川渝地區(qū)塔羅科血橙新系炭疽病的病原鑒定及其遺傳多樣性分析

陳 泉,羊 煉,黃仁軍,馮小華,何錦輝

(1.重慶三峽農(nóng)業(yè)科學(xué)院,重慶 萬(wàn)州 404155;2.重慶市萬(wàn)州區(qū)植物保護(hù)與果樹(shù)技術(shù)推廣站,重慶 萬(wàn)州 404155)

【研究意義】柑橘是世界第一大水果,中國(guó)柑橘種植面積和產(chǎn)量均居全球第一。塔羅科血橙新系(Citrussinensiscv.Tarocco)屬晚熟甜橙類(lèi)柑橘[1]。近年來(lái),川渝兩地大力發(fā)展塔羅科血橙新系,成為我國(guó)塔羅科血橙新系的主產(chǎn)區(qū),種植規(guī)模達(dá)1.5×105hm2。柑橘炭疽病是世界性分布的真菌病害[2],遍布于高溫多濕的熱帶和亞熱帶柑橘產(chǎn)區(qū)[3]。在我國(guó),炭疽病在所有柑橘產(chǎn)區(qū)均有分布為害,在重慶、湖南、廣東、四川等地的柑橘尤其是甜橙上發(fā)生嚴(yán)重[4]。炭疽病發(fā)病后,柑橘葉片有圓形、不規(guī)則形或“V”字形病斑,中央淺灰褐色或灰白色,病部散生或輪紋狀排列黑色小粒點(diǎn),多雨高濕時(shí)產(chǎn)生肉紅色分生孢子,落葉嚴(yán)重,枝梢枯死,果實(shí)發(fā)病表現(xiàn)出干疤和淚痕,還會(huì)在采后導(dǎo)致全果腐爛[5-6]。條件適宜時(shí),炭疽病危害柑橘果實(shí)后可造成減產(chǎn)90%。因柑橘炭疽病在嫩葉、枝梢、花器和果實(shí)等部位都能發(fā)生,且在柑橘的生長(zhǎng)期、結(jié)果期、貯存期均可發(fā)病,因此較難防控[7],是限制川渝兩地塔羅科血橙新系產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。柑橘炭疽菌豐富的遺傳多樣性使菌種發(fā)生不同程度的遺傳變異,其對(duì)各種殺菌劑的抗性不同,是導(dǎo)致川渝地區(qū)近年柑橘炭疽病危害嚴(yán)重的重要原因?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】較早報(bào)道柑橘炭疽病原為膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz)和尖孢炭疽菌(ColletotrichumacutatumSimmonds)[8-9],2個(gè)種可用種特異性引物CgInt/ITS4和CaInt/ITS4區(qū)分[10],隨后首次發(fā)現(xiàn)了平頭炭疽菌(Colletotrichumtruncatum)。膠孢炭疽菌分布在我國(guó)各個(gè)省市,是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種群,易引起柑橘采后貯藏期的炭疽病,還會(huì)危害葉片和枝梢[3]。在我國(guó)早期的報(bào)道中,尖孢炭疽菌僅在云南瑞麗的萊檬上有發(fā)現(xiàn),引起萊檬炭疽,在其他柑橘類(lèi)型上只引起花后落果[3,11]。隨后在四川廣安的龍安柚(Citrusgrandisvar.longanyou)上發(fā)現(xiàn)一個(gè)致病性很強(qiáng)的橘紅色慢生型尖孢炭疽菌菌株,易引起采后果實(shí)腐爛[12]。平頭炭疽菌分離自云南和廣東,僅占總量的3.7%[3]。在與寄主植物長(zhǎng)期斗爭(zhēng)過(guò)程中,病原菌的群體結(jié)構(gòu)普遍會(huì)發(fā)生分化[13],對(duì)不同藥劑的抗藥性也不同。炭疽菌群體遺傳變異豐富,同一種的不同分離物之間差異很大[10]。目前,炭疽菌遺傳分類(lèi)多數(shù)采用多基因系統(tǒng)學(xué)結(jié)合形態(tài)學(xué)的方法[14],而ITS序列在炭疽菌屬分子系統(tǒng)學(xué)中已得到廣泛運(yùn)用。例如李娜[15]、王雪蓮[16]通過(guò)形態(tài)學(xué)和ITS序列分別將引起湖北和廣東柑橘炭疽病的病原鑒定為膠孢炭疽菌。隨著分子系統(tǒng)學(xué)研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)ITS不能有效用于近似種的識(shí)別[17-18],因此,更多基因逐漸被引入到炭疽菌的分類(lèi)中,有大量學(xué)者采用β-微管蛋白(TUB2)、谷氨酸合成酶(GS)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GDPH)、鈣調(diào)蛋白基因(CAL)、核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、肌動(dòng)蛋白基因(ACT)、幾丁質(zhì)合成酶基因(CHSΙ)及組蛋白基因(HIS3)等進(jìn)行炭疽菌分類(lèi)研究[19-23],并且發(fā)現(xiàn)部分菌株的遺傳分化與寄主和地理來(lái)源無(wú)關(guān)[24-25]。Domm等[26]通過(guò)形態(tài)學(xué)與ITS、TUB2、GDPH基因序列分析,將116個(gè)代表菌株分屬于7個(gè)類(lèi)群和1個(gè)獨(dú)立的種。Huang等[27]通過(guò)6個(gè)基因序列對(duì)中國(guó)柑橘屬和金橘屬植物上的312株炭疽菌進(jìn)行分析研究,鑒定出6個(gè)種,其中2個(gè)新種。Weir等[18]也用同樣的方法對(duì)400個(gè)膠孢炭疽復(fù)合種菌株進(jìn)行分析,區(qū)分出 22個(gè)種,其中8個(gè)新種,同時(shí)證明GDPH基因是膠孢炭疽復(fù)合種遺傳多樣性分析的有效基因。陳國(guó)慶[3]對(duì)我國(guó)浙江、江西、廣東、福建、湖南、重慶和云南等地的不同柑橘炭疽菌分析,發(fā)現(xiàn)GS、GDPH、Cal序列分析有效揭示了柑橘膠孢炭疽菌種下變異水平。謝桃明[28]將247株柑橘菌株用GDPH基因進(jìn)行鑒定,將供試炭疽菌分為6大類(lèi)。另外,在柿子、草莓、草本植物炭疽菌方面也有許多將形態(tài)學(xué)與多基因分子系統(tǒng)學(xué)結(jié)合進(jìn)行遺傳多樣性研究的報(bào)道[29-31]。【本研究切入點(diǎn)】關(guān)于柑橘炭疽病已有較多研究報(bào)道,但針對(duì)川渝兩地塔羅科血橙炭疽病的病原及其遺傳多樣性研究未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)采集川渝兩地塔羅科血橙新系病樣,進(jìn)行病原分離鑒定,選取廣泛用于炭疽菌遺傳分類(lèi)的GDPH和ITS基因分析炭疽菌的遺傳多樣性,以期為川渝兩地塔羅科血橙新系炭疽病的綠色高效防控和抗病品種選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019—2021年,在重慶萬(wàn)州、長(zhǎng)壽、開(kāi)州、奉節(jié)、云陽(yáng)、涪陵,四川資中、富順等地采集50份疑似柑橘炭疽病癥狀的塔羅科血橙新系葉片、枝條、果實(shí)樣品,并記錄發(fā)病癥狀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離純化 參考方中達(dá)[34]編著的《植病研究法》,單孢純化后,接種到PDA培養(yǎng)基斜面,25 ℃培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落后,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)鑒定 將分離純化的菌株于25 ℃下培養(yǎng)3～7 d,記錄菌落形態(tài)、顏色,統(tǒng)計(jì)平均生長(zhǎng)速率。OLYMPUS BX40光學(xué)顯微鏡觀察孢子大小,計(jì)算平均值。

1.2.3 直接PCR分子檢測(cè) 試驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1[2,15]。先采用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR測(cè)定,初步判定菌種是否為炭疽菌,然后采用種特異性引物Cglnt/Calnt測(cè)定炭疽菌種的種類(lèi)。PCR反應(yīng)體系:2×Taq PCR Master Mix 15 μL,上下游引物各0.5 μL,ddH2O 14 μL,菌絲少量。擴(kuò)增反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,44個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min,4 ℃保存。引物GDF1/GDR1采用降落PCR程序,反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 45 s,10個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)退火溫度下降1 ℃;變性95 ℃ 10 s,退火50 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 45 s,35個(gè)循環(huán);延伸72 ℃ 5 min,4 ℃保存。

1.2.4 致病性檢測(cè) 用75%酒精對(duì)塔羅科血橙新系的健康果實(shí)和保濕培養(yǎng)盒表面進(jìn)行殺菌處理。在果實(shí)最大橫徑部位選取3處用針刺傷(針刺5點(diǎn),均勻分布在直徑0.5 cm的圓內(nèi)),取直徑0.5 cm的菌塊,將菌絲面貼在果實(shí)傷口處,放入保濕培養(yǎng)盒,保持濕度95%以上,25 ℃培養(yǎng)7 d,以空白PDA作對(duì)照,記錄發(fā)病狀況。每種類(lèi)型菌株隨機(jī)選取2個(gè)菌株用于致病性檢測(cè),每個(gè)菌株接種3個(gè)果實(shí),重復(fù)3次。

1.2.5 序列分析 將ITS、GDPH的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后連接于pMD 18-T載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,每個(gè)菌株選擇3個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送上海生工生物測(cè)序、BLAST比對(duì)。分別將來(lái)自柑橘(登錄號(hào)HM575235.1、HM575241.1、HM575236.1、HM575249.1、AJ301988、AM947679)、柿子(登錄號(hào)AY791893、AY791894)、草莓(登錄號(hào)HM575266.1、HM5752 65.1)和草本植物(登錄號(hào)AY266373、AY266379、AY266382、AY266383)膠孢炭疽菌ITS基因序列與本研究測(cè)得的41個(gè)ITS基因序列(登錄號(hào)OL587950～OL587990),利用MEGA 4.0以鄰接法(Neighbor-Joining),bootstrap設(shè)置為1000,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。將來(lái)自柑橘(登錄號(hào)HM575284、HM575290.1、HM575285)、柿子(登錄號(hào)GU133383、GU133392、GU133397)和草莓(登錄號(hào)M93427、HM575315、HM575314.1)膠孢炭疽菌GDPH序列與本研究測(cè)得的40個(gè)GDPH序列(登錄號(hào)OP558430～OP558469),利用MEGA 4.0以鄰接法(Neighbor-Joining),bootstrap設(shè)置為1000,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表1 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及菌株形態(tài)

從50份樣品中分離到41個(gè)菌株,其中10個(gè)分離自重慶萬(wàn)州的樣品,5個(gè)分離自重慶長(zhǎng)壽的樣品,4個(gè)分離自重慶云陽(yáng)的樣品,5個(gè)分離自重慶開(kāi)州的樣品,4個(gè)分離自重慶涪陵的樣品,5個(gè)分離自重慶奉節(jié)的樣品,4個(gè)分離自四川富順的樣品,4個(gè)分離自四川資中的樣品。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、孢子形態(tài)等特征,可以將這些菌株劃分為4種類(lèi)型(圖1)。

Ⅰ型菌株菌絲顏色為淺粉色到白色,氣生菌絲較少,易產(chǎn)生大量擬菌核和橘紅色分生孢子堆,生長(zhǎng)速率0.7～0.8 cm/d,分生孢子一端尖,另一端鈍圓,大小為(14.7～16.7)μm×(4.9～5.6)μm,此類(lèi)菌株數(shù)量占分離菌株總數(shù)的73.17%,是主要類(lèi)型。

Ⅱ型菌株菌絲顏色為灰色至灰白色,菌絲茂密,菌絲表面不產(chǎn)擬菌核,培養(yǎng)基底部可觀察到擬菌核,生長(zhǎng)速率1.2～1.3 cm/d,易產(chǎn)生大量橘紅色分生孢子堆,分生孢子呈棍棒狀,兩端鈍圓,大小為(14.8～15.2)μm×(4.3～5.5)μm,此類(lèi)菌株數(shù)量占分離菌株總數(shù)的17.07%。

Ⅲ型菌株菌絲顏色為深灰色,菌絲茂密,生長(zhǎng)速率0.5～0.6 cm/d,色素分泌多,能產(chǎn)生大量的擬菌核和分生孢子堆,分生孢子呈長(zhǎng)棍棒狀,兩端鈍圓,大小為(14.8～16.5)μm×(4.3～5.2)μm,此類(lèi)菌株數(shù)量占分離菌株總數(shù)的4.88%。

Ⅳ型菌株菌絲顏色為青灰至灰黑色,生長(zhǎng)速率1.4～1.5 cm/d,沒(méi)有產(chǎn)生或少量產(chǎn)生擬菌核,沒(méi)有觀察到橘紅色分生孢子堆,分生孢子呈橢圓或梭形,兩端鈍圓,大小為(13.8～14.1)μm×(4.3～5.0)μm,此類(lèi)菌株數(shù)量占分離菌株總數(shù)的4.88%。

2.2 分子鑒定結(jié)果

測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示,ITS序列均與已報(bào)道的柑橘炭疽菌同源性達(dá)到99%以上,表明其為柑橘炭疽病菌。Cglnt/ITS4均能擴(kuò)增出500 bp左右的條帶,Calnt/ITS4則均無(wú)法擴(kuò)增到條帶,將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn),獲得序列與柑橘膠孢炭疽菌的ITS序列(AJ301988、AM947679)相似性達(dá)到99%以上,說(shuō)明分離到的柑橘炭疽菌均為膠孢炭疽菌,未分離到炭疽菌其他種。

2.3 致病性測(cè)定結(jié)果

選擇上述4種類(lèi)型共8個(gè)菌株分別接種到塔羅科血橙新系果實(shí)上,接種后7 d測(cè)量果實(shí)病斑直徑,比較不同類(lèi)型菌株的致病力差異。結(jié)果如表2、圖2所示:4種類(lèi)型的菌株在塔羅科血橙新系果實(shí)上的致病力存在差異。其中,Ⅰ型和Ⅳ型菌株接種后的果實(shí)發(fā)病率均為88.9%,Ⅰ型菌株接種后果實(shí)癥狀表現(xiàn)為病斑凹陷腐爛,病斑平均直徑為1.2 cm,而Ⅳ型菌株僅能形成平均直徑為0.6 cm的病斑;Ⅱ型和Ⅲ型菌株發(fā)病率均達(dá)到100%,其中Ⅱ型菌株刺傷接種后能形成典型的炭疽病斑,病斑呈深褐色,平均病斑直徑為1.7 cm,Ⅲ型菌株形成的病斑平均直徑為1.1 cm。對(duì)照表現(xiàn)不致病,僅觀察到1個(gè)愈合斑點(diǎn)。方差分析結(jié)果顯示,4個(gè)類(lèi)型菌株接種塔羅科血橙新系果實(shí)后形成的病斑平均直徑差異達(dá)到顯著水平(P<0.05),且Ⅱ型2個(gè)菌株(WZ-2和FS-41)與其他3個(gè)類(lèi)型共6個(gè)菌株的差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01),Ⅳ型2個(gè)菌株(WZ-15和FS-45)與其他3個(gè)類(lèi)型6個(gè)菌株的差異也達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。致病性測(cè)定結(jié)果還顯示,不同類(lèi)型菌株的致病性差異與菌株地理來(lái)源、分離部位無(wú)明顯相關(guān)性,不同地理來(lái)源和分離部位的菌株可能劃到同一類(lèi)菌株中,相同地理來(lái)源和分離部位的菌株也可能劃為不同菌株類(lèi)型。

A.菌絲正面;B.菌絲背面;C.分生孢子。

表2 不同菌株對(duì)塔羅科血橙新系果實(shí)的致病力測(cè)定

根據(jù)葉片發(fā)病癥狀分為2種類(lèi)型:第一類(lèi)癥狀表現(xiàn)為葉斑型,病斑一般沿葉緣或葉片中部發(fā)病,病斑橢圓形或不規(guī)則形,病斑直徑范圍在0.1～3.0 cm,以直徑0.5～2.0 cm的病斑居多,病健分界明顯,后期病斑中心呈白色紗布透明狀,病部散生或輪紋狀排列黑色小點(diǎn),多雨高濕條件下產(chǎn)生肉紅色粘質(zhì)物分生孢子(圖3-A,3-B);第二類(lèi)癥狀病斑為葉枯型,多在葉片尖端,呈“V”字型,病斑較大,直徑在1.0～4.0 cm,病斑后期易干枯或穿孔,多雨高濕時(shí)其上產(chǎn)生大量的肉紅色粘質(zhì)物和黑色小點(diǎn)(圖3-C,圖3-E～3F)。

圖2 不同類(lèi)型菌株接種塔羅科血橙新系果實(shí)表現(xiàn)

A～B.葉片炭疽病第一類(lèi)癥狀;C.葉片炭疽病第二類(lèi)癥狀;D.果實(shí)炭疽病第一類(lèi)癥狀;E.果實(shí)炭疽病第二類(lèi)癥狀;F.果實(shí)炭疽病第三類(lèi)癥狀。

果實(shí)發(fā)病癥狀也分為3種類(lèi)型:第一類(lèi)病斑為干疤型,病斑直徑范圍在0.2～2.0 cm,圓形或近圓形,黃褐色或褐色,微下陷,呈革質(zhì)狀,發(fā)病組織不深入果肉(圖3-D);第二類(lèi)為淚痕型,病斑形狀如眼淚,由許多紅褐色小凸點(diǎn)組成(圖3-E);第三類(lèi)為軟腐型,多在貯藏期發(fā)生,一般從果蒂部開(kāi)始,初期為淡褐色,以后變?yōu)樯詈稚癄€(圖3-F)。上述葉片和果實(shí)癥狀遇濕度大時(shí),病斑上均可形成橘紅色的分生孢子堆。

2.4 菌株的遺傳多樣性分析

ITS序列比對(duì)將供試菌株分為1個(gè)類(lèi)群(圖4)。41個(gè)菌株與來(lái)自柑橘、柿子、草莓和草本植物的膠孢炭疽菌均處于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的同一個(gè)大分支,說(shuō)明柑橘膠孢炭疽菌與這三類(lèi)寄主植物的膠孢炭疽菌遺傳距離較近,但根據(jù)ITS序列無(wú)法進(jìn)行膠孢炭疽菌種下遺傳變異的有效區(qū)分。根據(jù)聚類(lèi)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)柑橘膠孢炭疽菌的遺傳進(jìn)化與地理來(lái)源、分離部位沒(méi)有明顯相關(guān)性,不同地理來(lái)源和分離部位的菌株都被聚為同一類(lèi)群中。對(duì)比圖1和圖2,發(fā)現(xiàn)柑橘膠孢炭疽菌的遺傳進(jìn)化與菌株形態(tài)及致病力也沒(méi)有明顯相關(guān)性。

GDPH序列分析結(jié)果顯示(圖5),其菌株聚類(lèi)與基于ITS序列的分析結(jié)果不同,共分為4個(gè)類(lèi)群。與基于ITS序列聚類(lèi)結(jié)果相似,GDPH序列分析結(jié)果將來(lái)自各采樣點(diǎn)的29個(gè)菌株與陳國(guó)慶[3]報(bào)道的柑橘炭疽菌株HB-F01 (HM575284)和HY-UF03(HM575290.1)處于同一分支上,聚為GroupⅠ,為主要菌群;來(lái)自重慶涪陵、開(kāi)州、長(zhǎng)壽和四川資中的7個(gè)炭疽菌株與陳國(guó)慶[3]報(bào)道的柑橘炭疽菌株HB-F02(HM575285)聚在一起,為GroupⅡ;來(lái)自四川富順和資中的2個(gè)菌株(FS-G-42、ZZ-Y-56)單獨(dú)聚為GroupⅢ;而來(lái)自重慶萬(wàn)州和涪陵的2個(gè)菌株與來(lái)自柿子的炭疽菌株(GU133383、GU133392、GU133397)聚為GroupⅣ。而來(lái)自柿子的膠孢炭疽菌與試驗(yàn)菌株分離度較高,單獨(dú)聚為一類(lèi),說(shuō)明柿子膠孢炭疽菌與本研究菌株的遺傳距離較遠(yuǎn)。以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明柑橘膠孢炭疽菌遺傳變異與地理來(lái)源、分離部位沒(méi)有相關(guān)性。與圖1、圖2測(cè)定結(jié)果對(duì)比,基于GDPH基因序列的遺傳聚類(lèi)結(jié)果與基于形態(tài)學(xué)的分類(lèi)結(jié)果(圖1、表2)一致,I型菌株聚到GroupⅠ,Ⅱ型菌株聚到GroupⅡ,Ⅲ型菌株聚類(lèi)到GroupⅢ,Ⅳ型菌株聚類(lèi)到GroupⅣ,進(jìn)化樹(shù)中的4個(gè)Group與形態(tài)學(xué)和致病性測(cè)定結(jié)果劃分的4個(gè)類(lèi)型菌株組成大體一致,說(shuō)明不同Group菌株可能與其形態(tài)學(xué)和致病力相關(guān)。

圖4 根據(jù)ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討 論

柑橘炭疽病是一種為害柑橘生產(chǎn)的重要病害,在我國(guó)分布極其廣泛。膠孢炭疽菌、平頭炭疽菌和尖孢炭疽菌是引起柑橘炭疽病的主要原因,其中膠孢炭疽菌是最主要的類(lèi)型。本研究從川渝兩地50份塔羅科血橙新系疑似炭疽病樣品上分離到41個(gè)柑橘炭疽菌菌株,通過(guò)形態(tài)學(xué)和ITS序列分析,明確其都為柑橘膠孢炭疽菌。結(jié)果表明,膠孢炭疽菌是引起川渝兩地塔羅科血橙炭疽病的主要病原菌。

本研究將分離的柑橘膠孢炭疽菌菌株分為4個(gè)類(lèi)型,不同類(lèi)型的菌株形態(tài)特點(diǎn)和致病力存在差異,可能導(dǎo)致不同菌株的危害程度不同。因此,研究炭疽菌種內(nèi)分化,可為炭疽病病害診斷、病原鑒定、精準(zhǔn)高效防治和抗病品種選育提供理論依據(jù)。膠孢炭疽菌具有復(fù)合種和種群集合的特征,許多研究者也已經(jīng)證實(shí)扁桃[10]、桃子[10]、草莓[24,30,33]、柑橘[3,12,27]、荔枝[34]等寄主炭疽菌種間、種內(nèi)遺傳多樣性豐富。本研究發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型的膠孢炭疽菌株形態(tài)特點(diǎn)和致病力存在差異,說(shuō)明川渝地區(qū)柑橘膠孢炭疽菌菌株存在豐富的遺傳多樣性,這可能是由于柑橘膠孢炭疽菌種內(nèi)出現(xiàn)分化所致。

本研究采用ITS和GDPH兩個(gè)序列分析來(lái)進(jìn)行柑橘膠孢炭疽菌種內(nèi)分化研究,結(jié)合菌株的地理來(lái)源、分離部位、形態(tài)學(xué)特征及致病力等方面的分析,結(jié)果表明柑橘膠孢炭疽菌的種內(nèi)分化與地理來(lái)源、分離部位沒(méi)有明顯的相關(guān)性,這與劉開(kāi)啟等[24]、蒲占湑等[25]的研究結(jié)果一致,這可能是因?yàn)楦涕倌z孢炭疽菌有潛伏侵染特性,使同一種菌伴隨種苗、接穗等在不同地區(qū)進(jìn)行傳播。因此,嚴(yán)格種苗、接穗帶菌量檢測(cè),從源頭上控制炭疽病的傳播很關(guān)鍵。

本研究結(jié)果還表明基于ITS序列的遺傳聚類(lèi)結(jié)果對(duì)揭示柑橘膠孢炭疽菌種內(nèi)遺傳變異信息有局限性,這與Moriwaki等[17]的研究結(jié)果一致。值得注意的是,與ITS不同,GDPH序列分析結(jié)果證明柑橘膠孢炭疽菌的種內(nèi)分化與菌株形態(tài)特點(diǎn)、致病力有緊密關(guān)系,能獲得種內(nèi)更豐富的遺傳多樣性信息,說(shuō)明GDPH可能與菌株的遺傳變異相關(guān),但具體與哪一個(gè)或幾個(gè)形態(tài)構(gòu)成因素有關(guān),還需進(jìn)一步深入研究。

圖5 根據(jù)GDPH序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

4 結(jié) 論

本研究明確了川渝兩地塔羅科血橙炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌,并且菌株之間存在豐富的遺傳多樣性,且不同類(lèi)型的菌株形態(tài)特點(diǎn)和致病力存在明顯差異,為川渝兩地塔羅科血橙新系炭疽病的綠色高效防控和抗病品種選育提供一定的研究基礎(chǔ)。