陜西產(chǎn)艾葉中非揮發(fā)性成分的初步分析

王 昆,馬如龍,王云會(huì),張麗華,王春柳,蘇同生*

1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院,西安 710003;2.西安醫(yī)學(xué)院,西安 710003;3.陜西省中醫(yī)藥研究院,西安 710003

艾葉(ArtemisiaargyiLevl. et Vant.),又名冰臺(tái)、遏草、香艾、灸草等[1]。艾葉以全草入藥,具有祛濕止血、驅(qū)寒溫經(jīng)、止咳消炎、防蚊驅(qū)蟲(chóng)等作用[2]?，F(xiàn)代研究表明,艾葉含有香豆素、糖苷、黃酮、甾醇、萜類(lèi)化合物、揮發(fā)油等[3],具有活血、抗氧化、抗誘變、抗炎、抗癌、抗菌及調(diào)節(jié)免疫等生物活性[4-5],其中黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)等非揮發(fā)性成分的藥理活性也值得關(guān)注。

隨著人們保健意識(shí)的提高,艾灸作為新興的保健項(xiàng)目,近年來(lái)在健康消費(fèi)和美容消費(fèi)市場(chǎng)上日益成為熱點(diǎn),市場(chǎng)潛力巨大[6]。目前我國(guó)艾草產(chǎn)業(yè)發(fā)展處于極不平衡的狀態(tài),湖北蘄春和河南南陽(yáng)區(qū)域產(chǎn)的艾草品牌度較高,供不應(yīng)求,因此全國(guó)多地區(qū)也在積極開(kāi)展優(yōu)秀品種的種植、培育工作,以期能盡快擴(kuò)大艾葉產(chǎn)區(qū),盡早滿足市場(chǎng)需求[7]。雖然艾葉的質(zhì)量控制方法在逐漸提高,但目前2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)中尚無(wú)對(duì)艾葉非揮發(fā)性成分的質(zhì)量控制內(nèi)容[1],因此開(kāi)展相關(guān)內(nèi)容的研究具有一定的實(shí)踐意義。

本文擬針對(duì)陜西產(chǎn)艾葉中非揮發(fā)性成分建立高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)指紋圖譜分析方法,以指紋圖譜聯(lián)合多元統(tǒng)計(jì)分析、比較蘄春產(chǎn)艾葉與陜西產(chǎn)艾葉中非揮發(fā)性成分的主要特征,為陜西產(chǎn)艾葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀(配G1311B型四元泵、G1329B型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G1315型二極管陳列檢測(cè)器,美國(guó)安捷倫科技有限公司公司);超聲波清洗器(熊貓集團(tuán)南京電子計(jì)量有限公司);SQP型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);水浴鍋(泰斯特科技有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品:綠原酸(批號(hào) 20081301,四川省維克奇生物科技有限公司);異澤蘭黃素(批號(hào)CHB201217)、異綠原酸C(批號(hào)CHB201227)、棕矢車(chē)菊素(批號(hào)CHB210113)、新綠原酸(批號(hào)CHB201129)、異綠原酸A(批號(hào)CHB201227),均購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司;甲酸(賽默飛世爾科技有限公司);甲醇(色譜純,美國(guó)霍尼韋爾公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

艾葉樣本為端午前一周采集,避光、晾干后備用[8]。樣本經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院楊智峰研究員鑒定為Artemisiaargyilevl. et Vant.的干燥葉。產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。

表1 樣品產(chǎn)地來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil 100-5 C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動(dòng)相為2 mL·L-1甲酸水溶液(A)-甲醇(B),梯度洗脫:0～5 min,20%～51% B;5～10 min,51%～60% B;10～15 min,60% B;15～35 min,60%～80% B;35～40 min,80%～95% B;40～50 min,95% B。檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm;流速為0.3 mL·min-1;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱定對(duì)照品異澤蘭黃素、綠原酸、異綠原酸C、棕矢車(chē)菊素、新綠原酸、異綠原酸A適量,加甲醇分別制成含異澤蘭黃素、綠原酸、異綠原酸C、棕矢車(chē)菊素、新綠原酸、異綠原酸A 27.6、10.2、18.3、13.0、12.5、24.0 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的配制

取適量干燥艾葉,搗碎30 min,精密稱取艾絨與艾粉混合物1 g,加入60 mL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇,水浴回流30 min,靜置至室溫后補(bǔ)足質(zhì)量,用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1精密度實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,計(jì)算得各共有峰的相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間的RSD值分別為0.01%～1.81%、0.01%～0.05%[9]。

2.4.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.3 項(xiàng)下供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣分析,計(jì)算得相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別為0.01%～1.96%、0.01%～0.06%[9]。

2.4.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取1號(hào)樣本平行制樣6份,按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算得相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD值分別為0.01%～4.08%、0.01%～0.07%。

2.5 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

取不同產(chǎn)地艾葉按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,按照《中藥色譜指紋圖譜》要求,將25批艾葉HPLC色譜圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2015年版)”中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。自動(dòng)匹配色譜峰,生成25批陜西不同產(chǎn)地艾葉指紋圖譜以及對(duì)照指紋圖譜,標(biāo)定并指認(rèn)出6個(gè)共有峰成分,分別為新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、棕矢車(chē)菊素和異澤蘭黃素,混合對(duì)照品色譜峰見(jiàn)圖1、25批不同產(chǎn)地艾葉的指紋圖譜疊加圖見(jiàn)圖2。

注:1.新綠原酸; 2.綠原酸; 3.異綠原酸A; 4.異綠原酸C; 5.矢車(chē)菊素; 6.異澤蘭黃素。

注:1.新綠原酸; 2.綠原酸; 3.異綠原酸A; 4.異綠原酸C; 5.矢車(chē)菊素; 6.異澤蘭黃素。

應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2015版)”對(duì)25批樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度分析,以對(duì)照指紋圖譜為參照,對(duì)25批艾葉色譜圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算,結(jié)果見(jiàn)表2,25批艾葉樣本與自動(dòng)生成的對(duì)照?qǐng)D譜相比,相似度均大于0.92,表明相似度良好。

表2 樣品的相似度分析

由表2可知,蘄春產(chǎn)樣本(S1～S6)與19批陜西產(chǎn)樣本相似度均在0.91以上,19批陜西產(chǎn)艾葉相互比較,相似度為0.86～0.99;對(duì)陜西不同產(chǎn)區(qū)樣本進(jìn)行比較,寶雞產(chǎn)樣本(S7～S12)與商洛產(chǎn)樣本(S13～S19)相似度為0.87～0.99,寶雞產(chǎn)與銅川產(chǎn)樣本(S20～S25)的相似度為0.88～0.99,商洛產(chǎn)區(qū)與銅川產(chǎn)區(qū)之間相似度為0.88～0.99。比較各個(gè)產(chǎn)區(qū)的不同樣本之間相似度發(fā)現(xiàn):蘄春產(chǎn)樣本相似度為0.95～0.99,陜西寶雞產(chǎn)各樣本相似度為0.93～0.99,商洛產(chǎn)樣本的相似度在0.91～0.99,銅川產(chǎn)各樣本的相似度為0.87～0.98。

2.6 聚類(lèi)分析

用SPSS 19.0軟件,以共有峰峰面積信息對(duì)25個(gè)樣本進(jìn)行聚類(lèi)分析,選擇中位數(shù)聚類(lèi)法、平方Euclidean距離作為聚類(lèi)參數(shù)[10-11],分類(lèi)結(jié)果樹(shù)狀圖見(jiàn)圖3。

圖3 25批艾葉樣本的聚類(lèi)分析圖

由圖3可知,所分析的25批艾葉以非揮發(fā)性共有峰為主要特征,大體聚為2類(lèi),蘄春產(chǎn)樣本中5號(hào)樣本與其他4個(gè)樣本距離較遠(yuǎn),全部陜北產(chǎn)樣本、部分陜南產(chǎn)樣本與多數(shù)的蘄春產(chǎn)樣本可聚為一類(lèi),蘄春的一個(gè)樣本與少數(shù)陜南產(chǎn)樣本及多數(shù)關(guān)中產(chǎn)樣本聚為一類(lèi)。

2.7 多元統(tǒng)計(jì)分析

以共有峰峰面積為樣本特征,按照產(chǎn)地分組整理數(shù)據(jù)矩陣,用MetaboAnalyst 5.0對(duì)25批艾葉樣本分別進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis, PCA)[12]及有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)[13],原始數(shù)據(jù)分別經(jīng)過(guò)平方根及帕累托轉(zhuǎn)換后歸一化。PCA得分圖見(jiàn)圖4。

圖4 25批艾葉樣本的PCA得分圖

由圖4可知,各產(chǎn)地樣本整體上呈現(xiàn)交疊分布的特征,蘄春產(chǎn)樣本與陜北、關(guān)中、陜南產(chǎn)大多數(shù)樣本未顯示出分簇的狀態(tài),表明在整體特征上蘄春產(chǎn)樣本與陜西3個(gè)區(qū)域產(chǎn)樣本未見(jiàn)差異。

PLS-DA得分圖及模型交叉驗(yàn)證(cross validation)結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知,各個(gè)產(chǎn)地的樣本依然無(wú)明顯分簇。對(duì)所建立的PLS-DA模型進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),在基于各主成分的驗(yàn)證中,模型的R2值均在0.4以下,Q2值均為負(fù)值。

注:A. PLS-DA記分圖;B.內(nèi)部交叉驗(yàn)證結(jié)果。

3 討論

建立中藥材指紋圖譜時(shí),色譜條件和制樣方法的優(yōu)化是關(guān)鍵。本文為確定指紋圖譜關(guān)鍵參數(shù),分別對(duì)流動(dòng)相組成、洗脫梯度、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、流速和進(jìn)樣量進(jìn)行了系統(tǒng)考察,在優(yōu)化流動(dòng)相梯度及流速時(shí)耗費(fèi)了較長(zhǎng)時(shí)間,最終確定了最優(yōu)條件;對(duì)于供試品制備方法,分別考察了取樣量、溶劑種類(lèi)、溶劑倍量、提取方式和提取時(shí)間,選擇出提取效率最高的方式進(jìn)行了樣本制備。

進(jìn)行相似度分析時(shí)發(fā)現(xiàn),蘄春產(chǎn)艾葉與陜西產(chǎn)艾葉非揮發(fā)性成分指紋圖譜具有很高的相似度,表明在主要的非揮發(fā)性成分特征方面,陜西產(chǎn)艾葉整體上與蘄春產(chǎn)艾葉具有很高的相似度。此外,陜西不同地區(qū)(陜北、關(guān)中、陜南)之間比較,相似度也較高(均在0.87以上);陜西不同產(chǎn)區(qū)樣本之間的相似度波動(dòng)比蘄春與陜西產(chǎn)樣本之間的相似度波動(dòng)相近甚至更大。眾所周知,陜西分為陜北、關(guān)中、陜南3個(gè)區(qū)域,不同區(qū)域之間地理與生態(tài)環(huán)境相差較大,溫度、日照、土壤、水分等因素的不同可能導(dǎo)致艾葉中化學(xué)成分不同[14]。此外,比較各產(chǎn)區(qū)樣本之間相似度波動(dòng)的范圍,蘄春要比陜西各區(qū)域均小,這也表明,即使是在陜西省內(nèi)部的各產(chǎn)區(qū)進(jìn)行艾葉種植、采收和加工,仍需加強(qiáng)其有效成分的質(zhì)量監(jiān)控。

PCA是一種無(wú)監(jiān)督的分析方法[15],其分析過(guò)程中,默認(rèn)對(duì)所有樣本不加以區(qū)分,即每個(gè)樣本對(duì)模型有著同樣的貢獻(xiàn),當(dāng)樣本的組間差異較大而組內(nèi)差異較小時(shí),無(wú)監(jiān)督分析方法可以明顯區(qū)分組間差異;但當(dāng)樣本的組間差異不明顯而組內(nèi)差異較大時(shí),無(wú)監(jiān)督分析方法難以發(fā)現(xiàn)和區(qū)分組間差異。另外,如果組間的差異較小,各組的樣本量相差較大,樣本量大的那組將會(huì)主導(dǎo)模型。而有監(jiān)督的PLS-DA分析能很好地解決無(wú)監(jiān)督分析中存在的這些問(wèn)題[16]。但是,作為一種有監(jiān)督的分類(lèi)模型,PLS-DA模型可能會(huì)存在過(guò)擬合風(fēng)險(xiǎn),因此需要驗(yàn)證模型的可靠性[17]。交叉驗(yàn)證是常用的檢驗(yàn)方法之一,其基本過(guò)程為通過(guò)逐步增加擬合的主成分來(lái)觀察模型對(duì)變量的解釋度(R2)和預(yù)測(cè)度(Q2)的變化,當(dāng)Q2停止增長(zhǎng)時(shí),主成分不再增加。Q2數(shù)值越大表示模型的預(yù)測(cè)能力越強(qiáng)[18]。一般情況下,模型具備良好的預(yù)測(cè)性能要求Q2至少大于0.5[19-20]。在本文中,Q2始終是負(fù)值,表明PLS-DA模型不具備預(yù)測(cè)組間差異的可靠性,導(dǎo)致模型表現(xiàn)不佳的主要原因可能是按照產(chǎn)區(qū)分類(lèi)、陜西產(chǎn)樣本的組內(nèi)差異較大,這也從反面證實(shí)了蘄春產(chǎn)與陜西產(chǎn)樣本之間的差異不顯著。

4 結(jié)論

本文建立的陜西產(chǎn)艾葉指紋圖譜分析方法符合2020年版《中國(guó)藥典》相關(guān)要求,基于指紋圖譜共有峰信息進(jìn)行的聚類(lèi)分析、PCA及PLS-DA判別分析發(fā)現(xiàn),陜西產(chǎn)艾葉中非揮發(fā)性成分的主要特征與蘄春產(chǎn)艾葉無(wú)顯著差異。