姜黃素對高糖環(huán)境下大鼠腎小管上皮細胞凋亡影響

李 鈺,包佩玲,謝 賽,虞典元,李 丹,馮愛橋

(1. 武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院,湖北 孝感 432000;2. 武漢科技大學醫(yī)學院,湖北 武漢 430000)

糖尿病是一種代謝性疾病,糖尿病腎病是糖尿病微血管病引起的常見并發(fā)癥,是糖尿病患者死亡和殘疾的主要原因之一[1]。流行病學研究顯示,全世界約有40%的糖尿病患者會發(fā)展為糖尿病腎病,糖尿病腎病已成為慢性腎臟病的主要病因[2]。既往研究認為糖尿病腎病主要是腎小球疾病,然而越來越多的證據表明高糖環(huán)境下腎小管的損傷是導致腎間質纖維化的主要原因,抑制腎小管上皮細胞凋亡可以減輕蛋白尿,改善腎功能[3]。因此,可以把抑制腎小管上皮細胞凋亡作為治療糖尿病腎病的有效靶點。 姜黃素具有廣泛的生物活性,其能作用于多種信號通路,可降低血糖,改善胰島細胞功能及炎癥和氧化應激等造成的器官損傷[4],但姜黃素對高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞凋亡是否有影響,目前相關研究較少。本研究探討了姜黃素對高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞凋亡的影響及其可能作用機制。

1 實驗材料和方法

1.1材料 大鼠近端腎小管上皮細胞株(NRK-52E,購于上海中科院細胞庫),姜黃素(Sigma公司),兔抗鼠Bcl單克隆抗體、兔抗鼠Bax單克隆抗體、山羊抗兔IgG 標記二抗(中杉金橋),彩色預染Marker(NEB),胎牛血清(Gibco公司),PCR引物及核苷酸序列(北京本元正陽基因技術有限公司),Annexin V/PI染液(BD公司)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與傳代 將大鼠近端腎小管上皮細胞株移入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基,置于含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育,傳代前先吸去上清液,用PBS洗培養(yǎng)板3次,用0.25%胰酶消化細胞,加入新的培養(yǎng)液,移液槍吹打細胞,使其懸浮,將細胞移至離心管,1 000 r/min離心5 min,移去上清,在沉淀物中加入新的培養(yǎng)液,更換新的培養(yǎng)板,顯微鏡下觀察細胞,放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每2～3 d傳代1次。

1.2.2細胞凍存和復蘇 取對數生長期的腎小管上皮細胞,倒出培養(yǎng)器皿內的培養(yǎng)基,用PBS洗滌細胞,加入0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞,再將細胞移入15 mL離心管中,于水平離心機上1 000 r/min離心5 min,倒掉胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)基,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,調節(jié)凍存液中細胞的終密度為(5～10)×106/mL。細胞復蘇時,于4 ℃中平衡30 min,-20 ℃放置2 h,移入-70 ℃放置過夜,次日轉入液氮中凍存。細胞復蘇時將凍存管取出,迅速放入37 ℃水浴,不斷晃動,保證快速完全解凍。移取細胞懸液至預先加入了培養(yǎng)基的離心管中,水平離心機1 000 r/min離心1 min,小心倒掉上清,加入培養(yǎng)基,輕柔吹吸幾次重懸細胞,接種至培養(yǎng)瓶,置于含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育。

1.2.3細胞分組及干預 取對數生長期的腎小管上皮細胞,實驗分為4組:對照組采用含5.5 mmol/L的D-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng),高糖組采用含30 mmol/L的D-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng),姜黃素低劑量組采用含30 mmol/L的D-葡萄糖和5 μmol/L姜黃素的培養(yǎng)基培養(yǎng),姜黃素高劑量組采用含30 mmol/L的D-葡萄糖和10 μmol/L姜黃素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3檢測指標及方法

1.3.1細胞凋亡檢測 細胞培養(yǎng)48 h后,收集細胞,500～1 000 r/min離心5 min,棄去培養(yǎng)液,用PBS緩沖液洗滌細胞1次,再次500～1 000 r/min離心5 min,棄去PBS,調節(jié)細胞濃度為(1～5)×106/mL,加入預冷的70%乙醇4 ℃固定1 h。棄去固定液,PBS重懸細胞5 min,用400目的篩網過濾細胞1次,500～1 000 r/min離心5 min。流式細胞儀激發(fā)光波長488 nm,用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光,另一波長大于560 nm的濾器檢測PI,計算凋亡率。

1.3.2細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達情況 采用Western blot法檢測:用細胞裂解液提取細胞中的總蛋白,用BCA試劑盒測定樣品中蛋白質含量,蛋白樣品與上樣緩沖液Buffer按照1∶5的比例充分混勻,100 ℃煮沸變性8～10 min。取15 μg樣品于SDS-PAGE進行電泳并轉至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉+TBST室溫封閉2 h,滴加一抗(Bax 1∶2000,Bcl-21∶5 000),4 ℃孵育過夜后滴加二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h,ECL發(fā)光液孵育,膠片曝光,顯影定影后用ImageScanner Ⅲ掃描儀獲取圖像,采用Quantity One圖像分析軟件進行半定量分析。

1.3.3細胞中Bax、Bcl-2 mRNA表達情況 收集細胞,提取細胞總RNA,利用primscriprt試劑盒進行單鏈cDNA合成,利用CFX96 (BIO-RAD)儀器進行實時定量RT-PCR,并在96孔板上進行單獨的PCRs。引物序列:Bax上游引物為5’-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC -3’,下游引物為5’-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3’;Bcl-2上游引物為5’-GGATGCCTTTGTGGAACTGC-3’,下游引物為5’-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3’;β-actin上游引物為5’-CACACCTTCTACAATGAGCTG-3’,下游引物為5’-GTCTCAAACATGATCTGGGTC-3’。PCR條件:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s、 58 ℃退火15 s,循環(huán)40次,在每個循環(huán)結束后,在58 ℃測量熒光值。應用2-△△CT方法計算Bax、Bcl-2 mRNA相對表達量。

1.4統計學方法 采用SPSS 21.0進行統計學分析,各組計量數據比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況 高糖組腎小管上皮細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05);姜黃素低、高劑量組細胞凋亡率均明顯低于高糖組(P均<0.05),且姜黃素高劑量組明顯低于姜黃素低劑量組(P<0.05)。見圖1。

圖1 對照組和高糖環(huán)境下各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況

2.2各組大鼠腎小管上皮細胞中Bax及Bcl-2蛋白表達情況 與對照組比較,高糖組大鼠腎小管上皮細胞中Bax蛋白相對表達量明顯增高(P<0.05),Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05);姜黃素低、高劑量組大鼠腎小管上皮細胞中Bax蛋白相對表達量均明顯低于高糖組(P均<0.05),Bcl-2蛋白相對表達量均明顯高于高糖組(P均<0.05),且姜黃素高劑量組Bax蛋白相對表達量明顯低于姜黃素低劑量組(P<0.05),Bcl-2蛋白相對表達量明顯高于姜黃素低劑量組(P<0.05)。見圖2。

圖2 對照組和高糖環(huán)境下各組大鼠腎小管上皮細胞中Bax及Bcl-2蛋白表達情況

2.3各組大鼠腎小管上皮細胞中Bax及Bcl-2 mRNA表達情況 與對照組比較,高糖組大鼠腎小管上皮細胞中Bax mRNA相對表達量明顯增高(P<0.05),Bcl-2 mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05);姜黃素低、高劑量組大鼠腎小管上皮細胞中Bax mRNA相對表達量均明顯低于高糖組(P均<0.05),Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯高于高糖組(P均<0.05),且姜黃素高劑量組Bax mRNA相對表達量明顯低于姜黃素低劑量組(P<0.05),Bcl-2 mRNA相對表達量明顯高于姜黃素低劑量組(P<0.05)。見圖3。

圖3 對照組和高糖環(huán)境下各組大鼠腎小管上皮細胞中Bax及Bcl-2 mRNA表達情況

3 討 論

腎小管間質占腎臟體積的90%以上,在糖尿病發(fā)生發(fā)展的過程中,高血糖水平、TGF-β、糖基化終末產物、ROS等因素均可導致腎小管損傷,損傷的腎小管上皮細胞表現為細胞增殖、凋亡、自噬和內皮-間充質轉分化[5]。腎小管上皮細胞損傷后釋放多種炎癥因子和細胞因子,引起炎性細胞浸潤,使細胞外基質沉積,間質纖維化,最終導致腎功能的惡化。高血糖狀態(tài)促進腎小管上皮細胞凋亡是腎臟纖維化的主要原因,而進行性腎間質纖維化是糖尿病腎病的一個重要特征,也是導致慢性腎病及終末期腎臟病的重要因素[6-8]。新的研究表明,近端腎小管病變可能早于腎小球病發(fā)生,腎小管損傷標志物預測糖尿病腎病進展的價值優(yōu)于腎小球病理學指標[9]。目前研究認為多種細胞因子及信號通路參與了高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的過程,如PI3K-Akt通路可與p38-MAPK通路共同介導腎小管上皮細胞凋亡,TGF-β、NF-κB、SAPK/JNK、AMPK等均可調節(jié)細胞的凋亡[10],各種觸發(fā)細胞凋亡的因素均能觸發(fā)腎小管上皮細胞凋亡。

姜黃素是從姜黃屬中藥姜黃、郁金、莪術等的塊莖中提取出來的一種酚性色素,具有降脂、抗氧化、抗纖維化、抗氧化應激、降血糖、保護血管內皮功能等作用,在糖尿病腎病、急性腎損傷、慢性腎衰竭、藥物性腎損害以及難治性狼瘡性腎炎等疾病中均具有腎臟保護作用,且不良反應很小,具有重要的藥用前景,是潛在治療藥物[11-12]。實驗研究顯示,姜黃素可改善糖尿病腎病大鼠的腎小球增大、基底膜節(jié)段性增厚,減輕腎組織氧化應激損傷[13];可抑制2型糖尿病大鼠海馬細胞凋亡,對抗糖尿病引起的海馬神經變性[14];可以通過下調Fas、Caspase-3蛋白表達而抑制心肌梗死大鼠的心肌細胞凋亡[15],還可以通過調控Bax和Bcl-2蛋白的表達抑制順鉑導致的腎小管上皮細胞凋亡[16]。在缺血再灌注大鼠動物模型中,姜黃素也有抑制腎小管上皮細胞凋亡的作用[17]。Zhang等[18]報道,姜黃素可通過調節(jié)Beclin1/UVRAG/Bcl2 抑制糖尿病腎病中的足細胞凋亡,加速細胞自噬。

本實驗中觀察到高糖處理可引起腎小管上皮細胞凋亡增加,促凋亡蛋白Bax蛋白及mRNA表達增加,抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白及mRNA表達降低,說明高糖可以誘導腎小管上皮細胞凋亡;給予姜黃素干預后,腎小管上皮細胞凋亡減少,Bax蛋白及mRNA表達降低,Bcl-2蛋白及mRNA表達增加,且高劑量姜黃素作用更明顯,說明姜黃素可以抑制高糖環(huán)境下大鼠腎小管上皮細胞凋亡。姜黃素抗凋亡的機制可能與激活凋亡抑制基因、阻斷細胞凋亡的執(zhí)行等有關,但腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡的機制很復雜,姜黃素可能的作用機制還需要深入探討。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。