他莫昔芬脂質(zhì)體的制備及抗腫瘤活性研究

景莎莎,梁 宇,胡海洋

1.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院,西安 710100;2.深圳市博德維環(huán)境技術(shù)股份有限公司西安分公司,西安 710000;3.沈陽藥科大學(xué),本溪 117004

乳腺癌的發(fā)病率位居中國女性惡性腫瘤的首位[1],世界衛(wèi)生組織2020年的數(shù)據(jù)顯示,乳腺癌已正式取代肺癌,成為全球第一大癌癥[2],約70%的乳腺癌為激素受體陽性[3],目前針對這類乳腺癌的主要治療手段為內(nèi)分泌治療[4]。

他莫昔芬(tamoxifen,TAM)與雌激素競爭性結(jié)合雌激素受體(estrogen receptor,ER),從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[5]。研究發(fā)現(xiàn),TAM能顯著抑制ER陽性乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[6-7]。但TAM在水中的溶解度極低,口服胃腸道溶出差,生物利用度較低[8]。

本研究利用脂質(zhì)體生物相容性好、毒性低、廣泛用于癌癥治療的優(yōu)點[9],將TAM制備成他莫昔芬脂質(zhì)體(tamoxifen liposomes,TAM-LIPs)。TAM-LIPs利用高通透性和滯留(enhanced permeability and retention,EPR)效應(yīng)靶向腫瘤組織,增加藥效,降低毒性。包封率(encapsulation efficiency,EE)和載藥量(drug loading,DL)直接決定藥物在體內(nèi)的療效[10],故提高EE和DL非常重要。Box-Behnken效應(yīng)面法已廣泛應(yīng)用于制劑的優(yōu)化中[11],適用于多因素多水平實驗設(shè)計,評價因素與指標(biāo)間的非線性關(guān)系,具有預(yù)測性好、精度高的優(yōu)點[12]?，F(xiàn)擬利用薄膜分散法[13]制備TAM-LIPs,用Box-Behnken效應(yīng)面法同時優(yōu)化EE、DL,驗證用最佳處方制備的TAM-LIPs在體液(pH 7.4)中的穩(wěn)定性,研究TAM-LIPs對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制作用,提高乳腺癌內(nèi)分泌療法的治療效果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

日立L-2000系列高效液相色譜儀(日本Hitachi公司);RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);TGL-16C型臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);KYC-100B型恒溫培養(yǎng)搖床(上海福瑪實驗設(shè)備有限公司);馬爾文激光粒度儀(美國DT公司);TECAN SPECTRA多功能酶標(biāo)儀(德國Wetzlar公司);細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(上海龍躍儀器設(shè)備制造有限公司);MM-1型微量振蕩器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥

枸櫞酸他莫昔芬(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%,大連美侖生物技術(shù)有限公司);蛋黃卵磷脂、膽固醇均購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司;甲基噻唑藍(lán)、胰酶、DMSO均購自美國Sigma公司;高糖DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司);96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(無錫耐思生物科技有限公司);葡聚糖凝膠G-50(北京索萊寶科技有限公司);甲醇(色譜純,山東禹王化工有限公司);透析袋(相對分子質(zhì)量為14 000,美國聯(lián)合碳化物公司)。

1.3 細(xì)胞

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 TAM-LIPs與空白脂質(zhì)體的制備

TAM-LIPs:精密稱取適量的蛋黃卵磷脂、膽固醇和TAM,置于250 mL茄形瓶中,用氯仿溶解,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑,使其形成均勻薄膜。將適量pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)加入茄形瓶中,55 ℃水浴條件下水化30 min,得到TAM-LIPs混懸液。

空白脂質(zhì)體(BLANK-LIPs):制備方法同TAM-LIPs,溶解脂質(zhì)材料時加入蛋黃卵磷脂、膽固醇即可,不加入TAM。

2.2 TAM體外分析方法的建立

2.2.1高效液相色譜法(HPLC)分析條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 色譜柱為Kromasil C18(200 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為甲醇-水(含質(zhì)量濃度為5 mL·L-1的三乙胺)=10∶90;流速為1 mL·min-1;檢測波長為240 nm;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=41 838C-5 297.3(R2=0.999 8),他莫昔芬質(zhì)量濃度在2.00～100.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2包封率測定 采用葡聚糖凝膠法[14]測定TAM-LIPs的包封率,精密吸取TAM-LIPs混懸液0.5 mL加于微柱頂端,以2 000 r·min-1離心2 min,再加入蒸餾水0.5 mL,以2 000 r·min-1離心3 min,收集洗脫液,重復(fù)上述操作。收集前3管洗脫液,合并后置于10 mL量瓶中,以甲醇定容,用HPLC法測定,并計算包封于脂質(zhì)體中TAM的質(zhì)量(m1);另取TAM-LIPs混懸液0.5 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇破乳并稀釋至刻度,測定總藥物質(zhì)量(m2)。EE=(m1/m2)×100%。

2.3 Box-Behnken實驗設(shè)計

EE和DL是TAM-LIPs質(zhì)量評價中的重要指標(biāo),選擇磷脂與藥物質(zhì)量比(A)、磷脂與膽固醇質(zhì)量比(B)、水化溫度(C)作為獨立變量,各變量設(shè)計3個水平,以包封率(y1,EE)和載藥量(y2,DL)為評價指標(biāo),利用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化處方。因素與水平見表1,實驗方案與結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計中的因素與水平

表2 實驗方案與結(jié)果

2.3.1二次回歸模型的建立 利用Design Expert 10軟件進(jìn)行回歸分析,得到二次多元回歸方程。

EE=89.96+11.81A+1.96B-0.36C-2.45AB-0.37AC+2.27BC-19.61A2-10.36B2-4.37C2(R2=0.963 4)

DL=2.40-1.31A+0.60B-0.001 25C-0.40AB-0.013AC-0.050BC+0.36A2-0.59B2-0.070C2(R2=0.996 0)

回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表3。

表3 回歸方程中系數(shù)的顯著性檢驗

2.3.2方差分析和顯著性檢驗 2個擬合方程相關(guān)系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果表明二次多項式回歸擬合程度良好,由表3中的回歸系數(shù)顯著性檢驗P值可知,模型1中A(P=0.000 1)﹑A2(P<0.000 1)、B2(P=0.001 8)極顯著, 其他項不顯著, 且失擬差(lack of fit)不顯著(P=0.088 0>0.05);模型2中A(P<0.000 1)、B(P<0.000 1)、AB(P=0.000 1)、A2(P=0.000 2)、B2(P<0.000 1)極顯著,其他項不顯著,且失擬差也不顯著(P=0.115 1>0.05)。表明自變量與EE、DL之間的線性關(guān)系顯著,可利用此模型預(yù)測TAM-LIPs的EE和DL。

2.3.3效應(yīng)面優(yōu)化與驗證 用Design Expert 10軟件繪制各指標(biāo)與3個自變量的三維效應(yīng)面圖,見圖1和圖2,效應(yīng)面圖更好地表征了不同因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響,并得到同時使EE和DL均較高的處方和工藝:A為22.988,B為5.781,C為50.9 ℃。由圖1和圖2可見,優(yōu)化目標(biāo)(EE和DL)受3個因素之間交互作用的影響較顯著,這與方差分析的結(jié)果一致。

圖2 不同因素對TAM-LIPs載藥量(y2)影響的效應(yīng)面圖

按最佳處方和工藝重復(fù)3次實驗,得到平均包封率、平均載藥量分別為84.131%、3.059%,實測值與模型預(yù)測值接近,表明該模型可準(zhǔn)確預(yù)測EE、DL。結(jié)果見表4。

表4 模型驗證實驗的預(yù)測值和實測值

2.3.4TAM-LIPs表征 用激光粒徑分析儀測定TAM-LIPs的粒徑和Zeta電位,用透射電鏡觀察粒子的微觀形態(tài)[15-16]。

取用最佳處方和工藝條件制備的TAM-LIPs混懸液適量并稀釋,用馬爾文激光粒度儀對TAM-LIPs混懸液的粒徑與Zeta電位平行測定3次,結(jié)果見圖3。TAM-LIPs的平均粒徑為(141.5±2.3) nm,PDI為(0.248±0.031),Zeta電位為(-21.9±0.42) mV。

注:A.TAM-LIPs混懸液的粒徑分布;B.TAM-LIPs混懸液的Zeta電位。

將TAM-LIPs混懸液稀釋10倍后,吸取10 μL滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上,室溫靜置5 min后用濾紙吸干,滴加體積分?jǐn)?shù)為1%的磷鎢酸溶液染色5 min,于透射電鏡下觀察,結(jié)果見圖4。由圖4可見,TAM-LIPs為球形或類球形,粒徑分布在130～170 nm范圍內(nèi)。

圖4 TAM-LIPs混懸液的透射電鏡圖

2.3.5穩(wěn)定性考察 通過測定脂質(zhì)體在4 ℃放置時的滲漏率來評價其穩(wěn)定性[17]。測定TAM-LIPs混懸液在4 ℃放置1、2、3、5、7、10、15 d的滲漏率,結(jié)果見圖5。由圖5可見,TAM-LIPs在15 d內(nèi),包載藥物TAM的滲漏率低于15%,較穩(wěn)定。

圖5 TAM-LIPs混懸液在4 ℃放置15 d的滲漏曲線(n=3)

2.3.6體外釋放研究 用透析法[18]研究TAM混懸液(以水為溶劑)與TAM-LIPs混懸液的體外釋放行為。分別精密量取適量TAM混懸液與TAM-LIPs混懸液,分別裝于透析袋中,置于裝有PBS緩沖液的50 mL錐形瓶中,于37 ℃恒溫振蕩。分別在0.5、l、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h吸取1 mL釋放介質(zhì),同時補充等體積空白介質(zhì),測定TAM的釋放量,計算TAM的累積釋放度,見圖6。由圖6可見,TAM-LIPs中TAM的釋放速度比TAM混懸液慢,具有一定的緩釋作用。

圖6 TAM-LIPs混懸液及TAM混懸液的釋放曲線(n=3)

2.3.7體外細(xì)胞毒性評價 用MTT法評價TAM原料藥、BLANK-LIPs及TAM-LIPs的體外細(xì)胞毒性[19]。分別用無血清高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋,配制質(zhì)量濃度為0.74、1.86、3.72、5.57、7.43、11.15、18.58、37.16 μg·mL-1的系列TAM溶液(溶劑為DMSO)及TAM-LIPs混懸液。以5×103個·孔-1的密度將MCF-7細(xì)胞接種于96孔板中,在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)12 h,于每孔中加入200 μL各系列質(zhì)量濃度的TAM溶液、BLANK-LIPs及TAM-LIPs,各質(zhì)量濃度均設(shè)置3個復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,加入20 μL MTT溶液,培養(yǎng)4 h,棄去溶液,于各孔中加入150 μL DMSO溶解,用微量振蕩器振蕩10 min使結(jié)晶紫完全溶解,測定490 nm處的吸光度值(A),計算細(xì)胞存活率和IC50值,結(jié)果見圖7。

圖7 不同質(zhì)量濃度的TAM溶液、BLANK-LIPs混懸液、TAM-LIPs混懸液對MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性(n=3)

由圖7可見,BLANK-LIPs對MCF-7細(xì)胞幾乎無抑制作用,而TAM溶液、TAM-LIPs對MCF-7細(xì)胞顯示出一定的抑制作用,其IC50值分別為5.36、4.36 μg·mL-1。

3 討論

TAM作為雌激素受體調(diào)節(jié)劑,常用于乳腺癌和卵巢癌的治療,也可用于肝癌[20]、胰腺癌[21]、腦癌[22]等其他癌種的治療,其化學(xué)結(jié)構(gòu)與膽固醇相似,可降低脂質(zhì)雙層膜的流動性和滅活P-170糖蛋白外排泵[23],或通過下調(diào)ABCB1的水平和上調(diào)烯醇化酶1的水平[24]逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的多藥耐藥。

本實驗用薄膜分散法制備TAM-LIPs,用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化得到TAM-LIPs的最優(yōu)處方和工藝(磷脂與藥物的質(zhì)量比為22.988,磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為5.781,水化溫度為50.9 ℃)。用最優(yōu)處方制得的TAM-LIPs的EE和DL分別為84.131%、3.059%,與預(yù)測值接近。由效應(yīng)面圖可知,對EE和DL影響的主次順序為A>B>C。

用最優(yōu)處方和工藝制得的TAM-LIPs的粒徑為(141.5±2.3) nm,且分布均勻,在體液pH條件下穩(wěn)定性良好。TAM-LIPs對MCF-7細(xì)胞的體外抑制作用略優(yōu)于TAM原料藥,生物相容性好,可提高生物利用度,降低藥物毒性,而且具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的作用,在提高乳腺癌治療效果的同時,也可為多種癌癥的多藥聯(lián)合治療提供新的選擇。