不同生長階段金柑果實中類黃酮等活性物質(zhì)含量差異分析

尹會平,王夜梅,李江南,趙希娟,2,張耀海,王成秋,焦必寧*

1(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院/西南大學(xué)柑桔研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心,重慶,400712)2(西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院,重慶,400715)

金柑(kumquat),系蕓香科金柑屬植物,原產(chǎn)于我國,現(xiàn)世界各地均有栽培。金柑是最小的柑桔類水果,呈球形或橢圓形,果皮光滑明亮可食[1],是具有高營養(yǎng)價值的藥食同源類水果,在廣西、西南地區(qū)及江浙地區(qū)種植較廣。大多數(shù)金柑果實成熟時果皮呈金黃色,皮甘肉微酸,偶有辛辣,風(fēng)味獨特,清香四溢。根據(jù)《中國果樹志·柑橘卷》記載和查閱文獻可知,金柑屬有山金柑(FortunellahindsiiSwingle)、羅浮(F.margaritaSwingle)、羅紋(F.japonicaSwingle)、金彈(F.crassifoliaSwingle)、長壽金柑 (F.obovataTanaka) 和長葉金柑(F.polyandraTanaka)等金柑6個品種[2]。金柑果樹幼年期短,一般為2～3年,每年可開花結(jié)果數(shù)次。金柑果內(nèi)富含多種維生素、氨基酸、糖分、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì),營養(yǎng)價值高,具有很好的食療功效且外型喜慶吉利,深受人們喜愛。

我國金柑品種資源豐富,種類齊全,但只有少數(shù)地方品種得到了大力推廣,實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,但在生產(chǎn)過程中也存在落花落果等資源浪費問題,并且還有很多其他優(yōu)良金柑品種未被開發(fā)利用。前人已對部分金柑品種成熟果實品質(zhì)特性等進行了研究,目前關(guān)于金柑果實生長發(fā)育過程中生物活性成分的變化報道較少,且檢測的活性物質(zhì)種類偏少。研究證明金柑果肉和果皮中均含有酚酸、類黃酮等多種生物活性成分,其中類黃酮和酚酸類物質(zhì)是潛在抗氧化劑的主要來源,可預(yù)防一些常見疾病,如癌癥、心血管疾病和其他與年齡有關(guān)的代謝綜合征和退行性疾病[3],具有較高的保健與藥用價值。

隨著人們對健康果品的青睞,市場對諸如金柑之類具有較高營養(yǎng)保健價值的果品需求日益增加?，F(xiàn)代社會生活條件不斷改善, 天然產(chǎn)物中對健康有益的生物活性成分也受到學(xué)者的廣泛關(guān)注,金柑作為兼有藥用價值和食用價值的水果,在開發(fā)功能性產(chǎn)品方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景[4-5]。為此,本文比較分析不同生長階段金柑果實生物活性物質(zhì)的含量,以期為我國金柑資源的深入開發(fā)利用及研究提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本試驗以4個生長時期8個品種的金柑全果為試驗材料,于2021年采自國家柑桔種質(zhì)資源圃。在2021年9～12月期間,分別于金柑樹體開花后35～125 d,每30 d取1次果,每次隨機取20～50個果實,共采摘4 次,分別于花后35、65、95、125 d采摘,對應(yīng)時期編號分別為S1、S2、S3、S4。采摘樣品時,從果樹四周均勻采樣、選擇無病蟲害且大小一致的金柑樣品。采后樣品用超純水洗凈,晾干后快速制備鮮樣,密封凍藏(-20 ℃)備用。8個金柑品種分別編號1～8,名稱如表1所示,“S時期編號-序號”即為每個樣品的編號,S1-1即表示花后35 d采摘的融安金彈,S4-8表示花后125 d采摘的四季橘,其他品種時期編號以此類推,樣品圖片如圖1所示。

1-融安金彈;2-長壽金柑;3-寧波羅紋;4-金柑雜種;5-溫州羅浮;6-瀏陽金彈;7-滑皮金柑;8-四季橘圖1 四個時期8種金柑果實的樣品圖Fig.1 Pictures o of eight kumquat fruits in four periods

表1 八種金柑果實信息Table 1 Information of eight kumquat fruits

1.1.2 試劑

甲醇和乙腈(色譜純),美國Sigma-Aldrich;甲酸(色譜純),上海吉至生化科技有限公司。

92種標(biāo)準(zhǔn)品信息如下:圣草酚、異鼠李素、木犀草素、梔子黃素B、異鼠李素、異東莨內(nèi)酯、異澤蘭黃素純度均為98.0%以上,成都克洛瑪生物科技有限公司;水合氧化前胡素、蛇床子素、珊瑚菜素、8-氧甲基胡前內(nèi)酯、異槲皮苷、橙皮內(nèi)酯、根皮苷、槲皮素、氧化前胡素、異紫花胡前內(nèi)酯、4′,5,7,8-四甲氧基黃酮、櫟精-3,7,3′,4′-四甲醚、異橙黃酮、芹菜素、水仙苷、金柑苷和沒食子酸純度均為98.0%以上,4′,5,6,7-四甲氧基黃酮和3′,4,7,8-四甲氧基黃酮純度均為95%,上海源葉生物技術(shù)有限公司,其他標(biāo)準(zhǔn)品參照GUO等[6]。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DE超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司;Milli-Q Advantage A10超純水機,美國Millipore;3K15高速冷凍離心機,美國Sigma-Aldrich;PB3002-S/FACT分析天平,瑞士Mettler Toledo;有機相針式濾器(13 mm,0.22 m),上海安譜實驗科技股份有限公司;Acquity UPLC HSS T3色譜柱,美國Waters;Nexera X2 UPLC,日本島津公司,QTap@6500+,美國AB SCIEX 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 金柑苷UPLC-QQQ-MS/MS檢測方法的建立

GUO等[6]基于UPLC-QQQ-MS/MS平臺建立了66種柑桔中生物活性成分測定的方法,實驗室其他人員在其基礎(chǔ)上增加了25種,本實驗室現(xiàn)有方法可實現(xiàn)同時檢測91種生物活性物質(zhì),是目前涉及柑桔中生物活性成分測定種類最多的方法,可成功用于柑桔及其他果蔬樣品的檢測。金柑雖為柑桔屬植物,但有不同于其他柑桔品種的特有類黃酮。研究表明在金柑類黃酮的組成當(dāng)中,金柑苷和根皮素-3′,5′-二-C-葡糖苷是金柑果實中特有的2種類黃酮[7-8]。金柑苷是平均含量僅次于根皮素-3′,5′-二-C-葡糖苷的第二大特有類黃酮。目前金柑苷主要通過超高效液相色譜法檢測,超高效液相色譜技術(shù)是目前比較常用的有效分離復(fù)雜基質(zhì)的方式,其發(fā)展成熟,應(yīng)用范圍廣。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了液相色譜和質(zhì)譜兩者的優(yōu)點,包括低、中、高極性化合物和易揮發(fā)、難揮發(fā)性化合物,即使液相分離系統(tǒng)中未完全分離的樣品也可以通過特征離子對物質(zhì)進行分析,這使得檢測結(jié)果更加可靠,特異性更強,分析效率更高。因此,本研究建立了基于UPLC-QQQ-MS/MS平臺的金柑苷檢測和定量方法,用于分析不同生長發(fā)育期金柑果實中特有的金柑苷的含量?；衔锛癕RM參數(shù)如表2所示。

表2 化合物及其MRM參數(shù)的列表Table 2 List of the compound and their MRM parameters

1.3.2 方法驗證相關(guān)參數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:在金柑樣品上機檢測之前,將配制的0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1、2、5、10、20、25、50、100 μg/L一系列濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品使用液上機檢測,選擇5種以上的金柑苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度,進行線性擬合,通過選定的金柑苷定量離子峰面積進行線性擬合,繪制金柑苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。信噪比≥3和信噪比≥10時對應(yīng)的濃度分別確定為檢測限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification,LOQ)。加標(biāo)回收率試驗:為了確定目標(biāo)化合物的回收率,將質(zhì)量濃度50和100 μg/L的金柑苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液加到金柑樣品的提取液中。回收率為添加標(biāo)準(zhǔn)品前后的金柑苷的濃度差值與添加量的比值。進行3次重復(fù)試驗,加標(biāo)回收率以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。精密度:在同一天同一標(biāo)準(zhǔn)溶液不同的3個時間進行濃度的測定,以考察日內(nèi)精密度;連續(xù)3 d在同一時間段進行樣品濃度的測定,以考察日間精密度。日內(nèi)差和日間差均以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

本研究方法下,金柑苷均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。在方法的靈敏度方面可知,金柑苷化合物的LOD為0.28 μg/L,LOQ為2.35 μg/L,具有良好的靈敏度。從表3中可知,添加水平為50 μg/L時,回收率為(78.1±0.003)%,添加水平在100 μg/L 時,回收率為(0.765 5±0.045 5)%,表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)值為3.045%,日間RSD值為5.71%,均在可接受標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)。以上方法學(xué)驗證結(jié)果表明,該方法靈敏度高,準(zhǔn)確度和回收率高,可用于金柑樣品中金柑苷化合物的靶向篩查及定量檢測分析。

表3 方法驗證相關(guān)參數(shù)Table 3 List of parameters related to method validation

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制法

將購買的標(biāo)準(zhǔn)品分別用甲醇配制成500 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,放置于低溫下(-80 ℃)保存。將92種標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,按照一定比例稀釋,配制為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1、2、5、10、20、25、50、100 μg/L一系列質(zhì)量濃度的混標(biāo),其中章魚胺和酚酸的增加質(zhì)量濃度分別為200、250、500 μg/L。

1.3.4 樣品前處理

參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8210—2011《柑桔鮮果檢驗方法》樣品前處理方法。稱取5.00 g金柑樣品置于50.0 mL離心管,加入10.0 mL甲醇后振蕩搖勻,超聲提取30 min(25 ℃,200 W),10 000 r/min離心5 min,用50.0 mL容量瓶收集上清液。重復(fù)上述步驟4次,將4次收集的上清液用甲醇定容至50.0 mL。提取液通過有機相針式濾器(0.22 mm)過濾后即可檢測。

1.3.5 UPLC-QQQ-MS/MS條件

分析參照GUO等[6]的方法,Sciex QTrap?6500的質(zhì)譜數(shù)據(jù)是采用多反應(yīng)監(jiān)測模式在正、負(fù)兩種離子模式下獲得的。噴霧離子源參數(shù):霧化氣50.0 psi,輔助氣50.0 psi;氣簾氣35.0 psi;離子源溫度500.0 ℃。離子源電壓+5 500.0 V,-4 500.0 V;入口電壓10.0 V;碰撞室內(nèi)出口電15.0 V。采用型號 ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm,1.8 um,Waters,USA),柱溫40 ℃,流速0.3 mL/min,進樣量1.0 μL,樣品室內(nèi)溫度15 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)采集與分析

LC-MS/MS操作和數(shù)據(jù)采集在Analyst?軟件(Sciex)上進行,使用軟件 MultiQuant?(Sciex)進行樣品中化合物定量。每個樣品設(shè)計3個平行實驗,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示檢測結(jié)果;使用 Excel 2016和Origin 2022進行分析和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 金柑果實生物活性物質(zhì)的靶向篩查結(jié)果

4個時期8個金柑品種果實共靶向篩查到85種生物活性成分,具體物質(zhì)數(shù)量如表4所示。同一品種不同生長階段檢測出的生物活性物質(zhì)種類數(shù)差異較小,含量差異大,融安金彈和長壽金柑花后35～125 d,果實中均檢出66～71種物質(zhì);寧波羅紋花后35～125 d,果實中檢出67～73種物質(zhì);瀏陽金彈、滑皮金柑果實中均檢出62～68種物質(zhì);金柑雜種、溫州羅浮和四季橘果實中分別檢出72～80種、56～68種、59～76種物質(zhì)。融安金彈、滑皮金柑、瀏陽金彈、長壽金柑、金柑雜種和寧波羅紋的生物活性物質(zhì)種類均為60種以上,其中金柑雜種果實中物質(zhì)最豐富,S1時期高達80種。相比之下,溫州羅浮和四季橘中物質(zhì)較少,S2時期的物質(zhì)種類分別只有56和59種,主要是S2時期的香豆素種類明顯低于其他金柑品種,僅有4種和6種。由表4可知,金柑果實中生物活性物質(zhì)隨著成熟度的增加而減少,S3時期左右變化平緩,S1時期的物質(zhì)種類最高,其中有6個品種金柑的物質(zhì)種類超過70種。從總量及各類物質(zhì)的變化上看,類黃酮的含量變化在較大程度上決定了總生物活性物質(zhì)含量的變化趨勢。92種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合液總離子流圖如圖2所示,花后35 d即S1時期的8種金柑果實甲醇提取物的總離子流圖如圖3所示。圖3表明同一時期8個品種的金柑果實生物活性物質(zhì)的種類和數(shù)量有明顯的不同。通過S1時期金柑果實的總離子流圖的對比,可看到其峰型基本一致但有個別差異,響應(yīng)值及峰面積有明顯差異,表明不同品種的金柑的生物活性成分與含量均有顯著差異。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合液總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram of reference material mixture

表4 四個時期8種金柑果實中定量的次生代謝產(chǎn)物的數(shù)量Table 4 The number of secondary metabolites quantitated in 8 kinds of kumquat fruits in four periods

2.2 金柑果實中類黃酮含量變化及差異分析

柑桔中多種類黃酮物質(zhì)均有較強抗氧化活性,主要體現(xiàn)在減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基兩個方面。柚皮苷可增強超氧化物歧化酶和過氧化物歧化酶的活性,抑制低密度脂蛋白的氧化[9],從而達到抗氧化效果。WILMSEN等[10]報道,柑桔中橙皮苷等可以清除DPPH自由基,抑制低密度脂蛋白的氧化,亦有研究報道金柑果實中黃酮類物質(zhì)有較強抗氧化活性[11]。本研究一共測定金柑中48種類黃酮,包括16種多甲氧基黃、11種黃酮、7種黃酮醇、12種黃烷酮和2種二氫查爾酮,定量類黃酮具體種類參照表4。金柑雜種中類黃酮種類明顯高于其他金柑品種,4個時期均為46種以上,S1時期高達48種,其他品種金柑的S1時期種類也均高于40種。寧波羅紋、溫州羅浮、瀏陽金彈和四季橘的S4時期類黃酮種類較少,均只有38～39種。

大部分柑桔中類黃酮種類以黃烷酮為主[12],少數(shù)柑桔如寬皮柑桔中主要以多甲氧基黃酮為主[13]。本研究中金柑與蕓香科其他柑桔屬的類黃酮組成差異明顯,除金柑雜種外,其他7種金柑的類黃酮中黃酮占比最高;如電子增強出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032767)所示,不同時期同種金柑的類黃酮總量變化顯著,總含量隨著果實的生長發(fā)育呈減少趨勢,S1時期即花后35 d的金柑果實中類黃酮總量最多,其次主要是S2時期和S3時期;BARRECA等[14]對比了未成熟金桔汁與成熟金桔汁的總黃酮含量,前者是后者的3倍,與本研究一致;金柑果實中類黃酮的種類繁多,不同品種金柑的類黃酮組成不同,除金柑雜種外,7個金柑品種中含量較高的7種類黃酮物質(zhì)均為新西蘭牡荊苷、杜荊素-2-O-鼠李糖苷,野漆樹苷、金柑苷、柚皮苷、橙皮苷和枸橘苷,以上7個品種中金柑果實金柑苷的含量最為豐富,而金柑雜種中含量較高的10種類黃酮物質(zhì)分別為新西蘭牡荊苷、杜荊素-2-O-鼠李糖苷、地奧司明、新地奧司明、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素、橙皮苷、5,7,8,4′-四甲氧基黃酮和新橙皮苷,其中金柑雜種S1時期的新西蘭牡荊苷含量高達(609.633 3±6.809 0)μg/g、杜荊素-2-O-鼠李糖苷含量高達(521.033 3±11.104 8)μg/g、5,7,8,4′-四甲氧基黃酮含量高達(410.566 7±29.499 4)μg/g、橙皮苷含量高達(383.766 7±10.254 9)μg/g、新橙皮苷含量高達(411.700 0±61.800 2)μg/g。

本研究發(fā)現(xiàn)隨著果實成熟,枸橘苷的含量呈規(guī)律性降低,杜荊素-2-O-鼠李糖苷的含量呈顯著下降趨勢,此結(jié)論與郭鵬妹等[15]研究結(jié)論一致;KAWAII等[16]分析檢測了60多個不同生物類型的柑桔和金柑果實中的黃酮類化合物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)金柑中枸橘苷的含量明顯高于其他柑桔果實,但是金柑中橘皮素的含量遠(yuǎn)低于其他柑桔果實,這一結(jié)論與本研究一致;由于金柑雜種作為屬間雜種,其外形大小及成分種類含量與其他金柑有顯著差異,鄭潔[17]用超高效液相色譜法測定了15個金柑品種金柑果實干樣中金柑苷的含量,所測金柑果實中金柑苷平均含量為(1 510.28±23.5)mg/kg,在成熟金柑雜種中未檢出金柑苷,本研究所測的金柑品種中金柑苷的平均含量可達241.616 2 μg/g,與該研究結(jié)果一致,S1時期的滑皮金柑、溫州羅浮、瀏陽金彈果實中金柑苷的含量分別可達(952.366 7±37.193 7)、(692.033 3±62.032 4)、(604.433 3±17.979 7)μg/g,其余4個品種的金柑S1時期金柑苷含量也均高于240.00 μg/g,并且在金柑雜種其他3個時期有檢出金柑苷;本研究首次在金柑雜種和四季橘果實中檢出了櫟精-3,7,3′,4′- 四甲醚,但含量偏低(0.001～0.368 3 μg/g)并且在四季橘中只有S1時期能被準(zhǔn)確定量,其他時期因低于檢測限而未能檢出;不同品種的金柑類黃酮含量也具有差異,以S1時期為例,不同品種的金柑類黃酮總量比較,金柑雜種>滑皮金柑>長壽金柑>四季橘>溫州羅浮>瀏陽金彈>融安金彈>寧波羅紋。

通過以上數(shù)據(jù)分析可知,金柑雜種中類黃酮種類最豐富,總含量最高。除金柑雜種外,其他金柑果實中類黃酮物質(zhì)含量最高的為金柑苷,推測金柑苷在金柑類黃酮提取物的生理活性方面起著重要作用。隨著成熟度的增加,8種金柑中總黃酮的含量逐漸下降,多種黃酮類化合物均呈下降趨勢,說明果實成熟期間,黃酮類化合物發(fā)生積累或轉(zhuǎn)化。譚嫣[18]研究了6個不同發(fā)育時期瀏陽金柑果實樣品中5種類黃酮的含量變化,其變化規(guī)律與本研究一致。該研究還結(jié)合代謝組分析確定了25個參與金柑類黃酮糖基化修飾的候選基因,其結(jié)論可為本研究中部分類黃酮轉(zhuǎn)化積累的原因提供數(shù)據(jù)參考,但更多類黃酮物質(zhì)的轉(zhuǎn)化機制、代謝途徑還有待研究。

2.3 金柑果實中酚酸含量變化及差異分析

酚酸類化合物有較強的清除自由基的作用,是一類天然的抗氧化劑,近年來已被廣泛運用于食品,化妝品等行業(yè)。本研究中共測定了9種游離態(tài)酚酸,如電子增強出版附表2所示。所測酚酸在8種金柑中均有檢出,從酚酸組成來看,金柑品種和時期不同,酚酸組成和含量都具有差異。綠原酸具有抗菌、抗炎、抗病毒等多種生理活性,LIU等[19]研究發(fā)現(xiàn)綠原酸、迷迭香酸、異黃酮聯(lián)用可有效緩解脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷,并顯著降低肺組織中炎癥因子的表達水平,且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系,金柑雜種中的酚酸以綠原酸為主,S1時期含量可達(24.923 3±3.198 0)μg/g,占S1時期金柑果實所測酚酸總量的98.28%;除S1時期的長壽金柑外,其他金柑中綠原酸含量均在0.50 μg/g以下,且有4個品種的綠原酸含量低于定量限而無法定量;除金柑雜種外,其他金柑均以芥子酸為主,溫州羅浮和瀏陽金彈中芥子酸含量較高,溫州羅浮S1時期果實含量可達(6.725 3±0.126 7)μg/g,瀏陽金彈S4時期含量可達(5.673 0±0.106 5)μg/g,分別占總酚酸含量的93.61%～96.65%和65.55%～93.51%;本研究發(fā)現(xiàn)融安金彈、長壽金柑和四季橘中9種酚酸均有檢出,但含量極低無法定量,與WANG等[20]對四季橘測定結(jié)果一致;沒食子酸具有抗炎,抗氧化,抗癌等多種生物學(xué)活性,譚飔[21]發(fā)現(xiàn)金柑果實中含有相對豐富的沒食子酸,并用細(xì)胞實驗驗證了其抗癌活性,沒食子酸在本研究樣品中均有檢出,由于檢測方法的不同,其含量有所差異。從各個時期酚酸的總含量來看,酚酸總含量最高的為金柑雜種,其含量從大到小依次為溫州羅浮、瀏陽金彈、長壽金柑、滑皮金柑、四季橘、融安金彈、寧波羅紋。

2.4 金柑果實中類檸檬苦素含量變化及差異分析

類檸檬苦素是以檸檬苦素為基本單位的三萜類衍生物,作為柑桔中的主要苦味物質(zhì),其苦味主要來源于糖苷配基。檸檬苦素類化合物的抗菌、抗癌、抗氧化等生物活性已被研究證實。本研究一共測定了檸檬苦素、諾米林和黃柏酮,3種物質(zhì)在8種金柑的各個時期均有檢出。如電子增強出版附表3所示,隨著金柑果實的生長,類檸檬苦素的總含量整體上呈下降趨勢;除四季橘與長壽金柑外,檸檬苦素在各個金柑的類檸檬苦素總含量中占比最大,其含量占總類檸檬苦素的84.75%～99.82%,其中金柑雜種S1時期檸檬苦素含量最高為(132.033 3±5.529 5)μg/g,占該時期總量的88.87%,其含量是S1時期長壽金柑的20倍;四季橘與長壽金柑中諾米林含量較高,兩種金柑S1時期的含量均高于38.00 μg/g,除S1時期的金柑雜種外,而其他時期其他品種金柑中諾米林的含量均低于3.00 μg/g;除S1時期的金柑雜種黃柏酮含量高于1.00 μg/g,其余7種金柑中的黃柏酮含量較低且均在1.00 μg/g以下;HUANG等[22]測定了不同品種不同成熟階段柑桔的檸檬苦素含量,其結(jié)論表示類檸檬苦素含量呈下降趨勢,并在采摘早期達到峰值,與本研究結(jié)論一致;類檸檬苦素在不同的柑桔品種中含量不同,有研究表明,在枸櫞的果皮和果肉中,諾米林含量最高,其次檸檬苦素[23],而本研究中檸檬苦素含量最高,諾米林次之,黃柏酮含量極低,其組成規(guī)律與大部分桔、柚一致。

2.5 金柑果實中生物堿含量變化及差異分析

自然界中的生物堿主要來源于天然植物,作為一類含氮的堿性有機化合物,生物堿具有多種生理活性,天然藥物中的生物堿具有抗氧化、抗病毒、收縮血管、升高血壓、減肥和抗腫瘤等作用[24]。甜菜堿能修復(fù)通過磷脂酰乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶催化的細(xì)胞甲基化反應(yīng),使得卵磷脂含量正?；?有效防止細(xì)胞產(chǎn)生脂肪變性,具有抗脂肪肝的效果[25]。本研究一共測定了5種生物堿,在8種金柑的大部分品種和時期中均有檢出,如電子增強出版附表4所示,從5種生物堿的總含量來看,長壽金柑和四季橘中總含量較高,在130.00 μg/g以上,其他金柑的總含量均小于60.00 μg/g,這一含量特征與郭鵬妹等[15]研究結(jié)論一致;從組成來看,所有金柑中的生物堿均以N-甲基酪胺和酪胺為主,N-甲基酪胺在金柑雜種中含量最高,其他金柑均為酪胺,S1時期的長壽金柑中酪胺的含量高達(110.790 0±13.252 6)μg/g,占其生物堿總含量的69.60%～81.70%;8種金柑中的大麥芽堿、甜菜堿和章魚胺的含量均較低,低于1.00 μg/g;甜菜堿在溫州羅浮、寧波羅紋、瀏陽金彈和四季橘中均為檢出,在其他品種中也只在部分時期檢出,且含量很低;大麥芽堿在融安金彈、寧波羅紋、溫州羅浮、瀏陽金彈中均為檢出或檢出含量很低無法定量;只有金柑雜種中的章魚胺被準(zhǔn)確定量,但含量均低于1.00 μg/g,其他金柑中的章魚胺含量低于定量限,無法準(zhǔn)確定量。ZHANG等[26]在研究中發(fā)現(xiàn)寬皮柑桔中主要的生物堿是N-甲基酪胺,并且本研究數(shù)據(jù)顯示金柑雜種與其他7種金柑品種在生物堿組成上有顯著差異,分析其原因為金柑雜種是金柑與寬皮柑桔的雜交所得,因此其生物堿組成不同于其他金柑,而是與寬皮柑桔相似。

2.6 金柑果實中香豆素含量變化及差異分析

香豆素是一類以苯駢α-吡喃酮為基本母核且具有芳香氣味的天然產(chǎn)物,存在于蕓香科、傘形科和豆科等植物中[27]。香豆素類化合物具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌抗動脈粥樣硬化等多種生理活性[27]。本研究中一共測定9種普通香豆素和11種呋喃香豆素。從香豆素種類數(shù)量來看,如表4所示,融安金彈、寧波羅紋中4個時期定量的香豆素種類均≥13種,其他金柑的部分時期≥11種;從香豆素類物質(zhì)總含量來看,如附表5所示,最高的是金柑雜種,寧波羅紋次之,其他金柑的總含量均低于2.00 μg/g,瀏陽金彈與滑皮金柑中香豆素含量極低;從香豆素的具體成分含量來看,每種金柑不同時期各有不同,4個時期8種金柑中的6′,7′-二羥基香檸檬亭含量范圍為(0.015 7～10.852 3)μg/g,在融安金彈、長壽金柑與寧波羅紋中含量較高;金柑雜種中濱蒿內(nèi)酯含量最高,隨著果實的生長發(fā)育,其含量先增大后迅速降低,在S3時期達到最大值為(6.386 3±0.175 7)μg/g,其他金柑中的濱蒿內(nèi)酯含量均低于0.60 μg/g,甚至有部分金柑中含量太低而無法檢出;4個時期8種金柑中橙皮油素的含量為0.001 5～1.917 0 μg/g,相對其他品種來說,金柑雜種與四季橘中橙皮油素含量較高,金柑雜種中S1時期橙皮油素含量為1.917 0 μg/g;本研究在7個品種中均檢測出了傘形花內(nèi)酯,但其含量均低于0.10 μg/g,或無法定量。蕓香科中對于香豆素的研究主要集中在佛手、柚子等柑桔屬,胡瀚文等[28]在佛手中鑒定出17種香豆素類化合物,而本研究測定了金柑果實中20種香豆素的含量,其中水合氧化前胡素、氧化前胡素、8-氧甲基異歐前胡內(nèi)酯、異紫花前胡內(nèi)酯、珊瑚菜素是首次在金柑中檢出。

2.7 金柑果實中五類生物活性成分總含量聚類分析

對8種金柑果實中五大類生物活性物質(zhì)的含量進行聚類分析,結(jié)果如圖4所示。

圖4 S1時期不同品種金柑果實中生物活性成分含量差異Fig.4 Differences in the content of bioactive ingredients in the fruits of different varieties of citrus in the S1 period注:圖中物質(zhì)的相對含量從紅到綠依次遞減。

品種的差異會直接影響到金柑果實代謝產(chǎn)物的多樣性;在本研究檢測的85種生物活性成分中,對比發(fā)現(xiàn)類黃酮在金柑的生物活性成分中貢獻值最大,占總物質(zhì)含量的80.70%～97.16%,其中金柑雜種的生物活性成分的總含量明顯優(yōu)于其他7個品種,但其金柑特有類黃酮金柑苷的含量顯著低于其他金柑品種,甚至在S4時期未檢出金柑苷。由圖4可明顯看出,除金柑雜種外,其他金柑中總類黃酮含量均以金柑苷為主,其金柑苷含量占類黃酮總量的26.08%～79.08%。金柑苷可作為金柑雜種區(qū)別于其他金柑的顯著特征物質(zhì),這一差異可能與金柑雜種的母本父本有關(guān)。金柑雜種中有19種物質(zhì)含量顯著高于其他金柑,11種類黃酮物質(zhì)分別為新西蘭牡荊苷、杜荊素-2-O-鼠李糖苷、地奧司明、新地奧司明、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素、5,7,8,4′-四甲氧基黃酮、橙皮苷、新橙皮苷和根皮苷,3種生物堿分別為大麥芽堿、N-甲基酪胺和章魚胺、1種酚酸為綠原酸,1種類檸檬苦素為檸檬苦素,2種普通香豆素為濱蒿內(nèi)酯和橙皮油素,1種呋喃香豆素為異歐前胡素;長壽金柑中的諾米林和酪胺含量與其他金柑有顯著差異,四季橘中的5種生物活性成分的含量顯著高于其他金柑,包括1種類黃酮為根皮苷,2種類檸檬苦素分別為檸檬苦素和諾米林,2種生物堿為酪胺和N-甲基酪胺;滑皮金柑中的2種類黃酮包括金柑苷和枸橘苷含量顯著高于其他金柑;溫州羅浮和瀏陽金彈為金柑苷含量顯著高于其他金柑,其他金柑的生物活性成分差異不夠明顯。

3 結(jié)論

本研究建立了金柑苷檢測方法,通過分析不同生長階段8個金柑品種果實中的生物活性成分,發(fā)現(xiàn)品種和生長期是影響金柑果實生物活性成分組成的重要因素。8個金柑品種果實共檢出85種生物活性成分包括48種類黃酮、9種酚酸、3種類檸檬苦素,5種生物堿和20種香豆素。隨著果實的膨大,花后35～125 d期間8種金柑果實中類黃酮、類檸檬苦素、生物堿總含量隨著金柑果實的生長膨大呈大幅度降低趨勢,在S3時期左右下降幅度趨于平緩,少部分金柑品種的含量在S2時期會小幅度上升,隨后在S4時期下降;果實發(fā)育過程中金柑果實的酚酸、香豆素總含量差異顯著,變化規(guī)律不明顯;8個金柑品種中,金柑雜種的總類黃酮含量最高,但其金柑特有類黃酮金柑苷含量極少,其他7種金柑中總類黃酮含量均以金柑苷為主,其含量占類黃酮總量的26.08%～79.08%,就金柑苷含量而言,滑皮金柑、溫州羅浮和瀏陽金彈可作為金柑苷提取的主要藥用品種材料。根據(jù)上述數(shù)據(jù)分析表明,在金柑生物活性成分提取研究過程中,確定其最佳品種與最佳研究時期是非常有必要且有意義的。本研究對整個生長發(fā)育階段生物活性物質(zhì)變化規(guī)律進行了前期摸索,研究結(jié)果明確了金柑果實不同生長時期的生物活性成分差異,對后續(xù)研究金柑生物活性物質(zhì)積累規(guī)律及挖掘相關(guān)基因有重要意義,為更好地開發(fā)利用金柑資源及豐富我國金柑發(fā)展品種提供了一定的科學(xué)參考。