橙皮苷干預(yù)心肌梗死進(jìn)展的機(jī)制研究

褚智君,張少華,任冬飛,謝 琪,周騰騰,張紅梅,吳香婷

(1. 唐山工人醫(yī)院,河北 唐山 063000;2. 河北省第八人民醫(yī)院,河北 石家莊 050011;3. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院,河北 石家莊 050011;4. 邯鄲市第一醫(yī)院,河北 邯鄲 056002)

心肌梗死是全球發(fā)病率和病死率較高的疾病之一,雖然近年來(lái)支架技術(shù)、手術(shù)技術(shù)、輔助藥物治療等先進(jìn)方法被廣泛用于心肌梗死的治療,然而患者的預(yù)后仍然較差[1-2]。目前研究認(rèn)為,在急性心肌梗死缺血再灌注期間及心肌梗死后的慢性重塑過(guò)程中,氧化應(yīng)激均會(huì)導(dǎo)致心肌損傷。線粒體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧是缺血再灌注損傷的特殊驅(qū)動(dòng)因素,包括誘導(dǎo)線粒體通透性改變或線粒體內(nèi)結(jié)構(gòu)和分子的氧化損傷[3]。自噬是一種吞噬自身不必要的和功能失調(diào)的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器和其他細(xì)胞成分的降解和再循環(huán)過(guò)程[4],其中線粒體蛋白的泛素化標(biāo)記受損的線粒體,以便通過(guò)線粒體自噬降解,而SQSTM1/p62參與線粒體自噬過(guò)程中線粒體蛋白的泛素化[5]。心肌細(xì)胞在缺氧條件下較早發(fā)生自噬,啟動(dòng)細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。另外心肌梗死后會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)烈的全身性和局部炎癥反應(yīng),炎性細(xì)胞數(shù)量隨著心肌缺血的進(jìn)展而動(dòng)態(tài)變化,炎癥標(biāo)志物如白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)在心肌梗死后表達(dá)增加[6]。橙皮苷為中藥陳皮中的活性成分,具有抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗炎、降膽固醇和降血糖等多種藥理作用[7-8]。本研究從線粒體自噬、氧化應(yīng)激及炎癥方面探究了橙皮苷預(yù)干預(yù)對(duì)心肌梗死小鼠的影響,以期為橙皮苷藥物的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠12只,雌雄各半,6～8周齡,體重20～22 g,購(gòu)自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司,許可證號(hào):SCXK(豫)2020-0005。在溫度20～24 ℃、濕度45%～55%、12 h光/暗循環(huán)的環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)。本研究所有涉及動(dòng)物的程序均按照NIH《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行,并得到河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院醫(yī)院審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2藥品及儀器、試劑 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)SND-1692購(gòu)自滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司,餓酸GP18456、醋酸雙氧鈾GZ02625和檸檬酸鉛GA10701購(gòu)自北京中鏡科儀技術(shù)有限公司,蘇木素染液DH0008、伊紅染液DH0045購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)Vevo F2購(gòu)自FUJIFILM VisualSonics公司,透射電子顯微鏡(TEM)H-7500購(gòu)自日本日立公司。RIPA裂解液(P0013K)和4%多聚甲醛固定液(P0099)購(gòu)自江蘇碧云天生物科技有限公司,BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒(PC0020)和2.5%戊二醛固定液(P1126)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,PVDF膜(IPVH20200)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。PINK抗體(ab135897)、Parkin抗體(ab77924)、p62抗體(ab109012)、NOX2抗體(ab129068)、NOX4抗體(ab154244)、IL-1β抗體(ab234437)和GAPDH抗體(ab8245)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,LC3-Ⅰ/Ⅱ抗體(ABC929)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將12只小鼠隨機(jī)分為模型組和橙皮苷組,每組6只。從實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始,橙皮苷組給予36 mg/kg橙皮苷(劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定)灌胃,模型組給予等體積無(wú)菌生理鹽水灌胃,均1次/d,連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)第8天,用2%異氟醚麻醉2組小鼠后對(duì)其進(jìn)行氣管插管和通氣,在左側(cè)第3、第4肋間隙通過(guò)開(kāi)胸術(shù)充分暴露心臟后,結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支造成心肌梗死,盡量快速關(guān)胸,縫合皮膚。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1超聲心動(dòng)圖 術(shù)前及心肌梗死造模后24 h使用2%異氟醚吸入麻醉2組小鼠,使用經(jīng)胸M型超聲心動(dòng)圖和動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)測(cè)定心功能,計(jì)算左心室縮短分?jǐn)?shù)(FS)和射血分?jǐn)?shù)(EF)。

1.4.2心肌組織病理形態(tài) 造模后24 h處死所有小鼠,取出心臟,用4%多聚甲醛溶液固定24 h,進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟等操作后,石蠟包埋并連續(xù)切成6 μm厚的切片,然后進(jìn)行蘇木素染液和伊紅染液染色,進(jìn)行梯度乙醇脫水,二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明,并使用中性樹(shù)膠封固,鏡下觀察。

1.4.3心肌組織、線粒體及自噬小體超微結(jié)構(gòu) 收集小鼠的心肌組織(冰上切成1 mm×1 mm×1 mm大小),使用2.5%戊二醛在4 ℃固定24 h、1%鋨酸在4 ℃固定1 h后,進(jìn)行梯度乙醇脫水,然后包埋在環(huán)氧樹(shù)脂中,超薄切片機(jī)切片(50 nm),隨后醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色,在透射電鏡下觀察心肌組織、線粒體及自噬小體超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.4.4線粒體自噬、活性氧及炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):取小鼠的心肌組織,放入低溫PBS中,冰上研磨,用胰酶反復(fù)消化2～3 min,終止消化后,取上清液,離心,放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用RIPA裂解液裂解提取蛋白質(zhì),使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白樣品(20 μg)上樣在預(yù)制的 SDS-PAGE 凝膠中,然后電泳分離,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,在室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h,然后與稀釋的一抗PINK抗體、Parkin抗體、p62抗體、LC3-Ⅰ/Ⅱ抗體、NOX2抗體、NOX4抗體、IL-1β抗體和GAPDH抗體在4°C孵育過(guò)夜,使用TBST洗滌后,將膜與辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h,TBST洗滌后,加入ECL發(fā)光液對(duì)蛋白進(jìn)行顯影。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組小鼠超聲心動(dòng)圖 造模前2組小鼠的FS和EF比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);造模后24 h,橙皮苷組小鼠的FS和EF均明顯高于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 模型組和橙皮苷組小鼠超聲心動(dòng)圖 FS和EF

2.22組小鼠心肌組織病理形態(tài) 模型組見(jiàn)左室透壁性壞死的心肌和纖維組織,心肌細(xì)胞排列紊亂,橫紋不整齊,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和明顯的均質(zhì)紅染;橙皮苷組見(jiàn)左室梗死區(qū)明顯減小,心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整,肌纖維排列基本整齊,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少。見(jiàn)圖2。

圖2 模型組和橙皮苷組小鼠心肌組織HE染色表現(xiàn)

2.32組小鼠心肌組織及線粒體超微結(jié)構(gòu) 模型組心肌細(xì)胞肌原纖維排列紊亂,肌絲斷裂,線粒體嵴消失較多,線粒體中出現(xiàn)大量空泡;橙皮苷組心肌細(xì)胞肌原纖維排列基本整齊,肌絲無(wú)明顯斷裂,線粒體嵴部分消失,線粒體中出現(xiàn)空泡較少。見(jiàn)圖3。

圖3 模型組和橙皮苷組小鼠心肌組織及線粒體超微結(jié)構(gòu)(×20000)

2.42組小鼠心肌組織自噬小體超微結(jié)構(gòu) 自噬小體出現(xiàn)在線粒體旁,橙皮苷組中的自噬小體數(shù)量明顯多于模型組(紅色箭頭示)。見(jiàn)圖4。

圖4 模型組和橙皮苷組小鼠心肌組織自噬小體超微結(jié)構(gòu)

2.52組小鼠心肌組織中線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況 橙皮苷組PINK、Parkin、p62和LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 模型組和橙皮苷組小鼠心肌組織中線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.62組小鼠心肌組織中活性氧及炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)情況 橙皮苷組NOX2、NOX4和IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 模型組和橙皮苷組小鼠心肌組織中活性氧及炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

心肌梗死導(dǎo)致心肌缺血和缺氧,從而誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生,活性氧介導(dǎo)的心肌梗死后心臟氧化應(yīng)激在促炎細(xì)胞因子釋放、心肌細(xì)胞凋亡和纖維化等心臟重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[9-10]?；钚匝蹩纱碳ぱ装Y因子的產(chǎn)生,炎癥因子反過(guò)來(lái)促進(jìn)活性氧的形成,導(dǎo)致缺血心肌的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大,導(dǎo)致心臟受損惡化[11-12]。目前研究表明,NADPH氧化酶NOX2或NOX4或線粒體是活性氧的主要來(lái)源,NOX和線粒體之間的相互作用被稱為“活性氧誘導(dǎo)的活性氧釋放”,被認(rèn)為是局部活性氧產(chǎn)生組織氧化還原信號(hào)的正前饋機(jī)制[13-14],生理情況下活性氧是參與細(xì)胞增殖、遷移、分化和基因表達(dá)等多種生物反應(yīng)的氧化還原信號(hào)的重要組成部分[15-16]。

線粒體選擇性自噬是線粒體損傷后線粒體質(zhì)量控制的一種機(jī)制。線粒體自噬在缺血再灌注損傷期間通過(guò)去除受損的線粒體并減輕其對(duì)心肌細(xì)胞的有害后果(包括氧化應(yīng)激)起到保護(hù)作用[17-18],線粒體自噬缺陷不能清除缺血再灌注損傷引起的受損線粒體,導(dǎo)致線粒體基因組崩潰、線粒體受損、心磷脂氧化、氧化應(yīng)激、mPTP打開(kāi),最終導(dǎo)致線粒體凋亡[19-20]。PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬缺乏可導(dǎo)致線粒體活性氧的產(chǎn)生,線粒體受損時(shí),PINK1在線粒體外膜聚集,泛素磷酸化后,胞質(zhì)E3泛素連接酶Parkin被大量激活,使各種線粒體內(nèi)蛋白泛素化,從而招募和激活更多的Parkin[21-23]。LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ是自噬小體形成的重要步驟,LC3-Ⅱ的豐度與自噬小體的數(shù)量相關(guān),自噬增加可減少炎癥因子如IL-1β等的表達(dá)[24]。盡管早期自噬是有益的,但不受調(diào)節(jié)和持續(xù)的自噬可能是有害的,并導(dǎo)致自噬細(xì)胞死亡。

本研究結(jié)果顯示,橙皮苷組小鼠的心功能、心肌組織受損情況輕于模型組,部分線粒體嵴消失,線粒體中空泡較少,自噬小體數(shù)量明顯多于模型組;心肌組織中PINK、Parkin、p62和LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量高于模型組,NOX2、NOX4和IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量低于模型組。說(shuō)明橙皮苷可抑制心肌梗死導(dǎo)致的心肌組織損傷,其可能通過(guò)促進(jìn)線粒體自噬、抑制炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為橙皮苷用于心肌梗死的治療提供了一定理論依據(jù),但其作用還有待深入研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。