思膚安營養(yǎng)修護仿生膏對痤瘡大鼠皮損及IGF-1/PI3K/Akt信號通路的影響

張旭冉,梁 嬪,蔣 思,鄭楷平,劉 琴

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院,湖北 武漢 430071)

痤瘡是一種常見的累及毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病,表現(xiàn)為粉刺、丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)、囊腫等多形性炎癥性皮損,預(yù)后可遺留萎縮或增生性瘢痕,對患者情緒、社交、工作等影響巨大。近年來多項研究表明皮脂的定量和定性變化是所有痤瘡發(fā)病特征的初始改變,皮脂的成分及比例變化與痤瘡發(fā)病密切相關(guān)[1-5]。思膚安營養(yǎng)修護仿生膏為自主研發(fā)的一款仿生護理膏,它模擬了人類健康皮脂組分,由20%亞麻酸、60%亞油酸和2%卵磷脂組成。臨床實踐中發(fā)現(xiàn)使用思膚安營養(yǎng)修護仿生膏可以緩解痤瘡患者面部炎癥及非炎癥皮損,且患者耐受性良好[6],但其調(diào)節(jié)脂質(zhì)及治療痤瘡的機制仍需進一步研究。本實驗觀察了思膚安營養(yǎng)修護仿生膏對痤瘡大鼠皮損的影響,并基于胰島素樣生長因子1(IGF-1)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路探討了其可能的治療機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 18只SPF級雄性SD大鼠,鼠齡28 d,體重(130±20)g,購自湖北貝恩特生物科技有限公司,動物使用合格證號:SCXK(鄂)2021-0027。大鼠飼養(yǎng)于武漢大學(xué)中南醫(yī)院SPF級動物實驗中心,在統(tǒng)一飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)下喂養(yǎng),飲用水、飼料、籠盒及墊料均經(jīng)過高溫高壓滅菌處理,飼料、墊料等物品均由武漢大學(xué)中南醫(yī)院實驗動物中心提供。實驗經(jīng)武漢大學(xué)中南醫(yī)院動物倫理委員會同意(倫理批準(zhǔn)編號:ZN2022043)。

1.2實驗耗材與儀器 痤瘡丙酸桿菌菌液(編號:330605)、哥倫比亞血平板(北納公司),思膚安營養(yǎng)修護仿生膏(武漢市陽邏經(jīng)濟開發(fā)區(qū)陽邏港華中國際),阿達(dá)帕林凝膠(黑龍江福和制藥集團股份有限公司),SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、RIPA總蛋白裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、100xPMSF、磷酸化蛋白酶抑制劑、5x蛋白上樣緩沖液、麗春紅染液、TBS(粉劑)、電泳液(粉劑)、轉(zhuǎn)膜液(粉劑)、IGF-1抗體(ABclonal,A0303)、PI3K抗體(三鷹,60225-1-Ig)、Akt抗體(三鷹,10176-2-AP)、SREBP-1抗體(SC-13551)、抗體洗脫液、顯影定影液、Tween-20、脫脂奶粉均購自武漢佰仟度生物科技有限公司,Protease Inhibitor Cocktail(ROCHE)、蛋白Marker(Thermo)、0.45 μm PVDF膜(Millipore)、柯達(dá)醫(yī)用X射線膠片、免疫組化染色超敏試劑盒、DAB顯色試劑、PBS緩沖液購于Affinity Biosciences,正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯,型號:BX53),全自動數(shù)字玻片掃描與分析系統(tǒng)(德國徠卡,型號:Aperio VERSA 8),暗匣(廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司),掃描儀L4158(EPSON),臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠),冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司),制冰機(常熟市雪科電器有限公司),脫色搖床(北京市六一儀器廠)。

1.3實驗方法 分別在大鼠背部左上、左下、右上、右下選取4處1.5 cm×1.5 cm大小正方形區(qū)域,每個區(qū)域皮內(nèi)點狀均勻注射100 μL痤瘡丙酸桿菌懸液(8×107CFU/mL),連續(xù)7 d,建立痤瘡模型。造模成功后,用水性筆在尾巴根部標(biāo)記上1～18的數(shù)字,按隨機數(shù)字法將其分為對照組、阿達(dá)帕林組及思膚安組,每組6只。對照組、阿達(dá)帕林組及思膚安組每日17:00分別于皮損處涂抹生理鹽水、阿達(dá)帕林凝膠、思膚安營養(yǎng)修護仿生膏1次,連續(xù)干預(yù)4周。

1.4檢測指標(biāo)及方法 分別于干預(yù)2周及4周后觀察皮損情況,取大鼠皮損組織行相關(guān)檢測。

1.4.1皮損組織病理形態(tài) 切取大鼠背部皮損處組織,每塊長約0.5 cm×0.5 cm,進行固定脫水,制作石蠟包塊,切片后進行HE染色,20倍視野顯微鏡下觀察皮損組織病理形態(tài)。

1.4.2皮損組織尼羅河紅熒光染色及皮損脂質(zhì)百分比 冰凍切片,固定液固定10 min,蒸餾水洗3次,每次3 min,加入尼羅河紅染色液染色5～10 min,洗滌。用365 nm波長激發(fā),細(xì)胞核為藍(lán)色,脂滴為紅色。50倍顯微鏡下取5個不重疊的視野,使用Image J軟件計數(shù)5個單位視野內(nèi)脂滴數(shù)量,計數(shù)取平均值。

1.4.3皮損組織中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1表達(dá)情況 分別采用Western blot法檢測和免疫組化法觀察。

1.4.3.1Western blot檢測方法 取皮損組織塊,用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2～3次,去除血污,剪成小塊置于高速低溫研磨儀專用離心管中,加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑),高速研磨。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中,振蕩,冰浴裂解30 min,期間用移液器反復(fù)吹打,確保勻漿液完全裂解。4 ℃下13 000×g離心5 min,收集上清,即為總蛋白溶液,BCA法檢測蛋白濃度。按濃縮膠50 V、分離膠120 V進行恒壓電泳,至溴酚藍(lán)到達(dá)膠板下沿。按100 V恒壓轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)目的蛋白分子量大小調(diào)整。將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫封閉1 h,除去封閉液,加入已稀釋好的一抗4 ℃過夜。回收已稀釋的一抗,用TBST洗3次,每次5 min。加入稀釋好的二抗,室溫孵育30 min,用TBST在室溫下?lián)u床上洗4次,每次5 min。根據(jù)不同的光強度調(diào)整曝光條件,顯影、定影。將膠片掃描存檔,IPWIN60軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.4.3.2免疫組化染色觀察方法 取大鼠皮損組織并制備石蠟切片,脫蠟,水化,3%過氧化氫浸泡5 min,PBS緩沖液浸泡2 min。使用IGF-1、PI3K、SREBP-1、Akt抗體,根據(jù)一抗說明書選擇合適的修復(fù)方式進行抗原修復(fù),一抗孵育,復(fù)溫,二抗孵育,顯色,復(fù)染,脫水,透明,封片。40倍顯微鏡下采集5個視野的圖片。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 使用EXCEL整理記錄實驗數(shù)據(jù),應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。計量資料組間比較采用單因素方差分析,如果組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義,進一步采用LSD方法進行兩兩比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠背部皮損大體情況 造模第7天,各組大鼠造模部位皮損基本一致,造模部位均有大量丘疹、膿皰、粉刺、破潰、結(jié)痂等皮損,皮損基底皮膚呈暗紅色,無明顯滲液。干預(yù)2周后,各組大鼠背部皮損處紅腫、丘疹、結(jié)節(jié)較前均有好轉(zhuǎn),思膚安組、阿達(dá)帕林組背部皮損處結(jié)節(jié)、紅腫較對照組輕。干預(yù)4周后,對照組仍可見片狀紅斑、丘疹,思膚安組及阿達(dá)帕林組丘疹、結(jié)節(jié)基本消退,其中思膚安組皮損處皮膚更光滑、凹陷性瘢痕更少,毛發(fā)更多。見圖1。

圖1 各組痤瘡大鼠背部皮損大體情況

2.2各組大鼠皮損組織HE染色病理學(xué)形態(tài) 造模第7天,對照組痤瘡皮損處毛囊漏斗部擴張,大量角質(zhì)物堆積其中,毛囊壁及周圍組織內(nèi)伴大量以中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤。干預(yù)2周后,思膚安組及阿達(dá)帕林組毛漏斗內(nèi)角質(zhì)物、毛囊壁及周圍組織炎細(xì)胞浸潤均較對照組減少。干預(yù)4周后,思膚安組、阿達(dá)帕林組表皮各層結(jié)構(gòu)組織基本正常,分界清晰,炎性細(xì)胞浸潤更少。見圖2。

圖2 各組痤瘡大鼠背部皮損組織HE染色病理形態(tài) (×20)

2.3各組大鼠皮損組織尼羅河紅熒光染色及脂質(zhì)百分比 對照組干預(yù)2周及4周后脂質(zhì)百分比均明顯低于造模第7天(P均<0.05),但干預(yù)2周后與干預(yù)4周后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組干預(yù)2周后相比,阿達(dá)帕林組脂質(zhì)百分比明顯降低(P<0.05),思膚安組脂質(zhì)百分比明顯升高(P<0.05)。與對照組干預(yù)4周后相比,阿達(dá)帕林組及思膚安組脂質(zhì)百分比均明顯降低(P均<0.05),且阿達(dá)帕林組明顯低于思膚安組(P<0.05);思膚安組皮損脂質(zhì)百分比呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,干預(yù)4周后脂質(zhì)百分比與阿達(dá)帕林組干預(yù)2周后相當(dāng)(P>0.05)。見圖3及圖4。

圖3 各組痤瘡大鼠背部皮損組織尼羅河染色表現(xiàn)(×50)

圖4 各組痤瘡大鼠背部皮損組織尼羅河染色脂質(zhì)百分比

2.4各組大鼠皮損組織中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白表達(dá)情況 Western blot法檢測,干預(yù)2周、4周后阿達(dá)帕林組和思膚安組皮損組織中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白相對表達(dá)量均明顯低于對照組(P均<0.05),且思膚安組均明顯低于阿達(dá)帕林組(P均<0.05),見圖5。免疫組化觀察,干預(yù)2周、4周后思膚安組和阿達(dá)帕林組皮損組織中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白表達(dá)均較對照組明顯減少,見圖6。

圖6 免疫組化檢測各組痤瘡大鼠皮損組織中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白表達(dá)情況(×40)

3 討 論

越來越多的研究認(rèn)為痤瘡是一種皮脂腺代謝性疾病,脂質(zhì)代謝的紊亂貫穿了痤瘡發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)[7]。皮脂腺細(xì)胞可在有或無內(nèi)外誘因下產(chǎn)生促炎介質(zhì)和中性粒細(xì)胞趨化因子,而其分泌的皮脂所含有的部分游離脂肪酸又具有廣泛的抗菌活性,因此皮脂定量和定性的不同可表現(xiàn)出不同的促炎或抗炎特性。研究表明,皮脂成分的改變較皮脂分泌總量的升高在痤瘡的發(fā)生發(fā)展中具有更重要的作用[8]。痤瘡患者皮脂中角鯊烯水平升高,亞油酸水平降低;治療后,痤瘡患者皮脂中過氧化脂質(zhì)尤其是過氧化鯊烯的含量顯著降低,而高水平的亞油酸成分可減少粉刺的發(fā)生[8]。因此,脂質(zhì)組學(xué)在痤瘡發(fā)病和治療中的作用也受到了越來越多的關(guān)注。研究顯示,飲食Omega-3脂肪酸和(或)亞油酸可以輔助治療痤瘡[9-11],而膳食補充的有效成分作用于皮膚的功效是有限的,若能有藥物直接作用于皮膚、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,則治療效果將會更佳。

本研究中所使用的思膚安營養(yǎng)修護仿生膏正是基于此理念自主研發(fā)的一款仿生護理膏,由亞麻酸、亞油酸和卵磷脂組成。亞麻酸具有有效的5α-還原酶抑制作用和抗炎作用[12],亞油酸可下調(diào)中性粒細(xì)胞的氧代謝和吞噬作用[13],卵磷脂通過減少角質(zhì)層的水分損失和降低角質(zhì)細(xì)胞中脂褐素的含量來維護皮膚屏障功能[14]。本實驗以阿達(dá)帕林為陽性對照,探討了思膚安對痤瘡大鼠的干預(yù)效果及可能機制,結(jié)果顯示思膚安營養(yǎng)修護仿生膏及阿達(dá)帕林均可促進痤瘡皮損處結(jié)節(jié)、紅腫消退,干預(yù)4周后思膚安組大鼠造模處的皮膚較阿達(dá)帕林組更光滑、凹陷性瘢痕更少,毛發(fā)更多,皮膚屏障功能修復(fù)表現(xiàn)更佳。在脂質(zhì)調(diào)節(jié)方面,思膚安組皮損脂質(zhì)百分比呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,干預(yù) 4周時思膚安組抑制脂質(zhì)分泌的效果稍劣于阿達(dá)帕林組,與使用阿達(dá)帕林2周作用相當(dāng)。此結(jié)果和思膚安營養(yǎng)修護仿生膏本身性質(zhì)有關(guān),因該制劑模擬了皮脂組分,短期使用可能會造成外來脂質(zhì)的增加,而隨著其本身對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用,繼續(xù)使用則呈現(xiàn)脂質(zhì)下降的趨勢。此外,蛋白印跡及免疫組化結(jié)果均顯示思膚安組皮損組織中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白表達(dá)顯著減少,且減少較阿達(dá)帕林組更顯著。SREBP是一種調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪酸的主要轉(zhuǎn)錄因子,它在脂代謝的作用機制中至關(guān)重要,而IGF-1/PI3K/Akt通路是其主要的上游調(diào)控因子。因此推測思膚安營養(yǎng)修護仿生膏下調(diào)了IGF-1通路,隨后抑制PI3K/Akt通路,導(dǎo)致前體和成熟形式的SREBP-1減少,從而使得皮膚脂質(zhì)中的膽固醇和脂肪酸代謝降低而起到了治療作用。雖然未能進行大鼠皮損的脂質(zhì)分析,但推測思膚安營養(yǎng)修護仿生膏的脂質(zhì)調(diào)節(jié)作用導(dǎo)致的游離脂肪酸如棕櫚酸、亞油酸等濃度的變化也可以導(dǎo)致炎癥的減輕,從而發(fā)揮治療作用。

綜上所述,思膚安營養(yǎng)修護仿生膏可以有效改善大鼠痤瘡皮損,且有一定的脂質(zhì)調(diào)節(jié)作用,其治療痤瘡的機制可能與抑制IGF-1R/PI3K/Akt通路,從而下調(diào)SREBP-1的表達(dá)有關(guān)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。