野山杏總黃酮對LPS誘導(dǎo)雞肝炎的影響

束佳敏,郭元印,衛(wèi)丁一,劉浩然,依斯馬依力,黃 磊,何子涵,姚 剛,戴小華

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】野山杏(Armeniacasibirica(L.)Lam.)屬薔薇目、薔薇科李屬亞喬木植物,主要分布于新疆、山西等西部地區(qū)[1]。野山杏中含有氨基酸、多糖、黃酮類化合物等多種成分[2-4]。野山杏具有抑菌、抗病毒、抗感染、保肝、降血脂及抗氧化等作用[5-10]。通過提取分離純化野山杏總黃酮,分析其對LPS誘導(dǎo)雞肝炎的影響,對豐富野山杏藥效學(xué)價值并為畜禽抗炎藥物的開發(fā)有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有研究[11]采用RP-HPLC法分析了新疆野山杏果肉中的原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素等4種黃酮類化合物。谷虹霏等[12]研究表明,野山杏總黃酮可顯著延長小鼠疼痛反應(yīng)痛域,減輕局部疼痛反應(yīng),具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。戴小華等[13]發(fā)現(xiàn)野山杏總黃酮對腫脹反應(yīng)和毛細(xì)血管通透性增加有顯著的抑制作用,對腫脹和滲出等局部急性炎癥有一定的抑制作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】阿依姑麗等[14]發(fā)現(xiàn)野山杏總黃酮可降低高血脂大鼠的血脂,減少肝臟損傷,抑制肝臟脂質(zhì)過氧化過程并具有一定的劑量依賴性。需分析野山杏總黃酮對LPS誘導(dǎo)雞肝炎的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過LPS誘導(dǎo)雞肝炎模型,測定雞體溫、體重變化和血液學(xué)參數(shù)及血液生化指標(biāo),分析雞肝臟病理變化及野山杏總黃酮對雞肝炎的影響,為畜禽養(yǎng)殖業(yè)過程中發(fā)生的急性炎癥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 野山杏

野山杏干燥果肉(購自新疆哈密伊吾縣天葦生物科技有限公司),LPS脂多糖(L2880,Sigma)、蘆丁(B20771,上海源葉生物科技有限公司)、吲哚美辛(R018115,羅恩試劑)、大孔吸附樹脂(D101,陜西博暉生化科技有限公司)、伊紅染液(Servicebio G1001,武漢賽維爾生物科技有限公司 )、蘇木素染液(Servicebio G1004,武漢賽維爾生物科技有限公司);黃羽肉雞購自天康生物股份有限公司。

1.1.2 主要儀器

蘭格恒流泵(BT00-300T,河北省保定蘭格);全自動血細(xì)胞分析儀(PE-6800,深圳市普康電子有限公司);尼康顯微鏡(712900,尼康儀器上海有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

90只14日齡黃羽肉雞,平均體重為(192.73±2.61) g,將90只黃羽肉雞隨機(jī)分為6組,每組15只,分別為空白對照(生理鹽水組)、模型組(LPS組5 mg/kg LPS)、陽性對照組(吲哚美辛組1 mg/kg)、野山杏總黃酮低劑量組(50 mg/kg)、野山杏總黃酮中劑量組(100 mg/kg)、野山杏總黃酮高劑量組(200 mg/kg),劑量組和陽性對照組組氣管滴注;空白對照組按照等量無菌生理鹽水腹腔注射,試驗(yàn)進(jìn)行7 d。

飼養(yǎng)條件:清潔級動物房,室溫保持在27℃至29℃,自由飲水飲食,給予標(biāo)準(zhǔn)動物飼料。各實(shí)驗(yàn)組在同棟雞舍常規(guī)飼養(yǎng),在雛雞入雞舍前,雞舍用福爾馬林熏蒸消毒。飼養(yǎng)管理按照《肉雞飼養(yǎng)管理手冊》執(zhí)行。

1.2.2 測定指標(biāo)

1.2.2.1 野山杏總黃酮

野山杏粉碎后,經(jīng)超聲、離心、抽濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得野山杏總黃酮粗提物,經(jīng)D101大孔樹脂進(jìn)行分離純化得野山杏總黃酮純提物,可冷凍干燥備用;以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品、亞硝酸鈉溶液、硝酸鋁溶液、氫氧化鈉、60%乙醇等匯制標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定總黃酮含量。

1.2.2.2 體溫、體重

每日觀察黃羽肉雞的精神狀態(tài),測量體溫、體重等基本生理指標(biāo);每日上午10:00開始,以0、1、2、3、4、8、12和24 h測量每組每只雞直腸部位的體溫;稱量每組每只雞體重。

1.2.2.3 血常規(guī)參數(shù)及血液生化指標(biāo)

黃羽肉雞經(jīng)LPS誘導(dǎo)24 h后,進(jìn)行翅下靜脈采血,收集血樣,采用全自動血細(xì)胞分析儀對全血中的白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞數(shù)(LYM#)、中間細(xì)胞數(shù)(MID#)、中性粒細(xì)胞數(shù)(GRAN#)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、紅細(xì)胞比容(HCT%)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞分布寬度SD(RDW-SD)、紅細(xì)胞分布寬度CV(RDW-CV)、血紅蛋白含量(MCH)、血紅蛋白(HGB)、血紅蛋白濃度(MCHC)等12項(xiàng)血常規(guī)參數(shù)進(jìn)行檢測;采用ELASA試劑盒對血清中的ALT、AST兩種血液生化指標(biāo)進(jìn)行分析。

1.2.2.4 肝臟病理切片

LPS誘導(dǎo)24 h后,采集完血樣后屠宰解剖,統(tǒng)一選取右側(cè)肝臟制作石蠟切片,顯微鏡400倍進(jìn)行觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 野山杏總黃酮對LPS誘導(dǎo)雞肝炎體溫影響

研究表明,從1 h時開始野山杏各劑量組對LPS導(dǎo)致的體溫升高具有下調(diào)作用,1 h時低劑量組作用極顯著(P<0.01),2 h時低、中劑量組亦能極顯著下調(diào)體溫,3、4 h各劑量組均能極顯著下調(diào)體溫(P<0.01),8、12、24 h對體溫的改變程度不同(P<0.01,P<0.05)。圖1

注:#表示模型組與空白對照組比較,*表示實(shí)驗(yàn)組與模型組比較,△表示陽性對照組與模型組比較,P<0.05表示差異顯著(單符號),P<0.01表示差異極顯著(雙符號),下同

2.2 野山杏總黃酮對LPS誘導(dǎo)雞肝炎體重影響

研究表明,野山杏總黃酮各劑量組對體重變化影響極顯著(P<0.01)。與模型組相比,體重變化有所提高,隨著劑量增加體重隨之增加。圖2

圖2 野山杏總黃酮下LPS誘導(dǎo)雞肝炎體重變化

2.3 野山杏總黃酮對LPS誘導(dǎo)雞肝炎血常規(guī)指標(biāo)影響

研究表明,與炎癥相關(guān)的白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、中間細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)均有變化。野山杏總黃酮各劑量組均可顯著或極顯著(P<0.05,P<0.01)逆轉(zhuǎn)LPS導(dǎo)致的炎性細(xì)胞增多,且對白細(xì)胞總數(shù)、中間細(xì)胞數(shù)的恢復(fù)存在劑量依賴性。表1

表1 野山杏總黃酮對雞血常規(guī)檢測(±SE,n=15)

Tab.1 Routine detection of total flavonoids of Apricot apricot in chicken blood

表1 野山杏總黃酮對雞血常規(guī)檢測(±SE,n=15)

指標(biāo)Indicators空白對照組Blank control group模型組Model group低劑量組Low dose group 中劑量組Dose group 高劑量組High dose group陽性對照組Positive group白細(xì)胞總數(shù)Total leucocyte count (109/L)89.81±3.05114.94±1.27##86.54±1.40??83.38±2.88??81.57±1.70??83.37±2.83△△淋巴細(xì)胞數(shù)Lymphocyte count (109/L)73.08±2.6382.73±3.10##68.93±1.23??69.73±3.26??68.57±1.34??68.42±2.37△△中間細(xì)胞數(shù)Intermediate cell number (109/L)7.13±0.288.41±0.25##7.71±0.20?6.99±0.23??6.60±0.24??6.61±0.28△△粒細(xì)胞數(shù)Granulocyte count (109/L)7.50±0.3010.59±0.79##8.88±0.50?6.69±0.45??7.38±0.46??7.61±0.39△△紅細(xì)胞數(shù)Red blood cell count (1012/L)2.03±0.102.42±0.10##2.56±0.042.41±0.081.82±0.11??2.34±0.08紅細(xì)胞壓積Hematocrit (%)26.93±1.2431.53±1.73##32.08±0.4330.14±0.8423.15±1.27??29.55±1.16紅細(xì)胞平均體積Mean erythrocyte volume (fL)132.53±1.33124.79±0.84##126.18±0.77127.46±1.31130.78±1.07??126.46±1.16紅細(xì)胞分布寬度SDRed cell distribution width SD (%)41.02±0.7136.43±0.31##36.63±0.6936.54±0.6538.29±0.74?36.64±0.50紅細(xì)胞分布寬度CVRed cell distribution width CV (%)10.89±0.2110.15±0.07##10.09±0.159.97±0.1510.22±0.259.91±0.22血紅蛋白含量Hemoglobin content (pg)68.63±1.7156.73±0.50##60.56±1.0864.73±2.54??78.25±4.17??60.16±1.09血紅蛋白Hemoglobin(g/L)151.15±4.54139.64±3.33#155.14±2.52??152.86±3.20??150.79±3.19?144.45±5.85血紅蛋白濃度Hemoglobin concentration (g/L)518.31±11.00455.60±4.85##480.57±8.19504.15±9.62??604.18±29.24??474.15±7.50

2.4 野山杏總黃酮對LPS誘導(dǎo)雞肝炎血液生化指標(biāo)影響

研究表明,野山杏總黃酮各劑量組均能降低LPS導(dǎo)致的ALT、AST水平升高,尤其極顯著(P<0.01)降低ALT的活性,但對AST的影響程度弱于ALT,野山杏總黃酮各劑量組對兩者的影響還存在劑量依賴性。圖3,圖4

圖3 野山杏總黃酮下LPS誘導(dǎo)雞肝炎ALT含量變化

圖4 野山杏總黃酮下LPS誘導(dǎo)雞肝炎AST含量變化

2.5 野山杏總黃酮對LPS誘導(dǎo)雞肝炎肝臟組織結(jié)構(gòu)影響

研究表明,空白對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰;經(jīng)LPS誘導(dǎo)后,雞肝臟出現(xiàn)損傷,模型組炎性細(xì)胞增生,巨噬細(xì)胞聚集,中央靜脈有炎性細(xì)胞浸潤,肝小葉輪廓不清晰;野山杏各劑量組對肝小葉的損傷有一定的改善作用,中央靜脈中炎性細(xì)胞浸潤減少,巨噬細(xì)胞聚集減少;尤其高劑量組改善效果較好,中央靜脈清晰可見,炎性細(xì)胞浸潤明顯減少;陽性對照組改善效果最好,肝板排列清晰,炎性細(xì)胞侵潤較少。圖5

注:A:空白對照組,B:模型組,C: 低劑量組,D: 中劑量組,E: 高劑量組,F:陽性對照組,所指為中央靜脈,↑所指為炎性細(xì)胞,△所指為巨噬細(xì)胞

3 討 論

管曉輝等[15]研究發(fā)現(xiàn),多毛橐吾總黃酮可以抑制NF-κB信號途徑的活化,具有顯著的抗炎效果;周康盛等[16]報道了黃花棘豆所含的黃酮類化合物具有抗乙型肝炎病毒的生物活性;趙興輝等[17]研究表明,鐮形棘豆總黃酮可改善乙肝大鼠肝組織損傷,可抑制肝纖維化并保護(hù)肝功能;雷斯瑀等[18]發(fā)現(xiàn)趕黃草總黃酮對酒精性肝損傷有較好的治療作用;劉舒凌等[19]分析得出,餓螞蝗總黃酮具有抗鴨乙型病毒性肝炎作用;李曉東等[20]發(fā)現(xiàn)山楂葉總黃酮可減輕氧化反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷和肝組織炎癥,可防止非酒精性脂肪性肝炎的進(jìn)展。LPS為細(xì)菌內(nèi)毒素,可引發(fā)細(xì)菌感染、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管病、腎功能衰竭、內(nèi)毒素敗血癥等全身性炎癥性疾病[21],常被用作刺激因子調(diào)控IL-6、IL-1β等相關(guān)炎性因子的表達(dá),構(gòu)成炎癥模型[22]。LPS誘導(dǎo)后,動物機(jī)體的精神狀態(tài)及各項(xiàng)生理指標(biāo)均會發(fā)生變化,如體溫升高、消瘦、食欲不振等臨床特征[23]。研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)雞肝炎后,雞出現(xiàn)精神不振、食欲不佳等現(xiàn)象;結(jié)果表明,經(jīng)LPS誘導(dǎo)后,體溫會升高,但不同時間對體溫的影響程度不同,即野山杏總黃酮能夠使體溫下調(diào)至正常體溫(0 h),可緩解LPS誘導(dǎo)的體溫升高。通過對比灌胃前、后的體重變化發(fā)現(xiàn),腹腔注射LPS會導(dǎo)致雞的體重增加減慢,但野山杏各劑量組增加了炎癥條件下黃羽肉雞的體重,對炎癥造成的體重減輕有一定的緩解作用,對雞生長有一定促進(jìn)作用。

血常規(guī)中白細(xì)胞相關(guān)參數(shù)可以判斷機(jī)體是否存在炎癥,紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)可以判斷機(jī)體是否有貧血情況[24]。有研究表明[25]血紅細(xì)胞指標(biāo)的變化與肝損傷程度有關(guān)。研究結(jié)果表明,野山杏總黃酮不僅能緩解LPS誘導(dǎo)的炎癥,同時可緩解LPS引起的潛在貧血。

肝炎會導(dǎo)致血清ALT、AST含量升高,這與肝損傷的程度呈正相關(guān),ALT、AST含量是檢測肝損傷最敏感的指標(biāo)[26]。ALT升高反映肝細(xì)胞質(zhì)受損,AST升高說明肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損。通常肝細(xì)胞受損時,ALT先釋放進(jìn)入血液,當(dāng)肝細(xì)胞損傷危害到線粒體時,AST也會釋放進(jìn)入血液。當(dāng)AST顯著高于ALT時,提示病變的慢性化和進(jìn)展性[27]。野山杏總黃酮對雞肝損傷具有保護(hù)作用,其中高劑量組抑制效果最佳;野山杏總黃酮對肝組織病變有明顯的改善,使肝小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù),炎性體細(xì)胞浸潤得到抑制,肝細(xì)胞形態(tài)和排列基本恢復(fù),野山杏總黃酮能改善LPS引起的雞肝組織病理損傷,對家禽養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的急性炎癥有一定的緩解和改善作用。

4 結(jié) 論

野山杏總黃酮各劑量組均促進(jìn)雞的生長發(fā)育,抗炎效果與吲哚美辛作用相似,LPS誘導(dǎo)的炎癥模型建立成功,野山杏總黃酮各劑量組均對肝炎具有良好的療效,其中劑量在100～200 mg/kg范圍內(nèi)時可顯著改善肝損傷。