīng)管中，在化學(xué)發(fā)光儀中檢測，觀察海腎熒光素酶報告基因的活性。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ? bta-miR-200b的靶基因預(yù)測

選擇在前期試驗已知差異表達的miR-200b為研究對象，通過軟件共同預(yù)測及分析查找，獲得較為可信的靶位點。VEGFA基因為miR-200b的候選靶基因，其結(jié)合位點如圖2所示。

2.2? ?野生型pGL3-Promoter載體構(gòu)建

常規(guī)合成含有結(jié)合位點的VEGFA基因3′UTR區(qū)，進行野生型載體構(gòu)建。靶基因VEGFA3′UTR區(qū)在合成序列兩端分別引入5'（Kpn I）和3'（BglII）酶切位點，將基因通過5′KpnI 、3′BglII克隆至載體pGL3-promoter（Ampicillin），制備maxi-scale （Endo-free）重組質(zhì)粒DNA和含有該重組質(zhì)粒的穿刺菌。合成VEGFA基因載體構(gòu)建的序列具體見圖3。合成VEGFA基因3′UTR區(qū)序列總長度為1 011個堿基，GC含量為48.17%（圖4）。

2.3? ?突變型pGL3-Promoter載體構(gòu)建與鑒定

2.3.1? ? 靶基因缺失PCR結(jié)果利用Fast Mutagenesis System 點突變試劑盒將預(yù)測的靶基因進行缺失，取10μL PCR產(chǎn)物進行1%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測點突擴增。結(jié)果顯示，缺失突變產(chǎn)物成功擴增，且條帶較亮，經(jīng)DMT酶消化后可用于后續(xù)實驗。靶基因缺失PCR結(jié)果見圖5。

2.3.2? ? 單克隆測序結(jié)果? ? 每個平板挑取3個單克隆進行測序，測序結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明，挑取的6個單克隆均成功缺失對應(yīng)的靶基因。

2.4? ?不同靶序列與miRNA作用驗證結(jié)果

利用miR-200b mimics與野生型重組載體（pGL3-promoter-wtVEGFA），對293T細胞進行共轉(zhuǎn)染，對海腎熒光素酶的活性變化進行統(tǒng)計。利用與目的miRNA靶種子序列結(jié)合的基因的突變序列，構(gòu)建該靶基因的突變型重組質(zhì)粒（pGL3- promoter-mutVEGFA），進行重組質(zhì)粒和目的miRNA的miRNA mimic的共轉(zhuǎn)染實驗，結(jié)果見圖7。miR-200b mimics分別與pGL3-promoter-wt/mut VEGFA-3′UTR共轉(zhuǎn)染時，pGL3-promoter-wt VEGFA- 3′UTR+miR-200b mimics組熒光素酶活性顯著低于pGL3-promoter-wtVEGFA-3′UTR+mimicsNC組（P < 0.01），pGL3-promoter-mutVEGFA-3′UTR+ miR-200b mimics組與對照組pGL3-promoter-mut VEGFA-3′UTR+mimicsNC熒光素酶活性無顯著差異（P > 0.05）；miR-200b mimics+pGL3-promoter組與mimicsNC+pGL3-promoter組熒光素酶活性差異不顯著（P > 0.05）。表明miR-200b具有靶向結(jié)合VEGFA 3′UTR并調(diào)控其表達的功能。

3? ?討論與結(jié)論

本試驗前期在非繁殖季節(jié)探究了補飼對牦牛卵巢miRNA表達譜的影響，發(fā)現(xiàn)了51個差異表達的miRNA，基于qRT-PCR，對差異表達的miR- 200b進行了預(yù)測并鑒定了其靶基因VEGFA［7 ］。本試驗通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證了miR-200b和靶基因VEGFA的靶向關(guān)系，從繁殖層面探索了miRNA和靶基因相互作用的關(guān)系。有研究表明，miR-200b可以負向靶向VEGFA。Liu等［8 ］報道，在3′-UTRs中選擇了種子序列保守的mRNAs用于腫瘤和正常腎臟間差異表達的miR，并鑒定了表達與miR呈負相關(guān)的靶mRNA，發(fā)現(xiàn)miR-200家族和VEGF之間存在明顯的負相關(guān)。藏小晴等［9 ］研究了正常肝細胞和肝癌細胞miR-200b-3p與VEGFA mRNA的表達，雙熒光素酶報告檢測靶向關(guān)系，結(jié)果表明miR-200b-3p直接靶向負調(diào)控VEGFA。以上研究揭示，miR-200b靶向調(diào)控VEGFA與腫瘤相關(guān)，通過查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，VEGFA對家畜繁殖也存在關(guān)聯(lián)。

相關(guān)研究表明，VEGF家族由VEGFA、PLGF、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE等6個成員組成，其中VEGFA對血管內(nèi)皮細胞增殖和分化的影響最大。VEGFs在早期卵泡發(fā)育過程中，表達量相對較低，隨著卵泡不斷地成熟，它在顆粒層和膜層的含量將會顯著增加［10 ］。在卵泡選擇中，F(xiàn)SH和隨后LH誘導(dǎo)的顆粒細胞層內(nèi)的VEGF產(chǎn)生增強了卵泡膜層內(nèi)的血管生成，進而增強黃卵黃的摻入促進了排卵前卵泡的快速生長［11 ］。由于卵泡發(fā)育的特殊性，VEGF主要通過促血管生成作用從而促進卵泡中血管網(wǎng)的形成，而血管網(wǎng)的形成為供應(yīng)促性腺激素、生長因子、類固醇激素前體等營養(yǎng)物質(zhì)提供了保證，最終VEGF通過旁分泌與自分泌等形式周期性地促進卵巢中血管生長與形成，調(diào)節(jié)卵巢的血流，從而調(diào)節(jié)了卵泡的生長［12 ］。

本研究預(yù)測到的miR-200b與VEGFA基因的3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點，miR-200b mimics分別與pGL3-promoter-wt/mutVEGFA-3′UTR共轉(zhuǎn)染VEGFA野生型載體和miR-200b mimic的雙熒光素酶活性極顯著低于對照組（P ＜ 0.01），VEGFA突變型載體和miR-200b mimic共轉(zhuǎn)染的雙熒光素酶活性與對照組無顯著差異（P ＞ 0.05）。說明VEGFA基因的3′UTR區(qū)能與miR-200b結(jié)合并抑制雙熒光素酶活性，驗證了VEGFA是miR-200b的靶基因。

參考文獻：

［1］ ZAMORE P D.? RNA interference： listening to the sound of silence［J］.? Nature Structural Biology， 2001， 8： 746-750.

［2］ BHATTACHARYA T K， SHUKLA R， CHATTERJEE R N， et al.? Knock down of the myostatin gene by RNA interference increased body weight in chicken［J］.? Journal of Biotechnology， 2017， 241： 61-68.

［3］ INOUYE， MASAYORI. The first demonstration of RNA interference to inhibit mRNA function［J］.? Gene， 2016，

592（2）： 332-333.

［4］ 劉鴻艷，鄭仰清，徐? ?晶，等.? 豬E2F3基因3′UTR雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建及其與miR-10a-5p的靶向驗證［J］.? 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2020（15）：28-32；169.

［5］ 張? ?鳳，陳明新.? 肉牛DKK3基因3′UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒構(gòu)建及與miR-25的靶向驗證［J］.? 中國畜牧雜志，2022，58（6）：135-140.

［6］ 謝建鵬.? 冷季補飼后牦牛卵巢miRNA和血清差異蛋白的篩選與鑒定［D］.? 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

［7］ XIE J， KALWAR Q， YAN P， et al.? Effect of concentrate supplementation on the expression profile of miRNA in the ovaries of yak during non-breeding season［J］.? Animals， 2020， 10（9）： 1640.

［8］ LIU H A R， BRANNON A R，? REDDY， et al.? Bhanot. Identifying mRNA targets of microRNA dysregulated in cancer： with application to clear cell Renal Cell Carcinoma［J］.? BMC Syst Biol， 2010， 4： 51.

［9］ 藏小晴，張燊璐，薛? ?樂.? miR-200b-3p靶向VEGFA并調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路抑制肝癌MHCC-97H細胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［J］.? 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2020，17（6）：8.

［10］ GINTHER O J， GASTAL E L， GASTAL M O， et al. In vivo effects of pregnancy-associated plasma protein-A， activin-A and vascular endothelial growth factor on other follicular-fluid factors during follicle deviation in mares［J］.? Reproduction （Cambridge， England）， 2005， 129：489-496.

［11］ KNIGHT P G， GLISTER C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development［J］.? Reproduction （Cambridge， England）， 2006， 132：191-206.

［12］ BALASCH J， GUIMER？魣 M， MARTINEZ-PASARELL O， et al. Adrenomedullin and vascular endothelial growth factor production by follicular fluid macrophages and granulosa cells［J］.? Human reproduction （Oxford， England）， 2004， 19：808-814.