鱉甲活性寡肽I-C-F-6的合成工藝研究

張梓杰,曾 琪,張 佟,雷海民,徐 冰

北京中醫(yī)藥大學,北京 100102

中藥鱉甲(Carapaxtrionycis)為鱉科動物鱉(Trio-nyxsinensisWiegmann)的背甲,具有滋陰潛陽、退熱除蒸和軟堅散結的功效。以鱉甲為君藥的制劑鱉甲煎丸和復方鱉甲軟肝片在臨床上常用于治療肝纖維化[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究結果表明,鱉甲及其復方制劑具有防治肝細胞損傷、改善肝功能、減輕肝細胞變性壞死以及抑制肝纖維化形成的作用[3-4]。近年來的研究表明,小分子寡肽可能是鱉甲抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎[5-7]。

本課題組在前期研究中從鱉甲中分離得到活性寡肽I-C-F-6(化學結構見圖1),其氨基酸序列為GAGPHGG。研究表明,I-C-F-6能通過降低肝臟中促炎、促纖維化因子白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平,升高抗炎和抗纖維化因子白細胞介素10(interleukin-10,IL-10)的水平,抑制肝組織中E-cadherin蛋白的表達,顯著改善由CCl4誘導的大鼠肝纖維化[8-9]。賀松其教授團隊采用CCl4誘導的大鼠肝纖維模型對I-C-F-6的作用機制研究發(fā)現(xiàn),其能顯著改善肝纖維化大鼠肝損傷,減少細胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)沉積,抑制核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)p65和Wnt/β-catenin信號通路的活化,進而調(diào)控其下游CTGF、TGF-β1、TNF-α和VEGF等各種細胞因子的表達水平[10-11]。肽類化合物的現(xiàn)代合成方法分為固相合成法與液相合成法,其中固相合成法操作步驟簡單、易于投入實際生產(chǎn)[12]。因此,本實驗用正交實驗,以目標肽質(zhì)量分數(shù)作為評價指標,優(yōu)選活性寡肽I-C-F-6的固相合成工藝,研究結果為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權的抗肝纖維化創(chuàng)新藥物奠定基礎。

圖1 鱉甲寡肽I-C-F-6的結構

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20A型高效液相色譜儀;Beta 2-8 LDplus型真空冷凍干燥機(德國Christ公司);RE-3000B型旋轉蒸發(fā)器(日本EYELA有限公司);BSA224S-CW型萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯公司);TY-80A/S型脫色搖床(常州榮華儀器制造有限公司)。

1.2 試藥

Fmoc-Gly-Wang resin、2-氯三苯甲基樹脂、Rink Amide MBHA樹脂、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-His(boc)-OH、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯[O-(6-chloro-1-hydrocibenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat,HCTU]、I-C-F-6(對照品)均購自吉爾生化(上海)有限公司;N,N’-二異丙基碳二亞胺(N,N’-diisopropylcarbodiimide,DIC,質(zhì)量分數(shù)為98%)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA,質(zhì)量分數(shù)為99.0%)均購自上海麥克林生化科技有限公司;哌啶(piperidine,PIP,質(zhì)量分數(shù)為99%)、1-羥基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole,HOBt,質(zhì)量分數(shù)99%)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide,EDCI,質(zhì)量分數(shù)為98%]、N,N-二異丙基乙胺(N,N-diisopropylethylamine,DIPEA,質(zhì)量分數(shù)為99%)均購自北京伊諾凱科技有限公司;無水乙醚(分析純,北京市通廣精細化工公司三河分公司);甲醇(分析純)、二氯甲烷(分析純)、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF,分析純)均購自天津市致遠化學試劑有限公司;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、醋酸銨(色譜純)均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

2 方法與結果

2.1 試劑的配制

2.1.1體積分數(shù)20% PIP-DMF溶液 取20 mL PIP,溶于80 mL DMF中,即得。

2.1.2體積分數(shù)95%TFA溶液 量取5 mL去離子水加入95 mL TFA中,即得。

2.1.3Kaise test溶液 溶液1:取80 g苯酚溶于15.8 g無水乙醇中,即得;溶液2:取0.2 mL KCN(0.001 mol·L-1)溶于9.8 mL PIP中,即得;溶液3:取500 mg茚三酮溶于7.9 g無水乙醇中,即得。

3種溶液均需密閉避光保存。檢驗時滴加溶液1、2、3各2～5滴,加熱4 min。

2.2 鱉甲七肽I-C-F-6的合成與檢測

2.2.1正交實驗設計 正交實驗因素與水平見表1。實驗方法如下(以正交實驗1為例)。

表1 正交實驗的因素及水平

(1)樹脂溶脹:稱取0.5 g Rink Amide MBHA樹脂,置于10 mL多肽反應管中;加入7 mL DMF溶脹20 min,重復1次。

(2)投料:稱取Fmoc-Gly-OH 136.8 mg(氨基酸的投料量=樹脂的質(zhì)量×樹脂取代率×投料比×氨基酸的相對分子質(zhì)量),HCTU 192.4 mg,置于7 mL DMF中溶解,加入DIPEA 59.5 mg,于搖床上振搖1 h。

(3)Kaise test檢測:抽去反應液,用DMF洗滌2次,取少許樹脂,滴入Kaise test溶液中,110 ℃加熱4 min,檢驗溶液呈淡黃棕至紅棕色。

(4)Fmoc的脫除:量取7 mL 2.1.1項下制備的體積分數(shù)為20%的PIP-DMF溶液,進行Fmoc的脫除,并重復1次該操作,用DMF洗滌2次。

(5)Kaise test檢測:取少許樹脂,滴入Kaise test溶液,110 ℃加熱4 min,檢驗溶液呈藍黑色(連接脯氨酸時,溶液呈淡黃棕至紅棕色,樹脂為紅色)。

(6)重復步驟(2)—(5)。

(7)根據(jù)肽鏈倒置順序投料,制備目標樹脂。

(8)樹脂的切割:用甲醇、二氯甲烷洗滌2次,抽干,加入切割液5 mL,置于搖床上振搖2 h。抽干切割液,減壓濃縮,倒入適量的冰乙醚內(nèi),以4 000 r·min-1離心3 min,棄去上清液,加入乙醚攪拌,再以4 000 r·min-1離心3 min,得沉淀,冷凍干燥。

正交實驗2～9的操作步驟基本與正交實驗1的相同,其中Fomc-Gly-Wang的投料順序為G-H-P-G-A-G,且在樹脂溶脹后進行Fmoc的脫除,Rink Amide MBHA樹脂溶脹后進行保護基的脫除,其他步驟相同。

最終得到凍干粉樣品18份。

2.2.2鱉甲七肽I-C-F-6粗產(chǎn)物的檢測 色譜柱:月旭水性色譜柱Welch Ultimate AQ-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇為有機相A,以5 mmol·L-1醋酸銨水溶液作為水相B;梯度洗脫:98%B～27%A;檢測波長:220 nm;流速:1 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。

稱取粗產(chǎn)物凍干粉,配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的水溶液,每份樣品進樣2次,以峰面積比計算相對含量,結果取平均值。結果見圖2(以實驗8為例)。

注:A.I-C-F-6對照品;B.實驗8粗產(chǎn)物。

2.3 正交實驗的結果與分析

正交實驗中每個實驗重復2次,取平均值。用SAS 8.2軟件對數(shù)據(jù)進行處理和方差分析。L9(34)正交實驗直觀分析結果見表2。正交實驗方差分析結果見表3。

表2 L9(34)正交實驗直觀分析結果

表3 正交實驗方差分析結果

由表2可見,各因素對鱉甲七肽I-C-F-6合成相對含量影響的順序為:A(樹脂類型)>D(反應時間)>C(縮合劑的種類)>B(投料比)。由表3可見,樹脂的類型、投料比、反應時間對I-C-F-6的合成均存在顯著性影響而縮合劑種類對I-C-F-6的合成不存在顯著性影響。因此,從生產(chǎn)實際和資源利用的角度考慮,可將合成的較優(yōu)工藝定為采用Fmoc-Gly-Wang樹脂,投料比(樹脂擔載量/氨基酸摩爾質(zhì)量)為1∶5,以6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯[O-(6-chloro-1-hydrocibenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat,HCTU]N,N-二異丙基乙胺(N,N-diisopropylethy-lamine,DIPEA)為縮合劑,反應2 h。

2.4 驗證及放大實驗

各實驗平行1次,得到樣品6份,每個樣品進樣2針,結果取平均值,驗證實驗目標肽產(chǎn)率為77.03%,在5倍和25倍放大實驗中目標肽的產(chǎn)量分別為62.86%、78.69%。

3 討論

肽類化合物的固相合成涉及樹脂、縮合劑、氨基酸保護基的選擇,投料比與反應時間對合成的影響也十分顯著。在本實驗中,選擇了以MBHA樹脂為代表的氨基樹脂、以WANG樹脂為代表的羥基樹脂、以2-氯三苯甲基樹脂為代表的三苯甲基樹脂作為樹脂類型的考察因素,選擇以DIC、EDCI為代表的碳二亞胺型縮合劑以及以HCTU為代表的鎓鹽型縮合劑作為縮合劑類型的考察因素,以確定活性多肽I-C-F-6的合成工藝。由于Fmoc保護基具有對酸敏感而對堿(脫保護溶液)不敏感的特性[13],故被應用到本次實驗中。投料比與反應時間的選擇也基于高倍量反應物推動反應正向進行的原則加以確定[14]。

正交實驗結果顯示,實驗1、3、4、5中I-C-F-6的產(chǎn)率相對較低,分析可能由于多肽固相合成中反應投料比高倍量可促進反應正向進行,而實驗1和4的投料比過小且反應時間短,導致反應不完全,從而造成產(chǎn)率相對較低;而實驗5雖然投料比為1∶3,但由于反應時間不充足,導致產(chǎn)率較低;實驗3采用DIC/HOBt作為縮合劑且以5倍投料反應,在反應過程中發(fā)現(xiàn)有部分反應原料析出,這可能是導致實驗3產(chǎn)率低的原因。

中醫(yī)藥是世界醫(yī)學的寶藏,從中藥中尋找抗肝纖維化活性成分的報道很多[15-17],其中天然活性寡肽類成分具有良好的成藥性,可被人體腸道直接吸收[18],其與游離氨基酸相比,更容易進入血液,目前尋找小分子活性寡肽作為藥物或先導化合物已成為國內(nèi)外藥學領域研究的熱點之一[19]。中藥是優(yōu)質(zhì)的天然寡肽庫,對中藥中寡肽類活性成分的研究已經(jīng)引起國內(nèi)外學者的密切關注[20-21]。本實驗通過正交實驗,采用經(jīng)典的固相合成法,優(yōu)選鱉甲中抗肝纖維化活性寡肽I-C-F-6的合成工藝,操作簡單,適用于工業(yè)生產(chǎn),為I-C-F-6新藥的研發(fā)奠定基礎。