乳酸對(duì)成骨樣細(xì)胞成骨表型及堿性磷酸酶基因表達(dá)的影響研究

劉艷軍 徐永平 李淑英 羅祥林 陳元維*

1. 太原工業(yè)學(xué)院材料工程系,山西 太原 030008

2. 大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司博士后工作站,遼寧 大連 116600

3. 大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116600

4. 四川大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)院,四川 成都 610065

由于具有良好的生物可降解性和生物相容性,聚乳酸組織工程支架廣泛應(yīng)用于骨缺損修復(fù)[1-3]。聚乳酸在體內(nèi)通過(guò)酶解和水解最終生成乳酸,這是糖的一種代謝產(chǎn)物[4]。然而,在臨床應(yīng)用過(guò)程中,部分植入聚乳酸支架的患者出現(xiàn)無(wú)菌性炎癥或骨溶解,可能原因是聚乳酸在體內(nèi)降解引起微環(huán)境改變,抑制成骨細(xì)胞發(fā)揮功能,影響破骨細(xì)胞功能[5-7]。為了探究聚乳酸降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境的影響,已有研究利用乳酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH來(lái)探究乳酸對(duì)細(xì)胞增殖活性和成骨表型的影響,發(fā)現(xiàn)隨著乳酸濃度增加(pH從7.4至6.8),乳酸對(duì)細(xì)胞增殖活性和成骨分化能力抑制作用增強(qiáng)[8]。研究表明,植入體內(nèi)的聚乳酸支架降解產(chǎn)生大量乳酸,乳酸累積使微環(huán)境pH降至6以下[9-11]。He等[12]在體外研究乳酸的細(xì)胞毒性,并探究其對(duì)細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響,結(jié)果表明隨著乳酸濃度增加(pH從7.4至5.5),其細(xì)胞毒性增大,細(xì)胞堿性磷酸酶活性降低。馮婷婷等[13]探究聚乳酸降解終產(chǎn)物乳酸對(duì)成骨樣細(xì)胞增殖和成骨表型的影響,結(jié)果表明乳酸濃度增加(pH從7.4至5.5)會(huì)抑制細(xì)胞增殖能力,而低濃度乳酸(4 mmol/L)對(duì)細(xì)胞堿性磷酸酶活性和形成鈣結(jié)節(jié)能力無(wú)影響,但高濃度乳酸對(duì)于細(xì)胞成骨表型的影響并未研究。此外,乳酸對(duì)I型膠原和骨鈣素等成骨表型關(guān)鍵標(biāo)志物的影響也未研究,因此聚乳酸降解終產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞成骨礦化影響的機(jī)理尚不明確。

本研究利用聚乳酸降解終產(chǎn)物乳酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH,模擬聚乳酸降解終產(chǎn)物對(duì)微環(huán)境的影響,用含不同濃度乳酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠成骨樣細(xì)胞,觀察乳酸對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響,并檢測(cè)與成骨密切相關(guān)的I型膠原、堿性磷酸酶和骨鈣素的分泌量和礦化鈣結(jié)節(jié)形成情況,在分子水平探討了細(xì)胞堿性磷酸酶mRNA表達(dá)情況,探討聚乳酸降解終產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞成骨礦化的影響機(jī)理,為聚乳酸骨支架的精確設(shè)計(jì)與體內(nèi)應(yīng)用提供參考意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和主要設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為大鼠成骨樣細(xì)胞Ros17/2.8,購(gòu)自四川大學(xué)華西醫(yī)院;左旋乳酸溶液(L-LA)購(gòu)自美國(guó)Alfa Aesar公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibico公司;青霉素、鏈霉素購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶公司;小牛血清購(gòu)自中國(guó)北京圣馬元亨生物制品研究所;ALP試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京柏定試劑公司;TRIZOL購(gòu)自美國(guó)Molecular Research Center INC;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR master mix購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司;I型膠原和骨鈣素ELISA試劑盒品牌為Novus Biologicals,購(gòu)自美國(guó)Bio-Techne公司。

MCO-18AIC型細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自日本SANYO公司;IX51熒光倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司;實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司;DNM-9606型酶標(biāo)儀購(gòu)自中國(guó)北京普朗公司;7300型Real time PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司;VAPRO5520型露點(diǎn)滲透壓儀購(gòu)自美國(guó)Wescor公司。

1.2 方法

1.2.1含乳酸培養(yǎng)基的制備:分別配制乳酸濃度為8、16、22、27 mmol/L的培養(yǎng)基,將不含乳酸的培養(yǎng)基作為對(duì)照組,利用pH計(jì)和滲透壓儀檢測(cè)培養(yǎng)基的pH和滲透壓。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)觀察:將細(xì)胞以4×104個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔200 μL,細(xì)胞培養(yǎng)箱溫度為37 ℃,保持5 % CO2和飽和濕度,培養(yǎng)24 h后,吸去舊液,加入含乳酸培養(yǎng)基(8、16、22、27 mmol/L),不含乳酸培養(yǎng)基為對(duì)照組,培養(yǎng)3 d后,利用倒置顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.2.3ALP活性檢測(cè):通過(guò)ALP試劑盒測(cè)定細(xì)胞ALP活性。按照1.2.2方法接種細(xì)胞,培養(yǎng)3 d后,吸去培養(yǎng)基,加入200 μL細(xì)胞裂解液0.1 % Triton X-100,放置過(guò)夜后,利用超聲破碎細(xì)胞,測(cè)定細(xì)胞ALP活性。

1.2.4ELISA法檢測(cè)I型膠原和骨鈣素含量:通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞I型膠原和骨鈣素含量。按照1.2.2方法接種細(xì)胞,培養(yǎng)3 d后,按照使用說(shuō)明測(cè)定I型膠原含量;每3天換一次液,培養(yǎng)7 d后,按照使用說(shuō)明測(cè)定骨鈣素含量。

1.2.5細(xì)胞礦化鈣結(jié)節(jié)檢測(cè):將細(xì)胞以105個(gè)/mL的密度接種于24孔板內(nèi),培養(yǎng)24 h后,吸去舊液,加入含乳酸培養(yǎng)基(8、16、22、27 mmol/L),將不含乳酸培養(yǎng)基為對(duì)照組,培養(yǎng)3 d后,采用含礦化誘導(dǎo)液(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/LL-抗壞血酸)的正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)21 d。期間每3天換一次正常培養(yǎng)基,吸棄舊液,加入鹽酸四環(huán)素濃度為100 μg/mL的正常培養(yǎng)基,培養(yǎng)30 min后,PBS清洗兩遍,倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。利用Image Pro Plus 6.0軟件,計(jì)算所生成的鈣結(jié)節(jié)面積占總面積的百分比來(lái)進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)定量分析,得到鈣結(jié)節(jié)陽(yáng)性面積比。

1.2.6實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)ALP mRNA表達(dá):將細(xì)胞以105個(gè)/mL的密度接種于6孔板內(nèi),培養(yǎng)24 h后,吸去舊液,加入含乳酸培養(yǎng)基(8、16、22、27 mmol/L),將不含乳酸培養(yǎng)基為對(duì)照組,培養(yǎng)3 d后,裂解細(xì)胞,提取總RNA,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性檢測(cè)并測(cè)定濃度,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后利用實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增目的基因,具體步驟如下:(1)樣本稀釋:每個(gè)標(biāo)本取4 μL于200 μL無(wú)菌EP管中,然后加入16 μL無(wú)菌H2O稀釋,充分混勻,于冰浴中按每管6 μL分裝于PCR 8連管中備用;(2)實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系的配制:預(yù)混實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)液,其中H2O 4.7 μL,PCR master mix 12.5 μL,上下游引物及探針各0.6 μL,充分混勻后,分裝于含cDNA模板的PCR管中。離心后,轉(zhuǎn)移至實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀中;(3)反應(yīng)條件設(shè)置為:① 94 ℃ 2 min;② 94 ℃ 20 sec,50 ℃～60 ℃(依據(jù)引物的Tm值可變)30 sec,60 ℃ 40 sec,45個(gè)循環(huán);于60 ℃ 40 sec時(shí)采集熒光。其中,ACTB復(fù)性溫度為53 ℃;ALP復(fù)性溫度為54 ℃;反應(yīng)結(jié)束后,分析擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線,確定樣品Ct值,并換算成相對(duì)于內(nèi)參照基因的相對(duì)表達(dá)量。采用REST軟件對(duì)所獲得的Ct進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)各基因的引物和探針,見(jiàn)表1。

表1 各基因的引物與探針序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較通過(guò)單因素方差分析,檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 乳酸對(duì)培養(yǎng)基pH和滲透壓的影響

如表2所示,與對(duì)照組(不含乳酸培養(yǎng)基)相比,含乳酸培養(yǎng)基的pH隨乳酸濃度增加而降低,滲透壓升高。

表2 不同培養(yǎng)基的pH值和滲透壓

2.2 乳酸對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

不同培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞3 d后,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,少量圓形,平行排列或呈漩渦狀,細(xì)胞鋪滿了基底,如圖2A所示。隨著培養(yǎng)基中乳酸濃度增加,細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變,長(zhǎng)梭形細(xì)胞減少,圓形細(xì)胞數(shù)量增加,同時(shí)細(xì)胞數(shù)量減少,如圖2B～圖2E所示,當(dāng)乳酸濃度增加至27 mmol/L時(shí),細(xì)胞收縮變形,觀察到少量長(zhǎng)梭形細(xì)胞,排列不規(guī)則,數(shù)量明顯減少。

圖1 不同培養(yǎng)基中成骨樣細(xì)胞的形態(tài)

圖2 乳酸對(duì)細(xì)胞分泌I型膠原、堿性磷酸酶、骨鈣素的影響

2.3 乳酸對(duì)細(xì)胞成骨表型的影響

培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞3 d后,利用ELISA法測(cè)定I型膠原含量,如圖3A所示,與對(duì)照組相比,低濃度乳酸組(8、16 mmol/L)的I型膠原量都顯著高于對(duì)照組,其余組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異;培養(yǎng)3 d后,檢測(cè)細(xì)胞堿性磷酸酶活性,如圖3B所示,與對(duì)照組相比,16、22、27 mmol/L組ALP活性隨乳酸干預(yù)濃度的增加呈濃度依賴性下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)乳酸濃度為16、22、27 mmol/L時(shí),細(xì)胞ALP活性分別為對(duì)照組的59.4%(P<0.05)、34.7%(P<0.01)和22.4%(P<0.01);培養(yǎng)7 d后,通過(guò)ELISA法測(cè)定骨鈣素含量,如圖3C所示,含乳酸組的骨鈣素量與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同培養(yǎng)基中所形成的鈣結(jié)節(jié)

2.4 乳酸對(duì)礦化鈣結(jié)節(jié)的影響

細(xì)胞在體外條件下經(jīng)增殖期、分泌期和礦化期,最終以鈣結(jié)節(jié)的形式生成鈣鹽沉積,經(jīng)四環(huán)素染色后呈現(xiàn)黃色熒光[14-16]。如圖3A～圖3E所示,對(duì)照組中鈣結(jié)節(jié)數(shù)量多,體積大,是由大量細(xì)胞堆積生成,與對(duì)照組相比,含乳酸組中所形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量少,體積較小。隨著乳酸濃度增加,鈣結(jié)節(jié)數(shù)量減少。當(dāng)乳酸濃度為27 mmol/L時(shí),完全沒(méi)有鈣結(jié)節(jié)生成。通過(guò)定量分析(圖3F),與對(duì)照組相比,16、22、27 mmol/L組鈣結(jié)節(jié)陽(yáng)性面積隨著乳酸干預(yù)濃度的增加呈濃度依賴性下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 乳酸對(duì)堿性磷酸酶mRNA表達(dá)的影響

培養(yǎng)3 d后,測(cè)定細(xì)胞ALP mRNA的相對(duì)表達(dá)量。利用動(dòng)力學(xué)曲線讀取Ct值,通過(guò)REST軟件確定ALP相對(duì)表達(dá)量。如表3所示,當(dāng)乳酸濃度為8 mmol/L時(shí),ALP mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的0.594,當(dāng)乳酸濃度為16 mmol/L時(shí),ALP mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的0.104(P<0.01),顯著低于對(duì)照組。

表3 不同培養(yǎng)基中細(xì)胞ALP mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

意外事故、運(yùn)動(dòng)損傷和骨科疾病通常會(huì)導(dǎo)致骨缺損[17-18]。人體骨具有一定的自愈能力,但通常情況下都需要植入骨組織工程支架來(lái)實(shí)現(xiàn)骨修復(fù)或重建[19-20]。然而患者常在聚乳酸支架植入處出現(xiàn)不良反應(yīng),主要因?yàn)榫廴樗峤到饨K產(chǎn)物乳酸引起骨組織生理環(huán)境改變,影響細(xì)胞正常功能,導(dǎo)致骨組織處炎癥和病變[5-6]。

本研究將不同濃度乳酸加入培養(yǎng)基來(lái)模擬聚乳酸降解終產(chǎn)物對(duì)微環(huán)境的影響,結(jié)果表明,對(duì)照組pH為7.2～7.4之間,滲透壓為(318.7±1.5)mOsm/kg,此時(shí)酸度和滲透壓與體內(nèi)生理環(huán)境條件接近,能夠滿足細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖要求[21]。當(dāng)加入乳酸后,培養(yǎng)基的pH和滲透壓改變,微環(huán)境改變會(huì)影響細(xì)胞的正常功能,尤其當(dāng)pH低于6.8時(shí),明顯觀察到細(xì)胞形態(tài)收縮,細(xì)胞間雜質(zhì)增多,可能是低pH引起的酸中毒影響細(xì)胞的代謝活動(dòng)。另外,高滲透壓也會(huì)引起細(xì)胞皺縮。此外,還研究了乳酸對(duì)細(xì)胞成骨分化標(biāo)志物的影響,主要有早期分化標(biāo)志物I型膠原和堿性磷酸酶,晚期分化標(biāo)志物-骨鈣素[22-23]。結(jié)果表明,低濃度乳酸(8、16 mmol/L)對(duì)細(xì)胞分泌I型膠原有一定的促進(jìn)作用,顯著高于對(duì)照組。有研究表明乳酸和乙醇酸處理的成骨細(xì)胞更傾向于成為晚期成骨細(xì)胞,乳酸對(duì)于細(xì)胞分泌I型膠原具有促進(jìn)作用,因此低濃度乳酸對(duì)細(xì)胞分泌I型膠原具有促進(jìn)作用,筆者推測(cè)當(dāng)乳酸濃度增大時(shí),對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng),細(xì)胞數(shù)量減少,使得細(xì)胞分泌I型膠原總量減少[24]。乳酸濃度到達(dá)某一濃度時(shí),其對(duì)細(xì)胞分泌I型膠原的促進(jìn)與對(duì)細(xì)胞增殖的抑制共同作用下,高濃度的乳酸沒(méi)有體現(xiàn)出促進(jìn)作用。乳酸會(huì)抑制細(xì)胞堿性磷酸酶活性,并且隨乳酸濃度增大,抑制作用增強(qiáng),該結(jié)果與以前的報(bào)道基本一致,可能是因?yàn)樗嵝詶l件下細(xì)胞的基質(zhì)Gla蛋白(一種礦化抑制劑)上調(diào)而導(dǎo)致堿性磷酸酶活性降低[24]。骨鈣素是由成熟成骨細(xì)胞分泌一種非膠原蛋白,通過(guò)特異性吸附鈣,在成骨晚期能夠促進(jìn)形成鈣結(jié)節(jié)[25],乳酸對(duì)細(xì)胞骨鈣素的分泌沒(méi)有抑制作用,如圖3C所示。

成骨細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化,形成礦化鈣結(jié)節(jié),最終完成骨礦化過(guò)程[26]。如圖3所示,乳酸會(huì)抑制細(xì)胞的成骨礦化能力。成骨細(xì)胞的礦化過(guò)程十分復(fù)雜,多種調(diào)節(jié)因子都會(huì)對(duì)細(xì)胞的礦化過(guò)程發(fā)揮作用[27],根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3),乳酸通過(guò)抑制細(xì)胞堿性磷酸酶活性,從而影響成骨礦化能力。此外,細(xì)胞形態(tài)改變和數(shù)量減少,也會(huì)影響細(xì)胞的成骨礦化能力。堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞早期成熟的主要標(biāo)志物,其通過(guò)水解磷酸酯,提高磷酸根濃度,從而啟動(dòng)鈣化過(guò)程[28],因此在分子水平上,筆者進(jìn)一步研究了乳酸對(duì)于細(xì)胞ALP mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明,隨著乳酸濃度增加,細(xì)胞ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量降低,乳酸抑制細(xì)胞堿性磷酸酶mRNA表達(dá),這與堿性磷酸酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(圖3B)。

聚乳酸植入物降解引起無(wú)菌性炎癥或骨溶解,研究表明,聚乳酸降解終產(chǎn)物乳酸是引起上述癥狀的原因之一[7-12]。已有研究關(guān)注乳酸對(duì)成骨細(xì)胞成骨功能的影響,但乳酸影響成骨細(xì)胞礦化的機(jī)理還不明確。本研究探討了乳酸對(duì)微環(huán)境的影響,重點(diǎn)研究乳酸對(duì)于成骨樣細(xì)胞生長(zhǎng)和成骨表型標(biāo)志物的影響,在分子水平上進(jìn)一步研究了乳酸對(duì)堿性磷酸酶mRNA表達(dá)的影響。聚乳酸降解終產(chǎn)物乳酸可抑制細(xì)胞ALP mRNA的表達(dá),降低ALP活性,隨著乳酸濃度增大,乳酸抑制作用增強(qiáng),最終降低細(xì)胞的成骨礦化能力。此外,乳酸并不會(huì)抑制細(xì)胞分泌I型膠原和骨鈣素,細(xì)胞形態(tài)改變和數(shù)量減少也可能會(huì)影響細(xì)胞的成骨礦化能力。

聚乳酸一直被認(rèn)為具有良好的生物相容性和生物可降解性,然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,其作為骨組織工程支架需要面對(duì)諸多問(wèn)題:如何控制其降解速度,使得降解產(chǎn)生的乳酸濃度控制在安全的濃度范圍內(nèi),減少乳酸對(duì)微環(huán)境的影響;能否通過(guò)制備聚乳酸復(fù)合支架來(lái)避免乳酸對(duì)細(xì)胞堿性磷酸酶活性的不良影響,保持成骨細(xì)胞的成骨礦化能力。但總的來(lái)說(shuō),本研究結(jié)果仍然能夠?yàn)榫廴樗峁墙M織工程支架的設(shè)計(jì)提供一定的參考意義。