生酮飲食導致小鼠骨質(zhì)疏松的轉錄組學

吳秀華，范應靜，葉永濃，李萍，朱青安，陳澤森，李博，王文，鄭磊

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院1檢驗醫(yī)學科，2脊柱骨科，廣東 廣州 510515；3廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院藥學部，廣東 廣州511400

生酮飲食（KD）是一種高脂肪、充足蛋白質(zhì)和極低碳水化合物的配方飲食方案，它模仿機體禁食狀態(tài)時的代謝來誘導酮體的產(chǎn)生，可提高血液中β-羥丁酸水平［1］。近年來KD治療在神經(jīng)退行性疾病、內(nèi)分泌和代謝性疾病、心臟疾病、炎癥性疾病以及腫瘤中取得了一定成效［2］。然而其不良反應如尿液改變、骨密度降低、神經(jīng)病變、心血管疾病和腎結石的發(fā)生等引起關注［3,4］。早在1979年報道，KD療法與骨質(zhì)疏松相關［5］，KD治療難治性癲癇時，患者骨礦物質(zhì)含量進行性丟失［6］，這些臨床研究提示，KD治療癲癇患者骨折的風險不僅來之癲癇發(fā)作，而且因骨密度（BMD）降低而增加骨折風險［7］；兒童正處于生長階段，KD用于治療兒童耐藥性癲癇尤其要關注其對骨骼的負面影響。我們針對KD對骨代謝的影響進行研究，在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)KD降低了松質(zhì)骨的骨密度、骨體積分數(shù)、骨小梁的連接程度，減少皮質(zhì)骨的橫截面積，降低骨力學強度，導致骨質(zhì)疏松，骨質(zhì)疏松的程度接近經(jīng)典去勢模型；且KD小鼠的骨髓腔中成骨細胞減少，破骨細胞增多［8,9］。骨髓中細胞包括骨髓間充質(zhì)干細胞、成骨細胞、破骨細胞和血管內(nèi)皮細胞等多種類型細胞。骨髓細胞可產(chǎn)生可溶性因子進行細胞間通訊，形成骨髓微環(huán)境［10］，任何骨髓微環(huán)境的干擾都可能導致骨穩(wěn)態(tài)的破壞［11］。我們前期根據(jù)高脂飲食及熱量限制飲食的文獻報道總結了KD導致骨質(zhì)疏松的原因，骨髓微環(huán)境改變是其中原因之一［12］，但具體機制尚不清楚。

轉錄組學測序可對特定組織或細胞在特定狀態(tài)下轉錄的所有mRNA進行測序，比對參考基因組，進而實現(xiàn)mRNA序列、豐度、基因結構和新轉錄本等的分析，探尋差異表達基因及信號通路，已在疾病機制探討、疾病分型、疾病生物標志物研究等領域發(fā)揮重要作用［13］，但未見轉錄組學用于KD導致骨質(zhì)疏松的研究報道。

本研究通過提取KD小鼠骨髓細胞的RNA，行轉錄組學測序和生物信息學的分析，篩選與正常飲食組的差異基因及相關通路，并進一步通過RT-qPCR驗證差異基因，為探究KD導致骨質(zhì)疏松的分子機制奠定基礎，為預防KD引起骨質(zhì)疏松提供思路。

1 材料和方法

1.1 動物模型與分組

16只8周齡，體質(zhì)量16～18 g的雌性C57BL/6J小鼠由南方醫(yī)科大學動物中心提供（倫理編號為：NFYY-2021-0969），隨機分為生酮飲食（KD）組和正常飲食（Sham）組，每組8 只。KD 組小鼠喂養(yǎng)生酮飼料（Zeneca），其碳水化合物與脂肪的比例為1：3；Sham組給予普通飼料喂養(yǎng)，所有動物均喂養(yǎng)3個月。

普通飼料購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心。每100 g普通飼料熱量為1338 kJ，含蛋白質(zhì)14.5 g，脂肪4 g，碳水化合物55.5 g，膳食纖維4.5 g，鈣720 mg，磷600 mg，維生素D 2.5 μg；每100 g 生酮飼料熱量為2804 kJ，含蛋白質(zhì)18.2 g，脂肪65.1 g，碳水化合物2.7 g，膳食纖維7.4 g，鈣500 mg，磷300 mg，維生素D 2.5 μg。

1.2 體質(zhì)量、血糖和血酮監(jiān)測

每14 d（2周）每組隨機選取6只小鼠測量其體質(zhì)量，每次每組選取3只小鼠通過剪尾采血，并用血糖儀（JPS-5怡成）、血酮儀（MeterT-1 Sentest Inc.）測量血糖和血酮。

1.3 骨微結構分析

喂養(yǎng)3個月后，用異氟烷氣體麻醉過量麻醉使小鼠安樂死。取小鼠雙側股骨，左側用于提取骨髓細胞中的RNA，行轉錄組學檢測。右側股骨置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h，用于骨微結構分析。

將獲取的小鼠右側股骨垂直放入Micro-CT 標本杯中，行Micro-CT（μ80，瑞士Scanco）掃描分析。預掃完畢后，選擇股骨遠端1/3的區(qū)域進行掃描。設置掃描參數(shù)：電壓為55 kV，電流為145 μA，層厚為12 μm。掃描完畢選取圖層中沒有股骨髁的層面，數(shù)100層進行松質(zhì)骨顯微結構分析，包括骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁間隙（Tb.Sp）、各向異性程度（DA）、骨小梁連接密度（Conn.D）、結構模型指數(shù)（SMI）、骨密度（BMD of TV）、骨組織密度（BMD of BV）等參數(shù)。

1.4 轉錄組學分析

提取小鼠股骨骨髓細胞總RNA并進行濃度、純度及完整性檢測，質(zhì)檢滿足要求后，RNA樣本質(zhì)檢結果見表1。遵照試劑盒（TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit）說明書進行操作。純化提取總RNA中的信使RNA（mRNA）并打斷mRNA成為200-300 bp片段。進一步合成第一鏈cDNA及第二鏈cDNA，構建鏈特異性文庫。對雙鏈cDNA進行末端修復補平，在3’端加個A，再在鏈接酶的作用下加上測序接頭，然后進行片段的選擇，去除多余的接頭序列，PCR擴增富集文庫片段，文庫大小在300～400 bp。檢測文庫大?。ˋgilent2100 Bioanalyzer），熒光定量檢測文庫總濃度（Quantifluor-ST fluorometer，Promega；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，Invitrogen），qPCR 定量檢測有效文庫濃度（Thermo Scientific StepOnePlus Real-Time PCR Systems），根據(jù)文庫的有效濃度、文庫需要得到的數(shù)據(jù)量，將含有不同index序列的文庫按比例進行混合?；旌衔膸旖y(tǒng)一稀釋到2 nmol/L，通過堿變性，形成單鏈文庫。Illumina HiSeq平臺上機測序，以單鏈文庫為模板進行橋式PCR擴增、測序引物退火、邊合成邊測序。樣本處理、上機測序及生物信息分析由南京派森諾基因科技有限公司完成。

表1 RNA樣本質(zhì)檢表Tab.1 Quality check table for RNAsamples

1.5 生物信息分析

采用Excel軟件t檢驗對得到的轉錄組學原始數(shù)據(jù)進行P值計算，再按照倍數(shù)變化值的計算公式計算，過濾掉接頭以及低質(zhì)量序列并篩選出P＜0.05且log2FC絕對值＞1的基因。在DAVID網(wǎng)站進行基因本體（GO）富集和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。

1.6 實時熒光定量PCR

按RNAiso Plus（Takara）說明書提取總RNA，檢測小鼠骨髓細胞RNA濃度，采用逆轉錄和擴增兩步法對DEGs法進行RT-qPCR驗證。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。將目的基因擴增結果經(jīng)內(nèi)參校正后，以空白組的目的基因擴增結果作為對照，2-△△Ct法比較不同樣品間mRNA的表達量差異。引物信息見表2。

表2 逆轉錄PCR 引物序列Tab.2 Primer sequences for reverse transcription PCR

1.7 統(tǒng)計分析

實驗結果采用SPSS Statistics軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差形式表示，不同時間點兩組動物體質(zhì)量、血糖、酮體水平變化采用重復測量的方差分析進行評價，兩組間骨結構參數(shù)采用獨立樣本t檢驗分析。設置檢驗水準α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠的體質(zhì)量、血糖、血酮結果

兩組小鼠在2周、4周、6周、8周、10周和12周測量的體質(zhì)量、血糖水平、血酮水平如圖1所示，兩組間體質(zhì)量、血糖水平在各個時間點的差異均無統(tǒng)計學意義。兩組間血酮體水平在各個時間點的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 生酮飲食和正常飲食小鼠的體質(zhì)量、血糖、血酮水平Fig. 1 Body weight(A),blood glucose(B)and blood ketone(C)of the mice in the Sham and KD groups.*P＜0.05 vs Sham group.

2.2 小鼠股骨骨微結構

Micro-CT的2D和3D圖可見，KD小鼠松質(zhì)骨的骨小梁間隙變大，骨小梁數(shù)量減少，骨密度降低（圖2）。

圖2 遠端股骨骨松質(zhì)Micro-CT 圖Fig. 2 Micro-CT images of the distal femurs of the two groups.

KD 組小鼠股骨遠端松質(zhì)骨骨體積分數(shù)（P=0.0039）、骨小梁數(shù)量（P=0.0001）、骨小梁連接密度（P=0.0021）、骨密度（P=0.0050）低于Sham組，且骨小梁分離度升高（P=0.0158），差異均有統(tǒng)計學意義。兩組的骨小梁厚度（P=0.8895）、骨小梁結構模型指數(shù)（P=0.5306）、骨組織密度（P=0.9927）沒有明顯差異（表3）。

表3 生酮飲食和正常飲食小鼠股骨遠端松質(zhì)骨的結構參數(shù)Tab.3 Structural parameters of the cancellous bone in the distal femur in the two group mice

2.3 DEGs分析

采用轉錄組學技術對Sham組和KD組的基因表達進行了分析比較，測量基因總數(shù)16 667 個。以差異倍數(shù)log2FC＞1 或log2FC＜-1 為變化閾值，Pval值＜0.05 作為篩選差異基因的標準，結果如圖3A所示，共有165個差異基因，其中91個基因上調(diào)，74個基因下調(diào)，按Pval值大小排序，前20位差異基因如圖3B所示。篩選KD對比Sham小鼠差異基因Padj＜0.05且FC＞2的基因作為進一步研究的基因，共篩得5個差異基因，分別為Acot1、Mpig6b、Gp9、Ppbp、Slc2a9（表4）。

圖3 Sham組與KD組顯著差異基因表達分布及前20位基因聚類圖Fig. 3 Distribution of the significantly differentially expressed genes(A)and cluster map of the top 20 differential genes (B) between Sham and KD groups.In A,the gray dashed line represents the threshold line of the differential gene screening criteria,the blue dot represents the down-regulated gene with significant difference,the red dot represents the up-regulated gene with significant difference,and the gray dot represents the non-significant differential gene.

表4 生酮飲食對比正常飲食小鼠顯著差異基因Tab.4 Significantly differentially expressed genes in ketogenic diet group compared with normal diet group

2.4 GO富集分析

以log2FC＞1 或log2FC＜-1 為變化閾值，Pval值＜0.05 作為標準篩選差異基因進行GO富集分析，分析結果顯示，KD治療組相比Sham組的差異基因主要富集在黏膜的免疫反應、器官和組織特異性免疫反應、細胞對有機物質(zhì)的反應、運動、對外界刺激的反應等生物過程（圖4）。細胞組分的富集結果顯示，差異基因主要分布在細胞外區(qū)部分、細胞外間隙、細胞外區(qū)、纖維膠原三聚體、帶狀膠原纖維等部位。

圖4 Sham組和KD組差異基因GO功能富集的氣泡圖Fig. 4 Bubble diagram of GO functional enrichment of the differential genes between Sham and KD groups.The color and size of the bubbles indicate the size of the P value of each item and the number of differential genes that the item contains,respectively.

2.5 KEGG Pathway分析

對log2FC＞1 或log2FC＜-1 為變化閾值，Pval值＜0.05 作為標準篩選的差異表達基因結果進行KEGG通路富集分析，結果如圖5所示，差異基因主要參與了人類疾病、機體系統(tǒng)、環(huán)境信息處理、細胞過程等。在環(huán)境信息處理信號通路中，Apelin信號通路、PI3K-Akt信號通路、ECM受體互作通路、MAPK信號通路、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用通路的富集程度和差異基因數(shù)均較高，尤以Apelin信號通路、PI3K-Akt信號通路、ECM受體互作通路最明顯。

圖5 Sham組與KD組差異基因的KEGG Pathway分析Fig. 5 KEGG pathway analysis of the different genes between Sham and KD groups.

2.6 RT-qPCR驗證顯著差異基因表達

基于轉錄組學結果，為了進一步驗證和明確KD組相較于Sham組基因表達差異，篩選Padj＜0.05且FC＞2的顯著上調(diào)差異基因，采用RT-qPCR技術驗證。結果顯示，各基因均明顯上調(diào)，Acot1上調(diào)倍數(shù)為2.49±0.665（P=0.01），Mpig6b上調(diào)2.58±0.474倍（P=0.02），Gp9上調(diào)1.58±0.199倍（P=0.01），Ppbp上調(diào)2.59±0.611倍（P＜0.01），Slc2a9上調(diào)1.45±0.162倍（P=0.00），其中上調(diào)倍數(shù)最明顯的基因為Acot1、Mpig6b和Ppbp（圖6）。

圖6 KD組關鍵基因驗證結果Fig. 6 Verification the differentially expressed genes in KD-fed mice using RT-PCR (Mean±SD).*P＜0.05,**P＜0.01 vs Sham group.

3 討論

本研究通過轉錄組學分析KD小鼠骨髓細胞的差異基因及通路富集，發(fā)現(xiàn)骨髓細胞的Acot1、Mpig6b、Gp9、Ppbp、Slc2a9基因顯著上調(diào)，Apelin 信號通路、PI3K-Akt信號通路、ECM受體互作通路、MAPK信號通路、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用通路的富集程度和差異基因數(shù)均較高，前三者信號轉導通路富集程度顯著。進一步RT-qPCR實驗表明KD小鼠骨髓細胞上調(diào)最明顯的基因為Acot1、Mpig6b和Ppbp。

酰基輔酶A硫酯酶1（Acot1）作為一種胞質(zhì)酶，位于細胞質(zhì)中，啟用酰基輔酶A水解酶活性，參與酰基輔酶A代謝過程、長鏈脂肪酸代謝過程和非長鏈的脂肪酸代謝過程。已有研究表明，在禁食期間Acot1 調(diào)節(jié)PPARα（過氧化物酶體增殖物激活受體）耦合脂肪酸通量與氧化能力，且Acot1敲低能降低PPARa基因的表達，Acot1 過表達會驅動PPARα活性［14］。PPARα是PPAR三種亞型之一，PPAR另一亞型PPAR-γ能介導骨髓間充質(zhì)干細胞向成脂分化，減少了骨形成［15］，PPARα在骨代謝中的報道比較少。有學者推測PPARα的激活參與骨髓間充質(zhì)干細胞增殖、分化以及骨代謝，抑制氧化應激緩解骨質(zhì)疏松［16］。本研究骨髓細胞中Acot1基因顯著上調(diào)，Acot1上調(diào)可能促進PPARα活性，但是否導致骨質(zhì)疏松，需要進一步研究。

Mpig6b在人和小鼠中具有直系同源生理作用，調(diào)節(jié)血小板的產(chǎn)生和功能，鼠中Mpig6b位點的缺失可導致大血小板減少和骨髓纖維化［17］。另有文獻［18］報道，Mpig6b基因缺乏的雌性小鼠從8周齡開始出現(xiàn)股骨皮質(zhì)骨厚度增加，骨髓面積減少，到16周齡時髓腔被骨小梁阻塞；Mpig6b缺乏雄性小鼠僅在骨干近端的髓腔發(fā)育少量的骨小梁，并且在16周時表現(xiàn)出骨體積分數(shù)和小梁厚度的暫時降低。由此可見Mpig6b基因與骨代謝相關，Mpig6b基因缺乏導致骨硬化，那么其過表達可能導致骨質(zhì)疏松。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Mpig6b基因上調(diào)，我們推測Mpig6b基因上調(diào)可能是KD導致骨質(zhì)疏松機制之一，需要進一步研究。

Ppbp（CXCL7）編碼的蛋白質(zhì)是一種血小板衍生的生長因子，屬于CXC趨化因子家族，是中性粒細胞的引誘劑和激活劑，能刺激各種細胞過程。Ppbp作為一種趨化因子，被鑒定為一種新的MMP-13底物和破骨細胞形成的調(diào)節(jié)因子［19］。有文獻報道，RANKL和M-CSF存在下用阻斷抗體處理RAW264.7細胞和小鼠BMC，阻斷SDF-1，CXCL7和CX3CL1，強烈抑制小鼠BMC中的TRAP活性，表明Ppbp趨化因子是從小鼠BMC分泌的，并且與破骨形成有關［20］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)KD小鼠Ppbp（CXCL7）基因上調(diào)，這可能促進了破骨細胞的形成及分化，從而導致骨吸收能力增加，破壞了骨平衡。

基于轉錄組學，我們發(fā)現(xiàn)差異基因在Apelin信號通路、PI3K-Akt信號通路、ECM受體互作通路等信號通路富集高。Apelin是一種參與骨穩(wěn)態(tài)的內(nèi)源性脂肪因子，Apelin-13激活了BMSCs中的線粒體自噬，改善氧化應激，恢復成骨功能［21］。PI3K-Akt通路是經(jīng)典的骨代謝通路之一，由杜仲組成的混合物清氏丸通過PI3KAkt通路和ATM通路抑制鐵死亡，促進細胞存活，對骨質(zhì)疏松癥有治療作用［22］。也有研究表明鎘通過P2X7/PI3K/AKT通路介導了成骨細胞和破骨細胞分化［23］，引起骨質(zhì)疏松。ECM受體互作通路涉及一系列生物學過程，如細胞分化、增殖和凋亡，ECM受體互作通路與骨質(zhì)疏松癥有關［24］，此外，有研究報道了ECM受體互作通路調(diào)節(jié)人MSC的成骨分化［25］。由此可見，以上三條通路可能是KD導致骨質(zhì)疏松的關鍵通路，需要進一步驗證。

此外，雖然差異基因在MAPK信號通路富集不如前三條通路高，已有研究表明，MAPK信號通路可以通過激活多種骨標志物的表達調(diào)節(jié)成骨細胞的分化［26］，MAPKs及其下游轉錄因子如ERK1/2、p38和JNK已被發(fā)現(xiàn)與其他諸如堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白等多種成骨細胞表型標記物協(xié)同激活［27］。MAPK通路也可能是KD治療導致的骨生成和骨吸收不平衡進而形成骨質(zhì)疏松的通路。

本研究有幾個局限性，首先，我們僅使用雌性小鼠作為研究對象，雖然骨髓細胞中的雌激素水平有限，然而雌激素的干擾可能無法完全排除。如果能同時研究雄性小鼠和雌性小鼠在KD代謝中骨髓細胞基因的改變更加嚴謹。其次，本研究只用RT-qPCR驗證差異基因，后續(xù)研究我們將用KD不同代謝產(chǎn)物干預骨相關細胞，并驗證其差異基因及蛋白表達，深入研究KD引起骨質(zhì)疏松的分子機制，為KD引起骨質(zhì)疏松提供預防思路。

綜上所述，本研究表明KD小鼠導致骨質(zhì)疏松的差異基因在多個細胞外組分與信號通路中富集，其中Acot1、Mpig6b、Ppbp為差異顯著基因，可能在KD引起的骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要作用。通路富集中以Apelin信號通路、PI3K-Akt信號通路、ECM受體互作信號通路富集程度顯著。本研究為KD引起骨質(zhì)疏松的分子機制研究提供理論和實驗依據(jù)，為預防KD導致骨質(zhì)疏松提供思路。