青稞根邊緣細胞的發(fā)育特性及其對密花香薷揮發(fā)油脅迫的響應

周汐婕,肖云星,謝雨思,馬丹煒

(四川師范大學生命科學學院,成都 610101)

【研究意義】青藏高原獨特的“高”“寒”自然環(huán)境,形成了高寒草甸敏感脆弱的生態(tài)系統(tǒng)[1]。受到全球氣候變化、人類干擾以及過度放牧等因素的影響,青藏高原草地逐漸退化,毒雜草擴張,嚴重威脅了青藏高原農(nóng)作物的生長[2]。青稞(HordeumvulgareL.)因具有適應性廣、耐寒、抗逆能力強等特點,常被種植在海拔1400～4100 m的地方[3],是青藏高原地區(qū)極為重要的農(nóng)作物[4]。探究青稞面對毒雜草擴張采取的防御響應機制為青藏高原農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)農(nóng)作物的保產(chǎn)增產(chǎn)提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】化感作用是指植物通過淋溶、揮發(fā)、殘株分解等途徑向周圍環(huán)境釋放化感物質(zhì),從而對周圍植物或微生物造成有利或有害影響[5],其中負面影響被稱為化感脅迫[6]。類似于入侵植物的“新武器假說”,除了爭奪光照、水分、養(yǎng)分等資源競爭外,毒雜草例如黃花棘豆(Oxytropisochrocephala)、瑞香狼毒(Stellerachamaejasme)、黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)等會利用化感作用提高自身的競爭力[7]。根邊緣細胞(Root border cells, RBCs)由根冠分生組織發(fā)育形成,被程序化分離后聚集在根冠周圍,并與其分泌的粘液共同組成根胞外陷阱(Root extracellular traps,BETs)[8]。當受到包括化感作用在內(nèi)的外界脅迫時,BETs能吸附、中和土壤中的有毒物質(zhì),調(diào)節(jié)根際環(huán)境,保護根尖免遭傷害,是植物抵御土壤環(huán)境脅迫的的重要屏障[9]。植物產(chǎn)生的RBCs對外界刺激十分敏感,其數(shù)量因種類而異,大多數(shù)植物每天都會產(chǎn)生數(shù)千個具有特殊基因表達模式、代謝活躍的RBCs[10]。以往研究更關注化感物質(zhì)對受體植物RBCs防御功能以及周圍環(huán)境的干擾作用,而忽略受體植物RBCs對化感脅迫的防御響應[6, 11]。密花香薷(ElsholtziadensaBenth.)是唇形科(Labiatae)香薷屬(Elsholtzia)芳香類的多年生草本植物,含有豐富的揮發(fā)油[12],是青藏高原農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)常見的優(yōu)勢毒雜草[13],其水浸提液對受體植物具有顯著的化感抑制效應[14]。在密花香薷不斷擴張的同時,其揮發(fā)性化感物質(zhì)必定會通過土壤吸附、殘株腐解等途徑不斷進入土壤作用鄰近植物的根系[15]。而青稞RBCs為了保護根尖會作出怎樣的響應并未得到解決?！颈狙芯壳腥朦c】以密花香薷揮發(fā)油為供體,采用純瓊脂懸空氣培養(yǎng)法,在研究青稞RBCs發(fā)育特性的基礎上,探討青稞RBCs從細胞活性、粘膠層厚度、胞內(nèi)ROS水平變化以及細胞死亡類型等方面對不同濃度密花香薷揮發(fā)油的響應。【擬解決的關鍵問題】探討農(nóng)作物青稞RBCs面對密花香薷揮發(fā)油化感脅迫的響應機制,為青藏高原農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)農(nóng)作物的保產(chǎn)增產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及來源

供體植株密花香薷,2019年7月采于四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣阿西鄉(xiāng)(102°55.944′ E, 33°41.023′ N)的高寒草甸。該地海拔3470 m,屬高原寒溫帶濕潤季風氣候,常年無夏,無絕對無霜期[16]。青稞種子購于四川省甘孜藏族自治州道孚縣。泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK(20 mmol/L×0.02 mL)和活性氧檢測試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 揮發(fā)油母液的制備

將采集的成熟期密花香薷全株陰干后剪成1～2 cm的小段,采用水蒸氣蒸餾法提取密花香薷揮發(fā)油[17],經(jīng)無水 Na2SO4除水后置于棕色試劑瓶-20 ℃保存。取揮發(fā)油10 μL,用體積分數(shù)為25%的二甲基亞砜(DMSO)稀釋至100 μL得到0.1 μL/μL揮發(fā)油處理母液。

1.3 材料培養(yǎng)及處理

1.3.1 材料培養(yǎng) 挑選顆粒飽滿、大小均一的青稞種子,用0.5% KMnO4溶液消毒10 min,蒸餾水清洗6次后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱浸種12 h,轉(zhuǎn)移至鋪有濕潤雙層無菌紗布的瓷盤中繼續(xù)在25 ℃環(huán)境中無光照催芽24 h。待種子露白后,胚根朝外插入裝有0.8%質(zhì)量分數(shù)純瓊脂的培養(yǎng)瓶(容積200 mL、直徑9 cm、高8.5 cm)中無光照倒置培養(yǎng)[15]。

1.3.2 RBCs的收集 待青稞根長達到5、10、15、20、25、30、35、40、45和50 mm時,分別隨機剪取5 mm根尖10個,置于裝有100 μL ddH2O的離心管中,漩渦振蕩30 s,吸出細胞懸液,再用50 μL ddH2O沖洗根尖2次,收集細胞懸浮液并用微量進樣器(規(guī)格1000 μL)吸打3～4次,使成團的RBCs分離,制得細胞懸液[15]。

1.3.3 試驗處理 A組:分別吸取揮發(fā)油母液1、2、3、4和5 μL,用DMSO補充至5 μL配置成濃度為0.02、0.04、0.06、0.08 和0.10 μL/μL的處理液(記為T1、T2、T3、T4和T5,T5與揮發(fā)油處理母液的濃度一致)。加入200 μL根長為40 mm時制得的細胞懸液(此時RBCs數(shù)量達到峰值,活性較高)并混勻。以5 μL 25%體積分數(shù)的 DMSO為溶劑對照,以5 μL PBS溶液為陰性對照(記為Control),所有處理均置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)30 min,每個處理重復6次。B組:分別將5 μL PBS溶液(Control)、5 μL揮發(fā)油處理母液、5 μL揮發(fā)油處理母液+泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK(終濃度為10 μmol/L)(記為Mixture)加入裝有200 μL細胞懸液的離心管中,混勻并置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)30 min,每處理重復6次。處理結束后,用蒸餾水漂洗 2 次進行指標測定。

1.4 指標測定

1.4.1 RBCs原位觀察 隨機取1個長度約為4.0 cm的根尖置于載玻片上,在根尖上滴1滴蒸餾水,將根冠浸入水中數(shù)秒后滴1滴吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)染液,室溫下避光染色3 min,用Nikon ECLIPSE 55i熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.4.2 RBCs形態(tài)觀察和數(shù)量測定 在載玻片上滴1滴細胞懸液,用0.1%質(zhì)量分數(shù)的番紅溶液染色,再用測微尺測定細胞大小,每個細胞長度和寬度各測定3次,測定每種形態(tài)的細胞各10個。參考Kubo等[18]的方法,取10 μL細胞懸液于細胞計數(shù)板上,滴加5 μL 1%體積分數(shù)的臺盼藍染液,均勻混合后室溫避光染色5 min,立即在Nikon ECLIPSE 55i顯微鏡下計數(shù)觀察并統(tǒng)計細胞存活率,染成藍色的為死細胞,未著色的為活細胞。每個處理重復8次。計算細胞數(shù)量:

細胞個數(shù)/mL=N/4×104×稀釋倍數(shù)

式中,N為4個16格細胞總數(shù)。

1.4.3 RBCs粘膠層厚度測定 參考Ropitaux等[19]的方法,取細胞懸液8 μL,加入8 μL印度墨水均勻混合后染10 min,用Nikon ECLIPSE 55i顯微鏡在明場下40 ×觀察并拍照測量粘膠層厚度。每處理測5個細胞,每個細胞測6個不同位置。

1.4.4 RBCs活性測定 參考Singh等[20]的方法,取細胞懸液20 μL加入離心管中,滴加8 μL AO/EB混合染液并混勻,染色2 min。LEICA DM300熒光顯微鏡下觀察并拍照。每個處理重復5次。橘紅色為死細胞,綠色為活細胞。統(tǒng)計死亡細胞的數(shù)量和細胞總數(shù),計算RBCs存活率:

RBCs存活率=活細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%

1.4.5 RBCs內(nèi)ROS含量測定 按照上海碧云天生物科技有限公司的ROS檢測試劑盒操作說明,用多功能細胞分析儀(SpectraMax M2,Molecular Devices,美國)在激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為525 nm下測定ROS相對熒光值[15]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用 SPSS 20.0對相關指標進行單因素方差分析(One-way ANOVA) 和Tukey 檢驗多重比較(LSD)。數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 青稞RBCs的發(fā)育特性

2.1.1 青稞RBCs的形態(tài)特征 青稞RBCs圍繞根尖釋放,形成RBCs群保護層(圖1-A);青稞的RBCs呈弧形(圖1-B)、橢圓形(圖1-C)和桿形(圖1-D),其中橢圓形細胞長30～50 μm,寬16～30 μm;弧形細胞長40～90 μm,寬15～30 μm,桿形細胞長40～120 μm,寬10～30 μm。

每組處理進行8個重復。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。不同小寫字母表示Tukey 檢驗多重比較(LSD)下不同處理組之間在 95%水平上差異顯著。下同。

2.1.2 青稞RBCs的數(shù)量特征 從圖2可知,在根長5～50 mm,隨著根長增加,青稞RBCs數(shù)量逐漸增加;當青稞根長為40 mm時,RBCs數(shù)量達到最高,約為1263個,此時RBCs數(shù)量為根長5 mm時的2.37倍。隨著根長增加,RBCs數(shù)量逐漸下降。不同根長之間的RBCs存活率無顯著差異(P>0.05),存活率均維持在90%以上。

2.2 青稞RBCs對密花香薷揮發(fā)油的響應

2.2.1 密花香薷揮發(fā)性油處理下青稞RBCs粘膠層厚度的變化 本研究的溶劑對照組和陰性對照組的粘膠層厚度等各種指標均無顯著差異(P>0.05),排除溶劑DMSO對RBCs的影響。與對照相比,除最低濃度T1(0.02 μL/μL)之外,其余揮發(fā)油處理組均存在顯著差異(P<0.05)。隨著密花香薷揮發(fā)油濃度增大,RBCs粘膠層逐漸增厚(圖3)。在最大處理濃度T5(0.1 μL/μL)下,密花香薷揮發(fā)油處理后的RBCs粘膠層厚度為對照組的2.64倍。密花香薷揮發(fā)性物質(zhì)對青稞粘膠層RBCs有增厚效應。

2.2.2 密花香薷揮發(fā)油處理下青稞RBCs活性的變化 經(jīng) AO/EB 染色后,與對照組相比,經(jīng)過密花香薷揮發(fā)油處理的青稞RBCs呈現(xiàn)淺橘紅色熒光,細胞核呈現(xiàn)橘紅色熒光亮斑,甚至部分細胞核已經(jīng)裂解(圖4-A),表明RBCs活性喪失,揮發(fā)油誘導了RBCs凋亡。不同揮發(fā)油處理組的細胞活性均與對照組呈顯著差異(P<0.05),在最大濃度T5(0.1 μL/μL)處理下,細胞活性僅為對照組的40.17%,這說明密花香薷揮發(fā)油處理下,青稞RBCs活性下降且表現(xiàn)出明顯的濃度依賴(圖4-B)。

2.2.3 密花香薷揮發(fā)性物質(zhì)處理下青稞RBCs內(nèi)ROS含量的變化 隨著密花香薷揮發(fā)油濃度增高,青稞RBCs內(nèi)ROS含量呈上升—下降—上升趨勢,均與對照組呈顯著差異(P<0.05,圖5)。ROS相對熒光值在T3濃度(0.06 μL/μL)處理下達到峰值(2.23)。隨著揮發(fā)油濃度增高,細胞活性不斷減低可以推斷,青稞RBCs在密花香薷揮發(fā)油誘導下發(fā)生了氧化損傷,進而導致細胞凋亡。

A為揮發(fā)油作用下青稞RBCs及其粘膠層顯微圖;B為RBCs粘膠層厚度變化趨勢圖。圖A中白色箭頭所指的包裹在細胞周圍的膠狀物質(zhì)為粘膠層。每組處理進行5個重復。

A為揮發(fā)油作用下的青稞RBCs的熒光顯微圖,綠色代表活細胞,橙紅色表示細胞出現(xiàn)死亡特征;B表示RBCs活性的變化。每組處理進行5個重復。

每組處理進行6個重復。

當揮發(fā)油與泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK共同處理RBCs時,揮發(fā)油對RBCs的致死效應有所緩解(圖6),與未使用Z-VAD-FMK相比,細胞活性升高17.3%,進一步證實了密花香薷化感作用誘導的青稞RBCs死亡類型為凋亡。

3 討 論

3.1 青稞RBCs的發(fā)育特性

高等植物RBCs的形狀、數(shù)量、活性受到植物種類、根尖分生組織類型等多種因素影響[21]。姜華等[22]發(fā)現(xiàn)綠豆(Vignaradiata)RBCs在發(fā)育初期呈球形,后隨著根伸長在根的不同位置出現(xiàn)3種不同形態(tài):橢圓形、長橢圓形和長條形。亞麻(Linumusitatissimum)釋放的RBCs呈球形、絲狀和細長型[23],豌豆(Pisumsativum)的RBCs除部分為圓形外,大多數(shù)適度彎曲呈弧形[24]。本研究中,青稞RBCs的形態(tài)呈圓形、弧形以及桿形。煙草(Nicotianatabacum)每天產(chǎn)生十幾個RBCs[21],茄科植物約為100個[25],棉花 (Gossypiumhirsutum)則高達上萬個[26]。本研究中,青稞RBCs在根長5～40 mm,隨著根長增加,其數(shù)量逐漸增加,當根長為40 mm時,RBCs的數(shù)量達到最高,約為1263個,之后隨著根長增加,RBCs數(shù)量逐漸下降,這些差異可能與RBCs發(fā)育相關的基因特異性表達有關[27]。

每組處理進行5個重復。

目前,有關化感作用對受體植物生長發(fā)育的形態(tài)指標觀測以及生理過程變化的研究大多屬于表觀現(xiàn)象,而一切生命關鍵問題都要從細胞中尋找[6]。化感作用是復雜的自然現(xiàn)象,受體植物對化感脅迫所表現(xiàn)的敏感性和耐受性也涉及復雜的反應過程[11]。由多細胞構成的高等植物,其生命活動受不同細胞協(xié)調(diào)和制約。因此以單細胞模式系統(tǒng)作為化感作用的靶標,更能夠直觀地洞察到化感作用這一自然現(xiàn)象的本質(zhì)[6]。自然條件下,植物揮發(fā)性化感物質(zhì)既可以通過空氣直接作用于受體植物,也可以借雨霧淋溶進入土壤作用于鄰近受體植物[28]。雖然土壤能在一定程度上削弱化感物質(zhì)的影響,以土壤為基質(zhì)的試驗更能貼近自然狀況,但有研究表明苘麻(Abutilontheophrasti)揮發(fā)油通過空氣、浸水濾紙和土壤3種載體都能在不同程度下抑制小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)和大豆(Glycinemax)種子的萌發(fā)和幼苗的生長[29]。同時,植物RBCs代謝旺盛,可在體外保持活力數(shù)月,甚至可以進行細胞分裂。將豆類、谷物和棉花(G.herbaceum)等植物的根尖浸入蒸餾水后,RBCs便可自動釋放到水體中,取材方便、經(jīng)濟且RBCs對外界刺激十分敏感[10]。因此,RBCs逐漸被作為一種方便的模式系統(tǒng)應用到植物逆境脅迫的研究中。本研究中,青稞不同根長的RBCs存活率仍維持在90%以上,存活率高于水稻(Oryzasativa)、綠豆等其他植物的RBCs[22],適合作為受體繼續(xù)開展植物RBCs化感脅迫的研究。

3.2 青稞RBCs對密花香薷揮發(fā)油脅迫處理的響應

RBCs及其BETs是根系與土壤之間的一道生物屏障[15]。當植物受到化感脅迫時,在早期時會激活體內(nèi)防御相關的反應,包括對化感物質(zhì)的直接防御[30]和吸引有益微生物的間接防御[31]。許多植物的RBCs都能直接對外來的化感脅迫做出差異性響應。葡萄(VitisviniferaL.)根產(chǎn)生的自毒物質(zhì)ρ-對羥基苯甲酸可增加RBCs數(shù)量,促進次生代謝物質(zhì)和水楊酸積累,以激活葡萄抗氧化系統(tǒng)來緩解脅迫[32]。在土荊芥(ChenopodiumambrosioidesL.)等3種入侵雜草水浸提液的作用下,苦蕎麥(FagopyrumtataricumL.)RBCs粘膠層厚度增加,細胞內(nèi)ROS、NO水平升高,線粒體膜電位下降,細胞活性降低甚至死亡[33]。本研究中,在密花香薷揮發(fā)油脅迫下,青稞RBCs粘膠層隨濃度升高而增厚,細胞活性持續(xù)降低,細胞內(nèi)ROS水平顯著升高。當植物遭受逆境脅迫時,因線粒體功能失調(diào)而產(chǎn)生過量的ROS,一旦ROS超過細胞清除ROS的限度,就會發(fā)生氧化損傷,產(chǎn)生過量的氧化蛋白,細胞器受損[34]。另一方面,ROS可作為信號分子啟動自噬過程,通過吞噬和降解氧化物和受損細胞器,緩解由ROS帶來的氧化損傷[35]。除此以外,ROS 還可作為信號分子刺激、誘導細胞凋亡,再由死亡的細胞及其周圍粘液吸附化感物質(zhì),并通過BETs阻滯化感物質(zhì)進入根尖分生區(qū),抵御其毒害效應,保護根系健康生長[15, 36]。本研究中的青稞在面對密花香薷揮發(fā)油的脅迫處理時可能采取了類似的應對策略。

當揮發(fā)油與泛Caspase抑制劑共同作用時,由揮發(fā)油引起的細胞活性降低的現(xiàn)象得以緩解,表明密花香薷化感揮發(fā)物質(zhì)誘導了青稞RBCs的氧化損傷,最終引起RBCs發(fā)生Caspase依賴性的細胞凋亡。熒光染色的細胞結構特征也證明了這一論斷。由此可見,青稞RBCs為應對密花香薷揮發(fā)油的脅迫,通過分泌粘液物質(zhì)增厚粘膠層,并釋放ROS以促進細胞凋亡,增強由RBCs及其BETs形成的生物屏障,從而進一步阻滯化感物質(zhì)侵入根尖分生區(qū)。除此以外,RBCs還可以通過增加RBCs數(shù)量,降低根細胞中ROS水平和MDA含量來緩解化感脅迫對植物的傷害[37]。已有研究表明,水稻[38]、萵苣(Erodiumcicutarium)[39]等植物釋放的具有化感作用的揮發(fā)物絕大多數(shù)是萜類化合物,而密花香薷揮發(fā)油的化感主效成分則需要進一步研究確定。

4 結 論

青稞RBCs呈圓形、弧形以及桿形,且數(shù)量大、活性高,適合作為受體繼續(xù)開展植物RBCs化感脅迫研究。隨著揮發(fā)油濃度增加,青稞RBCs粘膠層顯著增厚,細胞活性逐漸下降,細胞內(nèi)ROS水平顯著升高,當揮發(fā)油和泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK共同作用時,由揮發(fā)油引起的細胞活性降低現(xiàn)象得以緩解。由此推測,青稞RBCs受到密花香薷揮發(fā)油脅迫后,通過增厚粘膠層抵御外界脅迫侵害,接著產(chǎn)生 ROS誘導細胞凋亡,從而緩解化感毒性。